בזריקות עגבניות-לקטינים הרחם Intra-לב בעוברי עכבר כדי לאמוד את זרימת דם בכליות

Summary

This manuscript describes a technique for visualization of the developing vasculature. Here we utilized in utero intra-cardiac FITC-labeled tomato lectin microinjections on mouse embryos. Using this technique, we delineate the perfused and unperfused vessels throughout the embryonic kidney.

Abstract

ההיווצרות וזלוף, יצירת כלי דם כליות (מלבד glomeruli) הם understudied מאוד. ככלי דם מתפתח באמצעות אנגיוגנזה (שהוא מתפצלים כלי גדולים) וvasculogenesis (היווצרות כלי דה נובו), טכניקות מיפוי זלוף כגון יציקות שרף, in vivo הדמיה אולטרסאונד, ומיקרו לנתיחה היו מוגבלות במפגינות יחסים האינטימיים בין שני תהליכים אלו ומבני כליות מתפתחים בתוך העובר. כאן, אנו מתארים את ההליך של בmicroinjections הרחם תוך-לב מודרך-אולטרסאונד FITC שכותרתו עגבניות לקטינים בעוברי עכבר כדי לאמוד את ontogeny של פרפוזיה. קטיני עגבניות (TL) היה perfused לאורך העובר והכליות שנקטפו. רקמות שיתוף מוכתמות עבור מבנים שונים בכליות כוללים: אבות נפרון, מבני נפרון, האפיתל ureteric, וכלי דם. החל מ E13.5 כלי קליבר גדולים היו perfused, ציוד היקפי ואולםכלי נשארו unperfused. על ידי E15.5 וE17.5, כלי היקפיים קטנים, כמו גם glomeruli התחילו להיות perfused. טכניקה ניסויית זה היא קריטי ללימוד התפקיד של כלי דם וזרימת דם במהלך התפתחות עוברית.

Introduction

במהלך התפתחות עוברית שני תהליכים נפרדים, עדיין בו-זמנית, כלי דם יתקיימו: אנגיוגנזה, התהליך שבו גדל כלי מכלי שיט, וvasculogenesis גדולים קיימים מראש, שהוא במערך דה נובו של כלי מאבות אנדותל מגורים ^1,2. בהתאמה, לשעבר הוא שם נרדף לזרימת דם, ואילו הוא חשב שהאחרון לקחת במידה רבה את המקום בהעדרו.

במקביל להיווצרות כלי דם, תהליך מחזורי ודינמי של סינתזת אב כליות תא, התפשטות, ובידול מתחיל להתפתח ביום עוברי 9.5 (E9.5). בשלב זה ניצן ureteric (UB) פולש dorsally למקיף mesenchyme metanephric (MM), וממשיך עד לידת ^3. חזר הסתעפות של UB למהירות עיבוי mesenchyme כובע metanephric מתחילה ההיווצרות של היחידות פונקציונליות של הכליות, נפרון. עם כל דור חדש של UB וnephרון, דורות מבוגרים הם עקורים לאזורים בקליפת המוח והלשדיים פנימיים, שבו הם לאחר מכן לעבור הבשלה והתמיינות נוספות בתוך סביבות בעיקר כלי דם צפופים. כפי שמעיד דרסלר et al. ^3, תהליך עוברי זה, מוגבר על ידי איתות אינדוקטיביים, כגון crosstalk בין UB וMM, ומספר עצום של גורמים תאיים ^3-6. שני גורמים שנחקרו לאחרונה תאיים בתוך לבלב הפיתוח וכליות כוללים מתח חמצן וזרימת דם ^7,8. האחרון יידון בפירוט בהמשך ביחס לפיתוח כליות.

על מנת לחשוף את התפקיד אינדוקטיביים שזרימת דם שעלול להיות משחקת בבידול אב נפרון תא, כמו גם בתהליכי organogenesis אחרים, שיטות מדויקות ומדויקות של זרימת דם מיפוי העוברי הוא הכרחי.

שיטות חלופיות של מדידת זרימת דם כוללות את המרשם של ulההדמיה trasound ושרף מטילים ^9,10. באופן חד משמעי, מצבים אלה הוכחו להיות מטבע חסר יכולתם לחשוף זמנית צירופים של זמן ומרחב בין זרימת דם וגזע התמיינות תאים. יציקות שרף, למשל, לספק מודל תקף של דפוסי כלי בתוך רקמות בוגרות, אולם בכלי בשלה, כמו עם נקודות זמן עובריים, כלים הם גס מפותחים ודולפים. לכן, שרף מטיל מצליח להחזיק בתוך כלי הזעירים, לעתים קרובות נקבוביים,.

למכשולים נראות לעין אלה, בין יתר, בחרנו לשלב בmicroinjections vivo תוך-לב לקטינים עגבניות עובריים (TL) לחקירות של פיתוח כליות שלנו מונחה אולטרסאונד. בהליך זה אנו מנצלים בדיקה אולטרסאונד כדי להנחות את מחט micropipette רכובה מלאה 2.5 μl של פתרון TL לתוך החדר השמאלי של עכבר עובר בנקודות E11.5, E13.5, E15.5, וזמן E17.5 סינכרוני. E17.5 הוא הגיל ההתפתחותי האחרון כמחטים הן לא חזקות מספיק כדי לחדור את העובר מפותח יותר.

היתרונות של שיטה זו הם בשפע microinjection. microinjection מודרך אולטראסאונד מאפשר מיקום מדויק של מחט זריקה בתוך החדר השמאלי העוברי, גירוש פסיבי ושליטה מלאה של פתרון ללב הפועם של בעלי החיים, נזק מינימאלי ללב ורקמות הסובבות, והימנעות מכישלון לב הפתאומי ומותו של עובר לפני זלוף גוף מלא. עם השימוש בTL FITC שכותרתו, כל כלי דם perfused ישמור את הסמן לאורך קרום פסגת אנדותל. בשילוב עם אימונוהיסטוכימיה, ניצול PECAM (CD31, מולקולת הידבקות תא אנדותל טסיות דם) וסמנים אחרים של כלי דם שונים, אנו יכולים להבחין בבירור בין כלי perfused ו- perfused un, כמו גם לאפיין כל כתמים חריגים של רקמות הסובבות.

Protocol

הערה: אוניברסיטת פיטסבורג מוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש הוועדה אישרה את כל הניסויים.

1. הכנת מכשירי אולטרסאונד-microinjection ועוברים

1. הגדר את הבמה, הר, ובדיקה (איור 1), כמו גם מכשירי ניתוח (איור 2). פתרון פוספט המקום שנאגרו מלוח (PBS) (pH7.4) באמבט התחממות 37 ° C. מלא מחט microinjection לחלוטין עם שמן מינרלים, באמצעות מיליליטר המזרק 1 מצורף ל-25 גמישים מחט G שנייה, דרך הבסיס שלה.
2. תקן את המחט על סיבוב הר זרוע, ומחט ריקה של פתרון שמן מינרלים. למלא מחדש עם 2.5 μl של פתרון TL. ודא שאין בועות אוויר נמצאות בתוך מחט הזריקה. סובב את זרוע מחט לכיוון קיר, הרחק מהבמה.
3. להרדים את האמא בהריון בתא הרדמה באמצעות עירוי מתמשך של isoflurane. כשאמא שלו אבדה את ההכרה, להעביר את ההרדמה לצינור האף ממוקם בגצד audal של השלב, ואמא של מקום במצב שכיבה עם חוטם בצינור האף כדי לאפשר המשך מצב בהרדמה מלאה.
4. גפיים קלטת ב -45 מעלות זוויות, או עם ידיים ורגליים נחו ואת מיקומו כרטיסיות / צג טמפרטורת overtop ECG. חשוב שהסכר בהריון מנוטר כל הזמן כדי להבטיח הרדמה שמספיק והמשחה שביישומים לעיניים להפחתת ייבוש.
5. החל מוצר להסרת שיער על פני בטן תחתונה של האמא, לנגב בעדינות את עם צמר גפן יבש, ולאחר מכן שוב עם צמר גפן רווי אתנול 70% כדי להסיר כל מוצר ושיער עודפים. ודא לנקות את עור בטן של כל השיער באתר של חתך (איור 3).
6. בצע laparotomy על האמא בהריון באמצעות מלקחיים כירורגיים קנס ומספריים. תשמור על עצמך כדי להימנע מחיתוך כל כלי גדולים או איברים פנימיים. הפוך ראשון, חתך ישר של האפידרמיס 1.5-2 סנטימטר מעל הנרתיק וממשיך לחתוך לכיוון צלעות לapproximatסנטימטר Ely 2-3. לחשוף את הקרום תת-עורי, לאתר את alba linea ("הקו לבן") (איור 3), ולחתוך במקביל לחתך ראשוני, יחד באותו האורך, לחשוף פנימי איברים פנימיים וsaccules רחם.

2. הפקה של עוברים

1. השתמש בהחלה מכותנת שקצה 6 אינץ 'לתמרן אמא ועוברים. דחפו בעדינות (לא מכריח) על עור עם המוליך לתמרן עובר ראשון מתוך פתיחת חתך. לאחר החילוץ של שקיק העובר הראשון, בעדינות ולאט לאט למשוך את יתרת קרן הרחם דרך ועל חיצוני של האם. הימנע ממשייכת מעי או לאיברים אחרים דרך חתך בשלב זה.
2. לכמת עוברים ומניחים בעדינות קרן רחם עזב בחזרה לאמא. לאחר מכן להתחיל בהצטרפות לקרן רחם הזכות חזרה אל אמא מתחילה עם מרוחק שקיק עובר מהנרתיק על הצופר ולנוע כלפי מטה. תמשיך את זה עד שרק שני עוברים יישארו חשופים (Fiתרשים 4). לבסוף, עוברי עמדה בטור לעיל ומקביל לחתך קו, להיות מודע לא לנתק את זרימת דם ברחם.
3. מניחים בלוקים חימר ועמדה בין זרועות וגוף, כמו גם את הרגליים וזנב. ודא שמשטחי החימר כ רמה עם חתך laparotomy. להרטיב את צלחת פטרי fenestrated עם 37 ° C PBS.
4. לתפוס מלקחיים הארכה עם יד ימין וצלחת פטרי עם fenestrated יד שמאל (במקביל אשנוב לעוברים) ולהביא מלקחיים ~ 5 סנטימטר סגור דרך אשנוב, מהחלק העליון של צלחת פטרי. מלקחיים פתוחים לחלוטין מבלי לקרוע רשת אשנוב.
5. לתמרן את הידיים מעל עוברים ולהתמקד מראה על שני saccules העובר. ללא (או קל) נוגע saccules עם התמזגות אשנוב או מלקחיים, להחליק אותם דרך חריץ ולהגדיר צלחת פטרי על הבטן של אמא. עם מלקחיים עדיין מורחבים, לתפעל רשת fenestrated להושיב אותו על שני צדדים ובבסיסו של כל עובר (איור 5 ) ולמשוך מלקחיים מפתיחת חריץ.
6. השלב הבא, במקום גומי כחול המכיל קיר בצלחת פטרי, בלי לצבוט או פצעו עוברים (איור 6). הפוך לוקי חימר בטוחים בתקיפות מאזנים צלחת פטרי, עובר, וקיר המכיל גומי. לבסוף, למלא צלחת פטרי עם 37 מעלות צלזיוס PBS עד עובר הם שקועים לחלוטין (איור 6), תוך פיקוח על דליפות בהתמזגות fenestrated.

נוהל 3. הזרקה

1. שלב תחתון הזרקה עם אמו ועוברים למטה באמצעות כפתור כוונון הרמה-Z (איור 1) ולאחר מכן לסובב מחט זריקה ולעלות זרוע והשורה ישירות עם הבדיקה אולטרסאונד, עם סנטימטר ½ מחט משמאל ומתחת לקצה הבדיקה (איור 7) . לדחוף מחט-זרוע (לא מחט) 45 ° מהבדיקה. היזהר שלא פגע בקצה המחט עם חללית הצלחת או אולטרסאונד.
2. להעלות שלב הזרקה חזרה לגובה מקורי, עם p אולטרסאונדגלימה ישירות מעל Probe עוברים חייבת להיות שקועה מעט ובתוך 3-4 מ"מ של הרקמה העוברית. כפתורי התאמת שלב השימוש X & Y (איור 8) לתיקון מצב עובר / אמא / במה כדי לאתר את הלב העוברי להכות באופן שיטתי.
3. ישירות מרכז של מסך אולטרסאונד להתבונן טוש שחור יעד המרכז נמשך (*). אתר חדר השמאלי (עדיף) או אטריום באמצעות כפתורי התאמת שלב X & Y (איור 8) ולאחר מכן להגדיל או להקטין את השלב באמצעות ידית מסתובבת על הבמה למצב את יעד הזרקה בדיוק מעל הסמן המרכזי בצבע השחור על מסך אולטרסאונד.
4. השתמש בכפתור כוונון שלב X לעבור עובר בצד הימין, מעל מסך אולטרסאונד. מיקום מחדש מחט microinjection וזרוע אחורית למקום, סנטימטר וחצי מו -90 מעלות לבדיקת אולטרסאונד (איור 7).
5. באמצעות microinjection הר כפתורי התאמה (איור 9 ג-G), מחט עמדה עם הקצה בבירור אלigned עם הסמן המרכזי. להתאים את זווית הזרקה (תוך שימוש בידיות באיור 9 ג וEG), ו- X, Y, Z ווקטורים של מיקרו-מחט על מנת להבטיח במטוס הנכון קצה מחט מתמקד. לחזור בו מחט microinjection באמצעות אך ורק את הכפתור "זריקה" (איור 9F), נזהר שלא להתאים ממדים אחרים.
6. שוב, באמצעות רק את עובר X ​​עדין התאמת מהלך ידית שלב בחזרה מתחת לבדיקה, עם היעד בדיוק על סימן המרכז על מסך אולטרסאונד. ודא שהחדר השמאלי הוא עכשיו בדיוק באותו X, Y, Z ומטוס.
7. בשלב הבא, רק עם הידית "ההזרקה" על microinjection הר, לנקב לאט עובר עם מחט microinjection ולהביא בהדרגה קצה לתוך החדר השמאלי. הזרק 2.5 μl המלא של פתרון TL לתוך חדר השמאלי או עד שצלילי צפצוף אזהרה הריקים, על ידי החזקה "ריק" וקשה "למלא" פעם אחת (איורים 2 א & B). בשלב זההזרקה להתבונן צל שייוצר מקצה המחט שהוא TL נכנסים לתוך תא הלב (איור 10). בכיוון הפוך, לחזור בו במהירות מחט microinjection סיבוב ידית "הזריקה" (איור 9F) על microinjection הר כאשר ההזרקה היא מלאה.
8. תמשיך לעובר הבא ולחזור על הליך זה עבור עוברים שנותרו לאחר סדרה זו של צעדים ולבסוף מניחים את העוברים הסופיים חזרה לבטן של הסכר. לעבור הרדמה לחדר תיבה ועדינות להעביר אמא כאן במשך 15 דקות מהזמן של הזריקה האחרונה.

4. קציר עוברים וניתוח

1. להקריב את הסכר באמצעות נקע בצוואר הרחם. להרחיב את חתך laparotomy להסיר בקלות קרנות רחם מהאם. שמור את העוברים בתוך שק רחם. הנח עוברים בPBS המקורר.
2. לנתח עובר מן שק רחם (אם רקמת גוביינא הכרחית לגנוטיפ) ולמקם את כל העובר iParaformaldehyde n 4% (PFA) לילה, ואז לתוך 30% סוכרוז לילה, להקפיא בcryostat חתך בינוני. ואז לחתוך את cryosection ולמקם אותו על גבי שקופיות לניתוח immunohistochemical. לחלופין, להשתמש ברקמות לכל הר על ידי ההתייבשות במתנול 100%, לאחר הקיבוע בPFA 4%.
3. לניתוח immunohistochemical למקם את cryosections לPBS להסיר אוקטובר אז לחסום את החלקים עם 10% חמורים בדם נורמלי למשך 30 דקות. לאחר מכן להוסיף נוגדן ראשוני PECAM ב 1: 100 דילול הלילה ב 4 מעלות צלזיוס. למחרת, לשטוף את השקופיות בPBT 3 פעמים במשך 10 דקות כל אחד ולהוסיף עכברוש אנטי חמור 594 משניים ודגירה עבור שעה 1 ב RT.
   הערה: זוהי טכניקה מאוד תובענית הדורשת אופטימיזציה ותיאום של אולטרסאונד וmicroinjection. יש עקומה למידה תלולה מאוד הקשורים לטכניקה זו ודורשת ארבעה עד שישה שבועות של זריקות מורה רוחניות לפני אחד הופך מיומן.

תוצאות

היווצרות כלי דם מקדימה זרימה בפיתוח בכליות

רוב הרקמות עובריים (כולל הכליות) מכיל כלי דם צפופים (שני unperfused וperfused), אפילו בנקודות זמן עובריים מוקדמות. כדי לאמוד ולנתח טובים יותר את זרימת דם בתוך הכליה הפיתוח אנו מנוצלים שיטה בmicroinjecti...

Discussion

הרדמה Microinjection ומסגרת זמן

בכל הקשור להרדמה של האמא, זה חיוני כדי לשמור על זרימת אוויר קבוע (2-3 L / min) ובPSI הנמוך. הזרימה של ההרגעה חייבת להיות מוחזקת בכ 1.75-2 L / min. במקביל, לוחות זמנים שבי הזריקות יתקיימו חייבים להיות תחת פיקוח הדוק ומבו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DAPI	Sigma Aldrich	022M4004V	concentration 1:5,000
Pecam	BD Biosciences	553370	concentration 1:100
FITC-Tomato Lectin	Vector Laboratories	FL-1321	concentration 2.5 µl / embryo
Alexa Fluor-594 (Donkey Anti-Rat)	Jackson Immunoresearch	712-585-150	concentration 1:200
Microinjection Needle	Origio Mid Atlantic Devices	C060609
Mineral Oil	Fisher Scientific	BP26291
1 ml syringe	Fisher Scientific	03-377-20
Clay Blocks	Fisher Scientific	HR4-326
Surgical Tape	Fisher Scientific	18-999-380
PBS	Fisher Scientific	NC9763655
Hair Removal Product	Fisher Scientific	NC0132811
Surgical Scissors	Fine Science tools	14084-08
Fine Forceps	Fine Science tools	11064-07
Surgical Marking Pen	Fine Science tools	18000-30
Right angle forceps (for hysterectomy)	Fine Science tools	11151-10