In Utero iniezioni intra-cardiaca di pomodoro-lectine su embrioni di topo per valutare renale Blood Flow

Riepilogo

This manuscript describes a technique for visualization of the developing vasculature. Here we utilized in utero intra-cardiac FITC-labeled tomato lectin microinjections on mouse embryos. Using this technique, we delineate the perfused and unperfused vessels throughout the embryonic kidney.

Abstract

La formazione e la perfusione di sviluppare vasi sanguigni renali (a parte glomeruli) sono molto poco studiato. Come vascolare si sviluppa attraverso l'angiogenesi (che è la diramazione dei vasi) e vasculogenesi (de novo formazione dei vasi), tecniche di mappatura di perfusione, come calchi in resina, in vivo imaging ad ultrasuoni, e micro-dissezione sono stati limitati a dimostrare le relazioni intime tra questi due processi e le strutture renali in via di sviluppo all'interno dell'embrione. Qui, descriviamo la procedura di in utero intra-cardiaca ecoguidata FITC-etichettati pomodoro microiniezioni lectine su embrioni di topo per valutare l'ontogenesi della perfusione renale. Pomodoro lectina (TL) è stato perfuso tutta l'embrione e reni raccolto. I tessuti sono stati co-colorate per varie strutture renali, tra cui: i progenitori nefrone, strutture nefrone, ureterale epitelio, e vascolare. A partire da E13.5 grandi vasi di grosso calibro sono stati perfusi, tuttavia periferichenavi rimaste unperfused. Con E15.5 e E17.5, piccoli vasi periferici e glomeruli iniziato a diventare perfusione. Questa tecnica sperimentale è critico per studiare il ruolo della vascolarizzazione e del flusso sanguigno durante lo sviluppo embrionale.

Introduzione

Durante lo sviluppo embrionale, due processi vascolari discreti, ma simultanei avvengono: angiogenesi, il processo mediante il quale una nave cresce da un vaso, e vasculogenesi pre-esistente, che è una formazione de novo di navi da residenziali progenitori endoteliali ^1,2. Rispettivamente, il primo è sinonimo di flusso sanguigno, mentre il secondo è pensato avvenire sostanzialmente in assenza di esso.

Simultanea di formazione dei vasi sanguigni, un processo ciclico e dinamico della sintesi progenitrici delle cellule renali, la proliferazione e la differenziazione comincia a svolgersi il giorno embrionale 9.5 (E9.5). A questo punto la gemma ureterale (UB) invade dorsale in circostante mesenchima metanefrico (MM), e continua fino alla nascita ^3. Ripetuto ramificazione della UB in rapida condensazione metanefrico tappo mesenchima inizia la formazione delle unità funzionali del rene, nefrone. Con ogni nuova generazione di UB e nephron, le vecchie generazioni sono collocate in regioni corticali e midollari interni, dove poi subiscono ulteriore maturazione e differenziazione all'interno di ambienti prevalentemente vascolare-densi. Come evidenziato da Dressler et al. ^3, questo processo embrionale viene precipitato mediante segnalazione induttivo, come crosstalk tra UB e MM, e una miriade di fattori extracellulari ^3-6. Due fattori extracellulari recentemente esaminato entro il pancreas e reni in via di sviluppo includono tensione di ossigeno e il flusso di sangue ^7,8. Quest'ultimo sarà discusso in maggior dettaglio nel seguito con riferimento allo sviluppo del rene.

Per esporre il ruolo induttiva che il flusso di sangue potenzialmente gioca nella differenziazione delle cellule progenitrici nefrone, così come in altri processi organogenesi, metodi precise ed accurate di mappatura del flusso sanguigno embrionale è imperativo.

Metodi alternativi di misurazione del flusso sanguigno includono la prescrizione di ultrasound immagini e resina calchi ^9,10. Conclusivamente, queste modalità hanno dimostrato di essere intrinsecamente carente nella loro capacità di svelare contemporaneamente giustapposizioni temporali e spaziali tra il flusso di sangue e di differenziazione delle cellule staminali. Calchi in resina, per esempio, offrono un valido modello di patterning nave nei tessuti adulti, ma in vasi immaturi, come ad esempio con punti di tempo embrionali, le navi sono gravemente sottosviluppati e perde. Pertanto, la resina getta non riescono a tenere all'interno dei vasi piccoli, spesso porosi,.

Per questi ostacoli apparenti, tra gli altri, abbiamo scelto di integrare ecoguidata in vivo intra-cardiaca embrionale lectina pomodoro (TL) microiniezioni nelle nostre indagini di sviluppo del rene. In questa procedura utilizziamo una sonda ad ultrasuoni per guidare in modo sincrono una micropipetta ago montato riempita con 2,5 ml di soluzione TL nel ventricolo sinistro di embrioni di topo in punti E11.5, E13.5, E15.5 e E17.5 tempo. E17.5 È l'ultima età evolutiva come gli aghi non sono abbastanza forti per penetrare l'embrione più sviluppato.

I vantaggi di questo metodo sono abbondanti microiniezione. Microiniezione Ultrasound-guida permette il posizionamento preciso di un ago per iniezione nel ventricolo embrionale di sinistra, espulsione passiva e controllata della soluzione nel cuore pulsante dell'animale, il minimo danno al cuore e tessuti circostanti, e la prevenzione di improvvisa insufficienza cardiaca e morte embrione prima della perfusione tutto il corpo. Con l'uso di un TL FITC-marcato, qualsiasi vascolarizzazione perfuso manterrà il marker lungo il suo endoteliale membrana apicale. In combinazione con l'immunoistochimica, utilizzando pecam (CD31, Platelet endoteliale molecola di adesione delle cellule) e vari altri marker vascolari, siamo in grado di distinguere chiaramente tra navi perfuso e non-perfusione, nonché caratterizzare qualsiasi colorazione anomala dei tessuti circostanti.

Protocollo

NOTA: L'Università di Pittsburgh Istituzionale Animal Care and Use Committee ha approvato tutti gli esperimenti.

1. Preparazione degli strumenti Ultrasound-microiniezione e embrioni

1. Impostare palco, monte, e sonda (Figura 1), così come gli strumenti chirurgici (Figura 2). Luogo soluzione tampone fosfato salino (PBS) (pH7.4) a 37 ° C il riscaldamento bagno. Riempire microiniezione ago completamente con olio minerale, con siringa da 1 ml collegato a una seconda flessibile 25 ago G, attraverso la sua base.
2. Fissare ago sulla rotazione del braccio di montaggio, e vuota ago della soluzione di olio minerale. Re-riempire con 2,5 ml di soluzione TL. Assicurarsi che non bolle d'aria sono presenti all'interno l'ago iniezione. Ruotare il braccio l'ago verso la parete, lontano dal palcoscenico.
3. Anestetizzare la madre incinta in camera di anestesia via infusione continua di isoflurano. Quando la madre è uno stato di incoscienza, trasferire l'anestesia per tubo naso posizionato sul clato audal del palco, e posto la madre in posizione supina con il muso in tubo naso per consentire la continuazione di uno stato completamente anestetizzato.
4. Arti nastro in angoli di 45 °, o con le mani ei piedi riposati e posizionati sovrastano schede / monitor temperatura ECG. È importante che la diga incinta è costantemente monitorata per garantire che l'anestesia è sufficiente e che in pomata applicata agli occhi per ridurre l'essiccazione.
5. Applicare il prodotto di rimozione dei capelli attraverso basso addome della madre, pulire delicatamente con tamponi di cotone asciutto, e poi di nuovo con un 70% di tamponi di cotone etanolo-saturi per rimuovere qualsiasi prodotto in eccesso e capelli. Assicurarsi di pulire la pelle addominale fuori di tutti i capelli nel sito di incisione (Figura 3).
6. Eseguire una laparotomia sulla madre incinta con pinze chirurgiche fini e forbici. Fare attenzione a non tagliare le navi grandi o organi viscerali. Fate prima incisione diritta dell'epidermide 1,5-2 cm sopra la vagina e continuare tagliare verso costole per approximately 2-3 cm. Esporre la membrana sottocutanea, individuare la linea alba ("linea bianca") (Figura 3), e tagliare parallelo incisione iniziale, lungo la stessa lunghezza, per esporre organi interni viscerali e sacculi uterini.

2. Estrazione di embrioni

1. Utilizzare applicatori di cotone con punta da 6 pollici di manovra madre ed embrioni. Premere delicatamente (non forzare) sulla pelle con applicatore di manipolare primo embrione di apertura dell'incisione. Dopo l'estrazione del primo saccule dell'embrione, delicatamente e lentamente tirare il resto del corno uterino attraverso e sulla parte esterna della madre. Evitare di tirare intestino o altri organi attraverso un'incisione in questa fase.
2. Quantificare embrioni e inserire delicatamente corno uterino posteriore sinistra in madre. Poi iniziare mettendo il corno uterino destra nuovamente dentro la madre a partire dal lontano embrione sacculo dalla vagina sul corno e in movimento verso il basso. Continuare questo fino a soli due embrioni rimangono esposti (Fifigura 4). Infine, gli embrioni di posizione in una colonna sopra e parallela alla linea di incisione, essendo consapevoli di non tagliare la circolazione uterina.
3. Posizionare i blocchi di argilla e la posizione tra le braccia e il corpo, così come le gambe e la coda. Assicurarsi che le superfici in terra battuta sono circa livello con incisione laparotomica. Bagnare la piastra Petri finestrato con 37 ° C PBS.
4. Afferrare forcipe estendono con la mano destra e piatto fenestrato Petri con la mano sinistra (finestratura parallelo embrioni) e portare chiuso pinze ~ 5 cm attraverso fenestrazione, dalla parte superiore della scatola di Petri. Pinze aperte completamente senza strappi maglia finestratura.
5. Manovra mani sopra embrioni e concentrarsi vista sulle due sacculi embrione. Senza (o leggermente) toccando sacculi con finestratura meshing o pinze, farle scorrere attraverso fessura e impostare piastra di Petri sul ventre della madre. Con pinze ancora estese, manipolare maglia fenestrata a sedere su entrambi i lati e alla base di ogni embrione (Figura 5 ) e tirare pinze di apertura a fessura.
6. Quindi, posto di gomma blu contenente muro in capsula di Petri, senza pizzicare o ferire embrioni (Figura 6). Assicurarsi che i blocchi di argilla sono saldamente equilibrando capsula di Petri, embrione, e la parete contenenti gomma. Infine, riempire piastra di Petri con 37 ° C PBS fino embrioni sono completamente sommersi (Figura 6), controllando eventuali perdite a meshing fenestrata.

Procedura 3. Iniezione

1. Stadio inferiore iniezione con la madre e gli embrioni verso il basso con manopola di regolazione del livello Z (figura 1) e quindi ruotare ago per l'iniezione e il braccio di montaggio e allineare direttamente con sonda ecografica, con ½ ago cm a sinistra e sotto la punta della sonda (Figura 7) . Spingere l'ago-braccio (non l'ago) a 45 ° di distanza dalla sonda. Fare attenzione a non colpire la punta dell'ago con la sonda piatto o ad ultrasuoni.
2. Sollevare fase di iniezione di nuovo all'altezza originale, con gli ultrasuoni probe direttamente sopra Probe embrioni deve essere un po 'sommerso e entro 3-4 mm del tessuto embrionale. Usa X & Y manopole di regolazione fase (Figura 8) per modificare la posizione dell'embrione / madre / stage per individuare sistematicamente cuore embrionale battere.
3. Direttamente Centro di schermo ultrasuoni osservare un pennarello nero bersaglio centro disegnato (*). Individuare ventricolo sinistro (preferibile) o Atrium con le manopole di regolazione fase X & Y (Figura 8) e poi alzare o abbassare il palco con la manopola girevole sul palco per posizionare obiettivo iniezione esattamente sopra il marker nero sullo schermo ultrasuoni.
4. Utilizzare X manopola di regolazione fase embrionale per spostare a destra, fuori dello schermo ultrasuoni. Riposizionare microiniezione ago e il braccio in posizione, ½ cm di distanza dal e 90 ° rispetto alla sonda ecografica (Figura 7).
5. Utilizzando microiniezione montaggio manopole di regolazione (figura 9C-G), la posizione dell'ago con la punta chiaramente aligned con il marcatore centrale. Regolare l'angolo di iniezione (con manopole in Figura 9C & EG), e X, Y, Z e vettori di micro-aghi per garantire punta dell'ago è focalizzata nel piano corretto. Ritrarre microiniezione ago utilizzando esclusivamente la manopola "iniezione" (Figura 9F), attenzione a non modificare altre dimensioni.
6. Ancora una volta, utilizzando esclusivamente l'X regolazione fine manopola fase embrionale mossa di nuovo sotto la sonda, con l'obiettivo esattamente sul segno centrale sullo schermo ultrasuoni. Assicurarsi che il ventricolo sinistro è ora esattamente nella stessa X, Y, e Z aereo.
7. Successivamente, con la sola manopola "iniezione" sul supporto microiniezione, lentamente forare embrione con l'ago microiniezione e gradualmente portare punta nel ventricolo sinistro. Iniettare il pieno di 2,5 ml di soluzione di TL in ventricolo sinistro o fino a quando i segnali acustici di allarme vuote, tenendo "vuoto" e toccando "riempire" una volta (figure 2A & B). In questo momentodell'iniezione osservare un'ombra proveniente dalla punta dell'ago che è la TL entrare nella camera cardiaca (Figura 10). In contrario, ritirare rapidamente microiniezione ago ruotando la manopola "iniezione" (Figura 9F) sulla microiniezione monte quando l'iniezione è completa.
8. Proseguimento per il prossimo dell'embrione e ripetere la procedura per embrioni rimanenti seguito questa serie di passaggi e, infine, mettere gli embrioni finali nuovamente dentro l'addome della diga. Passare anestesia a scatola da camera e spostare delicatamente la madre qui per 15 minuti dal momento dell'ultima iniezione.

4. raccolta embrioni e analisi

1. Sacrifica diga via dislocazione cervicale. Espandere l'incisione laparotomica per rimuovere facilmente le corna uterine dalla madre. Mantenere gli embrioni all'interno dell'utero sac. Mettere embrioni in raffreddato PBS.
2. Sezionare embrioni da uterino sac (se il tessuto necessario per raccogliere genotipizzazione) e porre il tutto embrione in 4% paraformaldeide (PFA) durante la notte, poi in 30% di saccarosio durante la notte, congelare in criostato sezionamento di media. Poi tagliare il cryosection e posizionarlo su vetrini per l'analisi immunoistochimica. Facoltativamente, utilizzare tessuti di tutto il montaggio da disidratazione in 100% di metanolo, dopo fissazione in 4% PFA.
3. Per l'analisi immunoistochimica mettere le criosezioni in PBS per rimuovere Office. Poi bloccare le sezioni con siero normale asino 10% per 30 min. Quindi aggiungere anticorpo primario PECAM a 1: 100 diluizione notte a 4 ° C. Il giorno dopo, lavare i vetrini in PBT 3 volte per 10 minuti ciascuno e aggiungere asino contro ratto 594 secondaria e incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
   NOTA: Questa è una tecnica molto esigente che richiede l'ottimizzazione e il coordinamento di ultrasuoni e microiniezione. C'è una curva di apprendimento molto ripida legati a questa tecnica e richiede 4-6 settimane di iniezioni mentore prima si diventa abili.

Risultati

Formazione vascolare precede flusso in via di sviluppo del rene

La maggioranza di tessuto embrionale (compreso il rene) contiene un sistema vascolare denso (sia unperfused e perfuso), anche a primi punti temporali embrionali. Per meglio calibro e analizzare il flusso di sangue all'interno del rene sviluppo abbiamo utilizzato un metodo di In Utero microiniezioni intracardiache embrionali. Con l'uso di un ultrasuoni ad alta risoluzione per identificare cuore embrionale E11.5 E17.5 attr...

Discussione

Microiniezione anestesia e tempi

Per quanto riguarda anesthetization della madre, è essenziale per mantenere costante il flusso d'aria (2-3 L / min) e la bassa PSI. Il flusso del sedativo deve essere tenuto a circa 1,75-2 L / min. Contemporaneamente, tempi in cui le iniezioni hanno luogo devono essere attentamente monitorati e controllati per con ogni cucciolata. Per ogni cucciolata la procedura di iniezione deve essere tenuto sotto 45 min. L'importanza di tale termine è fondamenta...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
DAPI	Sigma Aldrich	022M4004V	concentration 1:5,000
Pecam	BD Biosciences	553370	concentration 1:100
FITC-Tomato Lectin	Vector Laboratories	FL-1321	concentration 2.5 µl / embryo
Alexa Fluor-594 (Donkey Anti-Rat)	Jackson Immunoresearch	712-585-150	concentration 1:200
Microinjection Needle	Origio Mid Atlantic Devices	C060609
Mineral Oil	Fisher Scientific	BP26291
1 ml syringe	Fisher Scientific	03-377-20
Clay Blocks	Fisher Scientific	HR4-326
Surgical Tape	Fisher Scientific	18-999-380
PBS	Fisher Scientific	NC9763655
Hair Removal Product	Fisher Scientific	NC0132811
Surgical Scissors	Fine Science tools	14084-08
Fine Forceps	Fine Science tools	11064-07
Surgical Marking Pen	Fine Science tools	18000-30
Right angle forceps (for hysterectomy)	Fine Science tools	11151-10