マウス胚に子宮内 、心臓内トマトレクチン注射では腎血流量を測定する

要約

This manuscript describes a technique for visualization of the developing vasculature. Here we utilized in utero intra-cardiac FITC-labeled tomato lectin microinjections on mouse embryos. Using this technique, we delineate the perfused and unperfused vessels throughout the embryonic kidney.

要約

腎臓の血管（離れて糸球体からの）開発の形成と灌流が大幅に代役されている。脈管構造は、（主要な血管の外分岐される）は、血管形成および脈管形成（ 新生血管形成）を介して発展するにつれて、そのような生体内超音波イメージングの樹脂キャスト、および顕微解剖として灌流マッピング技術との間の密接な関係を実証するが限定されているこれら二つのプロセス及び胚内の腎臓の構造を開発。ここでは、腎臓の灌流の個体発生を測定するためにマウス胚に子宮内心臓超音波ガイド下FITC標識トマトレクチンマイクロインジェクションでの手順を説明します。トマトレクチン（TL）は、収穫胚および腎臓を通して灌流した。ネフロン前駆細胞、ネフロン構造、尿管上皮、および血管系：組織を含む様々な腎臓構造に共染色した。 E13.5から始まる大口径容器は、しかし、末梢灌流した船がunperfused残った。 E15.5およびE17.5では、小さな末梢血管だけでなく、糸球体は、灌流さになることを始めた。この実験的手法は、胚発生中の脈管構造と血流の役割を研究するために重要である。

概要

胚発生中に2つの別々の、まだ同時、血管のプロセスが行われます。血管新生、血管が住宅内皮前駆細胞^1,2から血管のデノボ形成であり、主要な既存の容器、および脈管形成、から成長するプロセスを。後者は、主にそれが存在しない場合に起こると考えられている間に、それぞれ、前者は、血流と同義である。

血管形成への同時、腎臓前駆細胞合成、増殖、および分化の循環的かつダイナミックなプロセスは、胎生9.5（E9.5）上で展開を開始します。この時点で、尿管芽（UB）は、周囲の後腎間葉（MM）に背側に侵入し、出産³まで続く。急速に後腎キャップ間充織を凝縮にUBの繰り返しの分岐は腎臓の機能ユニットの形成、ネフロンを開始します。 UBとnephのすべての新世代ロンは、古い世代は、それらが、その後、主に血管密度の高い環境内でさらに成熟と分化を受け、内側皮質と髄質の地域、にずれている。ドレスラーらによって証明されるように^、図3に、この発生学的プロセスは、UBとMMとの間のクロストーク、および細胞外因子^3-6無数のように、誘導性シグナル伝達により沈殿させる。開発膵臓と腎臓内の二つの最近調査し、細胞外の要因は、酸素緊張と血流^7,8が含まれ^ています。後者は、腎臓の発生に関連して以下でさらに詳細に説明する。

血流は、潜在的ネフロン前駆細胞の分化、並びにの他の器官形成プロセス、胚血流マッピングの精密で正確な方法で果たす役割の誘導を露出させるために不可欠である。

血流を測る別の方法は、ulの処方を含むtrasoundイメージングと樹脂が^9,10を投げかける。結論的に、これらのモードは、本質的に同時に、血流との間の時間的及び空間的な並置を発表し、幹細胞の分化する能力に欠けていることが示されている。レジンキャストは、例えば、成体組織内の血管パターニングの有効なモデルを提供する、しかしそのような胚の時点と同様に未熟船、で、血管が肉眼的に未発達及び漏出性である。そのため、樹脂は、しばしば多孔質の、小さな血管内に保持することができないキャスト。

これらの見かけ上の障害のために、とりわけ、我々は超音波ガイド下腎臓発生の私たちの調査に生体内で心臓内胚トマトレクチン（TL）マイクロインジェクションに組み込むことを選んだ。この手順では、同期E11.5、E13.5、E15.5およびE17.5の時点でのマウス胚の左心室にTL溶液2.5μlので満たされたマイクロピペット取り付けられた針を案内するために超音波プローブを利用する。 E17針がより発展した胚を貫通するのに十分な強さではありませんように0.5は、最新の発達時代です。

このマイクロインジェクション法の利点は豊富である。超音波ガイド下マイクロインジェクションは、動物の鼓動する心臓への胚性左心室、ソリューションの受動的かつ制御追放、心臓や周辺組織への最小限のダメージ、との突然の心不全と死の回避内注射針の正確な位置決めが可能胚全身灌流の前に。 FITC標識TLを使用することで、すべての灌流し、血管系は、内皮頂端膜に沿ってマーカーを維持します。免疫組織化学と組み合わせて、PECAM（CD31、血小板内皮細胞接着分子）、および様々な他の血管マーカーを利用して、我々は明らかに灌流および非灌流血管を区別するだけでなく、周囲の組織の任意の異常な染色を特徴付けることができる。

プロトコル

注：ピッツバーグ大学の施設内動物管理使用委員会は、すべての実験を承認した。

超音波マイクロインジェクションインスツルメンツおよび胚の作製

1. ステージを設定し、マウントして、プローブ（ 図1）と同様に手術器具（ 図2）。 37℃の加温槽内の場所のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液（pH7.4）で。そのベースを介して、第二の柔軟な25 G針に付着した1mlシリンジを使用して、鉱油を完全にマイクロインジェクション針を埋める。
2. 回転上に針を修正アームをマウントし、鉱油溶液の空の針。 TL溶液を2.5μlの再埋める。気泡が注射針内に存在しないことを確認してください。離れてステージから、壁に向かって針アームを回転させます。
3. イソフルランの連続注入を介して麻酔室で妊娠中の母親を麻酔。母親が無意識にレンダリングされると、C上に位置する鼻チューブに麻酔を転送audalステージの側面、そして完全に麻酔をかけた状態の継続を可能にするために鼻のチューブに鼻と仰臥位で母親を置く。
4. 45°の角度で、または手や足にテープ手足は休息と頭上ECG /温度モニタのタブを配置。これは、妊娠中のダムが継続的にその麻酔を確実に監視することが重要であるのに十分であり、眼への印加中にその軟膏は、乾燥を軽減する。
5. 優しく余分な製品と毛を除去するために70％エタノール飽和綿棒で再度乾燥した綿棒で拭き取っ、そして、母親の下腹部全体に脱毛製品を適用します。切開部位（ 図3）で、すべての髪のオフ腹部の皮膚をきれいにすることを確認してください。
6. 細かい外科鉗子やハサミを使って妊娠中の母親に開腹を行います。すべての主要な血管や内臓器官を切断しないように注意してください。 1.5〜2センチメートル膣の上に、第一表皮のストレート切開を作成し、approximatためのリブに向けてカットを継続エリー2-3センチ。内臓器官および子宮球形嚢の内部を露出させるために、同じ長さに沿って、皮下膜を公開白線（「白線」）（ 図3）を探して、最初の切開に平行に切断。

胚の2.抽出

1. 母と胚を操縦するために6インチの綿棒アプリケーターを使用してください。静かに切開口から最初の胚を操作するアプリケータを用いて皮膚に（強制しない）押してください。最初の胚球形嚢の抽出後、静かにゆっくりと通過して、母親の外側に子宮角の残りの部分を引っ張る。この段階で切開を通って腸または他の臓器を引っ張っては避けてください。
2. 胚を定量化し、優しく母親に戻す左子宮角に配置します。そして、ホーンに膣から胚球形嚢遠いから始まって下方向に移動バック母に右子宮角を配置し始める。唯一の2胚を露出されたままになるまでこれを続けます（FIグレ4）。最後に、切開線に上記と平行の列の位置の胚は、子宮の循環を遮断しないように認識している。
3. 粘土ブロックと腕と体の間の位置に配置し、だけでなく、足や尾。粘土表面は開腹切開とほぼレベルであることを確認してください。 37℃のPBSで有窓ペトリ皿を湿ら。
4. 左手（胚に開窓パラレル）で右手と有窓シャーレに鉗子を拡張つかみ、ペトリ皿の上から、窓を通して〜5cmのクローズ鉗子を持って来る。完全に開窓メッシュを引き裂くことなくオープン鉗子。
5. 胚の上に手を操縦し、2胚球形嚢に視力を集中。なし（または軽く）スリットを介してそれらをスライドさせ、母親の腹部上にシャーレを設定し、開窓メッシングまたは鉗子で球形嚢に触れる。鉗子はまだ延長すると、いずれかの側に、それぞれの胚のベース（ 図5でそれを着座させる有窓メッシュを操作する）と、スリット開口部から鉗子を引き出します。
6. 次に、（ 図6）つまんまたは胚を傷つけることなく、シャーレに壁を含む青いゴムを配置します。確認粘土ブロックはしっかりとペトリ皿、胚、およびゴム含有壁をバランスされていることを確認。有窓メッシングで漏れを制御しながら、胚が完全に、（ 図6）水没するまで最後に、37℃のPBSでペトリ皿を埋める。

3.注入手順

1. 次に、下部注入母胚ダウンZレベル調整つまみ（ 図1）を使用して、ステージとプローブ先端左と下針1/2センチで、注射針を回転させ、アームをマウントし、超音波プローブに直接並ぶ（ 図7） 。 45°離れたプローブからの針アーム（しない針）を押します。皿または超音波プローブを用いて針の先端をヒットしないように注意してください。
2. 超音波pで、元の高さに噴射ステージを上げる直接プローブがわずかに沈めなければならない胚上方および胚組織3-4 mm以内ローブ。使用X＆Yステージ調整ノブ（ 図8）体系的に破って、胚の心を見つけるための胚/母​​/ステージ位置を修正する。
3. 直接超音波画面の中央には、描かれた黒、センター標的マーカー（*）を観察する。 （ 図8）X＆Yステージ調整ノブを使用して、左心室（望ましい）またはアトリウムを見つけて、超音波画面上の黒いセンターマーカーの上に正確に注入ターゲットを配置するために、ステージ上の回転ノブを使用して、ステージを上げるか、下げる。
4. 超音波画面から、右に胚を移動するXステージ調整ノブを使用してください。 1/2離れてからCMと、超音波プローブに90°（ 図7）、マイクロインジェクション針の位置を変更し、元の位置に戻し腕。
5. マイクロインジェクションを使用すると、アル明らかに調整つまみ（ 図9C-G）、先端を位置の針をマウントセンターマーカーでigned。針の先端が正しい平面内に集束されるように（ 図9CおよびEGでノブを使用して）噴射角を調整し、マイクロニードルのX、Y、およびZベクター。他の寸法を調整しないように注意し、単に「注射」ノブ（ 図9F）を使用して、マイクロインジェクション針を撤回。
6. ここでも、正確に超音波画面上の中心マークのみにターゲットを持つバックプローブ下のX微調整段階つまみ移動胚を、使用して。左心室が全く同じX、Y、Zの平面上になっていることを確認してください。
7. 次に、マイクロインジェクションに単に「注射」ノブでマウント、ゆっくりとマイクロインジェクション針で胚を穿刺し、徐々に左心室に先端をもたらす。 「空」を保持し、（ 図2A＆B）いったん「埋める」をタップして、左心室にまたは空の警告ビープ音がするまで、TL·ソリューションの完全な2.5μLを注入。現時点では注射の心臓の室に入るTL（ 図10）である針の先端から発せられる影を観察する。逆に、すぐに注入が完了したときにマイクロインジェクションの「注射」ノブ（ 図9F）がマウント回転マイクロインジェクション針を撤回。
8. 次の胚に進みとこの一連の以下の残りの胚について、この手順を繰り返し、最終的に戻ってダムの腹部への最終胚を置きます。チャンバーボックスに麻酔を切り替えて、静かに最後の注射の時から15分間、ここで母を移動します。

4.収穫胚および分析

1. 頸椎脱臼を経由してダムを生け贄に捧げる。簡単に母親から子宮角を除去するための開腹切開を展開します。子宮嚢の中の胚にしてください。チルドPBS中で胚を置きます。
2. （あれば遺伝子型判定のために必要な収集組織）子宮嚢から胚を解剖し、全胚を置くI一晩30％ショ糖に一晩、その後nは4％パラホルムアルデヒド（PFA）、クライオスタット切片媒体中で凍結する。その後、凍結切片をカットし、免疫組織化学的分析のためにスライド上に置きます。必要に応じて、組織のために使用し、100％メタノール中で脱水し、4％PFAで固定に従って全体をマウント。
3. 免疫組織化学的分析のために10月を除去するためにPBSに凍結切片を置く。その後、30分間、10％正常ロバ血清でセクションをブロックする。 4℃で一晩100希釈：次に1でPECAM一次抗体を追加します。翌日、10分毎にPBTで3回スライドを洗浄し、二次ロバ抗ラット594を追加し、室温で1時間インキュベートする。
   注：これは、超音波およびマイクロインジェクションの最適化と調整を必要とする非常に厳しい技術です。あり、この技術に関連した非常に急な学習曲線があり、1つが堪能になる前に指導し、注射の4〜6週間が必要です。

結果

血管形成は、腎臓の開発フローに先行

（腎臓を含む）胚組織の大部分はあっても初期胚の時点で、密な血管系（unperfusedと灌流さの両方）が含まれています。よりよいゲージに、我々は子宮内胎児の心臓内マイクロインジェクションでの方法を利用した開発腎臓内の血流を分析。 E17.5を通してE11.5で胚の心を識別するために、高解像度の超音波の使用により、および開腹?...

ディスカッション

マイクロインジェクション麻酔と時間枠

母親の麻酔に関しては、それは気流定数（2-3 L /分）と低PSIに保つことが不可欠である。鎮静剤の流れは、約1.75から2 L / minで保持されなければならない。同時に、注射が行われている時間枠を綿密に監視し、各ごみとのために制御されなければならない。各ごみための注射の手順は45分以下に抑えます。各胚が身体と関心のある器?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
DAPI	Sigma Aldrich	022M4004V	concentration 1:5,000
Pecam	BD Biosciences	553370	concentration 1:100
FITC-Tomato Lectin	Vector Laboratories	FL-1321	concentration 2.5 µl / embryo
Alexa Fluor-594 (Donkey Anti-Rat)	Jackson Immunoresearch	712-585-150	concentration 1:200
Microinjection Needle	Origio Mid Atlantic Devices	C060609
Mineral Oil	Fisher Scientific	BP26291
1 ml syringe	Fisher Scientific	03-377-20
Clay Blocks	Fisher Scientific	HR4-326
Surgical Tape	Fisher Scientific	18-999-380
PBS	Fisher Scientific	NC9763655
Hair Removal Product	Fisher Scientific	NC0132811
Surgical Scissors	Fine Science tools	14084-08
Fine Forceps	Fine Science tools	11064-07
Surgical Marking Pen	Fine Science tools	18000-30
Right angle forceps (for hysterectomy)	Fine Science tools	11151-10