חשיפה לפני הלידה אלכוהול מתונה וכימות של התנהגות חברתית בחולדות מבוגרות

Summary

The goal of the protocol presented here is to describe procedures to expose rats to moderate levels of alcohol during prenatal brain development and to quantify resulting alterations in social behavior during adulthood.

Abstract

Alterations in social behavior are among the major negative consequences observed in children with Fetal Alcohol Spectrum Disorders (FASDs). Several independent laboratories have demonstrated robust alterations in the social behavior of rodents exposed to alcohol during brain development across a wide range of exposure durations, timing, doses, and ages at the time of behavioral quantification. Prior work from this laboratory has identified reliable alterations in specific forms of social interaction following moderate prenatal alcohol exposure (PAE) in the rat that persist well into adulthood, including increased wrestling and decreased investigation. These behavioral alterations have been useful in identifying neural circuits altered by moderate PAE¹, and may hold importance for progressing toward a more complete understanding of the neural bases of PAE-related alterations in social behavior. This paper describes procedures for performing moderate PAE in which rat dams voluntarily consume ethanol or saccharin (control) throughout gestation, and measurement of social behaviors in adult offspring.

Introduction

1-5% משוערים של ילדים מאובחנים עם הפרעות אלכוהול עוברי ספקטרום (FASDs) ^2, הכוללות תסמונת אלכוהול עוברית (FAS), FAS החלקי (pFAS), ואלכוהול קשור נוירו-התפתחות הפרעות (ARNDs) ^3. גירעונות בהתנהגות חברתית והכרה הם בין תוצאות לוואי השכיחות ביותר שנצפו בילדים עם FASDs ^4-7. השלכות שליליות אינן מוגבלות לחשיפה כבדה לפני לידה אלכוהול (PAE), כPAE המתון שאינו מובילה לתכונת גירעונות מורפולוגיים, התנהגותיים וקוגניטיביים הבולטים של FAS יכול לגרום יחסית עדין, אבל בכל זאת מתמשכת, גירעונות בבני אדם עם FASDs ^8-10 ובעלי חיים שאינם בני אדם שנחשפו לאתנול במהלך התפתחות מוח ^11. החשיבות של הבנת השלכות נוירו-ביולוגיות התנהגות ומקבילות של PAE המתון מודגשת על ידי הערכות הנוכחיות מצביעים על כך שרוב הגדול של המקרים FASD ליפול בתוך פחות sמגוון evere של הספקטרום ^12.

מספר מעבדות עצמאיות דיווחו שינויים בהתנהגות חברתית מכרסם הקשורים לחשיפת אתנול במהלך התפתחות המוח, כוללים ירידה בחקירה ואינטראקציה ^1,13-15, שינתה לשחק ^14,16,17, עלו אינטראקציות אגרסיביות ^17,18, שינויים בהיענות לגירויים חברתיים ^19-21, וגירעונות בהעדפות מזון שנרכשו מבחינה חברתית וזיכרון ההכרה חברתי ^22. גירעונות התנהגות חברתית נצפו החשיפה הבאה ל( ריכוזי דם אתנול (BECs) ~ 300 מ"ג / ד"ל) כבדים ^22,23 או רמות מתונות יותר של אתנול (BECs ~ 80mg / dl) ^1, ועל פני מגוון רחב של פרמטרים למשמעותיים אחרים גורמים לרבות עיתוי חשיפה, משך חשיפה, וגיל בעת מדידת התנהגות.

המחקר קודם הראה כי שינויים בהיבטים ספציפיים של int החברתיeraction בבגרות להפלות חולדות שנחשפו לרמות מתונות של אלכוהול מבעלי חיים שנחשפו לשליטת סוכרזית ^1,18. בפרט, PAE המתון באופן עקבי היה קשור עם עלייה חזקה בהיאבקות, אשר טוענת עליות בהתנהגות תוקפנית, ורמות נמוכות יותר של חקירה החברתית (לדוגמא, מרחרחת של השותף) בבגרות. בגלל שינויים בהתנהגות חברתית השלכות אמינות של PAE, כימות של התנהגות החברתית הבא PAE עשויה להחזיק חשיבות להתקדמות לקראת הבנה מלאה יותר של הבסיסים העצביים של שינויים הקשורים ל- PAE בהתנהגות חברתית ובפיתוח גישות התערבותית. מטרתו של מאמר זה והווידאו הקשורים היא לספק הדרכה על הפרוטוקול המתון PAE ושיטות לכימות של התנהגות חברתית בצאצאים בוגרים שיש לי מהימן מכובד לפני לידה מצאצאי חולדות שנחשפו שאינם חשוף אלכוהול.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל הנהלים שתוארו כאן ובוידאו המצורף אושרו על ידי הוועדות מוסדי הטיפול בבעלי חיים ושימוש במרכז למדעי הבריאות והקמפוס המרכזי של אוניברסיטת ניו מקסיקו.

חשיפה 1. בהריון אתנול

1. לקבל את כל חומרים וכימיקלים דרושים: מימה סכרין מלח נתרן, 190 אתנול הוכחה (אלכוהול 95% לפי נפח), צינורות זכוכית שתיית חרוזים, לבן # גומי טבעי 4 פקק חור אחד, "נקודת עיקול צינורות כדור 1, שליטי נייר מודפסים מwww .vendian.org / mncharity / dir3 / paper_rulers /.
2. להשיג חולדות מגדל מבוגר מוכחות מספק או מקור חלופי. השתמש במגדלים הארוך אוונס לשיטות ונתונים נציג מוצגים בפרוטוקול זה. נקבות שוקלות 125-150 גר 'ו6-7 שבועות של גיל בעת הגעה כך שהם כ 9-10 שבועות בעת הרבייה (שלב 1.5). ודא שכל הסכרים הפוטנציאליים הם אמהות בפעם ראשונה. ודא שזכרים 12שבועות של גיל בהגעה ו -15 שבועות בתחילת פרוטוקול הרבייה.
3. בית החיות בנפרד בכלובי פלסטיק על 22 מעלות צלזיוס בשעתי אור 12 / לוח זמנים חשוכים הפוכים (אורות ב21:00-09:00 שעה). ספק גישה למזון ולמים ברז כהרצון לאורך כל תקופת המחקר, ובכלל זה בכל מושב השתייה. הרשה שבוע להסתגלות למתקן לפחות 1 לפני שתמשיך לשלב 1.4.
4. להשיג משקל גוף בסיסי עבור כל נקבת עכברוש.
5. להעריך רמות שתייה לפני הריון בחולדות נקבות במשך 2 שבועות. בצע את פעולות 1.5.1-1.5.6 כדי.
   1. בימים למלא 1 ו -2 צינור שתייה המכיל 0.066 פתרון סכרין% (לא אתנול) במים ברז. כדי לכמת את הצריכה להדביק שליט נייר עם דיוק מ"מ לצינור השתייה לפני ממלא אותו. השתמש בשיטה זו כפי שהיא מקטינה שגיאה במדידה הקשורים במשקל צינורות לכמת את צריכת אתנול. מלא את הצינור לסימן 20 מ"מ על השליט. בגין drinki ארבע שעותמפגשי ng (שלבים 1.5.1-1.5.6 ו -1.7) 1 שעה לאחר תחילתו של השלב הכהה (10:00 hr) כאשר רמות פעילות והשתייה הן הגבוהות ביותר.
   2. בסופו של כל מפגש שתייה לכמת את עוצמת הקול של פתרון סכרין שנצרך. כדי להקל על מדידה, לקבוע את עוצמת הקול של פתרון לכל מ"מ על הסרגל מראש ולהמיר מ"מ לכרכים. לצינורות המומלצים כאן כל מ"מ מתאים ל.366 מיליליטר.
   3. בימים 3 ו -4 למלא צינור עם 2.5% אתנול (V / V) ו0.066% פתרון סכרין במים ברז. בסופו של כל מפגש לכמת את כמות פתרון אתנול (משקל לכל קילוגרם של משקל גוף) שנצרך.
   4. ביום 5 ולאחר מכן למלא את צינור עם 5% אתנול (V / V) ו0.066% פתרון סכרין במים ברז. בסופו של כל מפגש לכמת את כמות פתרון אתנול (משקל לכל קילוגרם של משקל גוף) שנצרך.
   5. עם השלמת השלב טרום הריון השתייה לשקול את החולדות ולחשב את consum אתנול הממוצעption וסטיית תקן לכל הקבוצה. הסר חולדות שאומרות הצריכה היא גדול מ -1 סטיית תקן מעל או מתחת לקבוצה מתכוון מהמחקר כדי לצמצם את השונות בשתייה מרצון במהלך הריון.
   6. הקצה את החולדות שנותר לאו שליטת סכרין או תנאי PAE כך שרמות השתייה לפני ההריון מותאמות קרובה ככל האפשר לשתי קבוצות.
6. בתוך זוג 1-14 ימים כל נקבת עכברוש עם מגדל זכר מוכח. חולדות נקבות לא לצרוך אתנול בשלב הרבייה. לאשר את ההריון על ידי הנוכחות של תוסף נרתיק, לשקול את נקבת העכברוש, ולשכן אותה באופן אישי. זה מוגדר כיום הריונית 1. לחלופין, לעזוב את נקבת החולדות עם מגדל זכר לתקופה של עד 5 ימים, לאחר שיסירו את הנקבות מהמחקר.
   הערה: מאחר צריכת אתנול במהלך ההריון מתחילה בשעה 10:00 בשעה בבדיקת יום 1 הריונית לנוכחות של תוסף נרתיק צריכה להתבצעלפני הזמן הזה.
7. לספק פתרונות אתנול או סכרין במשך 4 שעות ביום (1,000 עד 1,400 שעות) למשך הריון.
   1. החל ביום 1 הריונית לספק נקבת העכברוש עם או 0% או 5% אתנול ו 0.066% פתרון סכרין במים ברז המבוססים על המשימה הקבוצתית. ודא שעוצמת הקול של 0% אתנול פתרון הניתן לחולדות שליטת סכרין מותאמת לממוצע הנפח של 5% פתרון אתנול הנצרך על ידי חולדות אתנול. בסופו של כל מפגש לכמת את כמות פתרון אתנול (משקל לכל קילוגרם של משקל גוף) או סכרין שנצרך.
   2. שוקל סכרי עכברוש שבועי להעריך עלייה במשקל אימהי.
   3. לספק מזון ומים ברז בכל העת, כולל מפגשי השתייה.
   4. להפסיק את הליכי חשיפת אתנול כאשר הצאצאים נולדים. רשום את מספר הגורים חיים ומשקולות גור בלידה. לייעד את יום לידה כיום לידה 0.
   5. לברור את הפסולת עד 10 גורים סביב יום הלידה 2-3. תנסה to לשמור על יחס שווה בין זכר לנקבת בעלי חיים בכל המלטה. אם זה לא אפשרי, ללקט עד 10 גורים עם מספר שווה של גברים ונשים.
   6. משקולות גור שיא 2-3 ימים לאחר לידה.
   7. לגמול את בעלי החיים ביום כ 21-24 לאחר הלידה ובית בזוגות חד-מיניים עם בעלי חיים מאותו מצב טיפול טרום לידתי. אל תשתמש יותר מ 1-2 חולדות מכל המלטה לניסוי ללהגביל את ההשפעות פוטנציאליות המלטה.

2. התנהגות חברתית

1. להשיג ולהכין את כל חומרים וציוד הנדרשים.
   1. להשיג מנגנון לאינטראקציה חברתית. השתמש קאמרי עם ראש פתוח הבנוי מחומר קל לנקות ולחטא. מול המנגנון צריך להיות מכוסה בפלסטיק קשיח שקוף (~ עובי 2 מ"מ) לצילומים. קו הקירות הפנימיים ורצפה עם פלסטיק שקוף (~ 2 מ"מ עובי) כדי לסייע בניקוי ושליטה ריח. מראות מקום לאורך wa הפנים בחזרהll כדי לסייע ניתוח.
      הערה: נתוני הנציג לדיווחו כאן קאמרי מותאם אישית (× 47 סנטימטר 95 סנטימטרים רוחב × 43 ס"מ) עם ראש פתוח ופלסטיק שקוף קשיח (2 מ"מ עובי) המכסה את הצדדים ורצפה הפנימיים של המכשיר היה בשימוש. מראות הוצבו לאורך הקיר האחורי. הממדים וחומרים הספציפיים אינם קריטיים למדידה של התנהגות חברתית, לעומת זאת, מומלץ שהממדים להיות גדולים מספיק כדי להבטיח שאינטראקציה חברתית אמיתית ניתן להבחין בין התנהגויות אחרות. כלומר, המנגנון צריך להיות גדול מספיק כדי שבעלים חיים הם לא תמיד בסמיכות זה לזה.
   2. השג מצלמות וידאו מסוגלים להקליט בתנאים נמוכים או ללא-אור ככל הצילומים נעשים עם תאורה מפוזרת מעט או ללא בתוך הספקטרום הנראה. ודא שיש לו את המצלמה ברזולוציה גבוהה בתוך ספקטרום אינפרא אדום, לעומת זאת, כל מצלמה מסוגלת להקליט בתנאים חשוכים בה ילידיםמצב הלילה או עם מקרן אינפרא אדום נוסף צריך להיות מספיק.
   3. מקרן אינפרא אדום עמדה סביב המנגנון לשיפור תאורה של המנגנון בהקלטת וידאו.
   4. להשיג שבבי כיתה המעבדה עץ (שבב צפצפה).
   5. להשיג מברשת, יעה, דו תחמוצת כלור ואלכוהול איזופרופיל (70%) לניקוי המנגנון בין פגישות ושליטה ריח.
2. הסתגלות מכשירים והתנהגות חברתית
   1. לשלב זה של הניסוי, לבצע מדידות בחולדות מבוגרות כי הם לפחות 90 ימים של גיל.
   2. לפני כל פגישה להסיר כל שבבי יער, לנגב את המנגנון נקי עם אלכוהול איזופרופיל לשלוט ריחות בין פגישות ולספק שבבי עץ טריים. ודא ששבבי העץ לחלוטין לכסות את החלק התחתון של המכשיר. נקי ולטהר את המנגנון עם סוכן מתאים, כגון דו תחמוצת כלור, במידת צורך.
   3. במשך שלושה ימים רצופים למקם בעלי חיים והכלוב-הזוג לחדר במשך 30 דקות כדי להסתגל בעלי החיים למנגנון. במהלך מפגשי הסתגלות כל האורות בחדר כבויים.
   4. בסופו של בית מושב ההסתגלות השלישי החיות בנפרד בכלובים חדשים עם מצעים טריים, מזון, ומים למשך 24 שעות כדי להניע את האינטראקציה חברתית.
   5. אינטראקציה חברתית שיא ביום 24 שעות אחרי בעלי החיים הבאים הופרדה.
      1. הסר שבבי עץ מהמנגנון, נקי ולטהר עם דו תחמוצת כלור, לנגב עם אלכוהול איזופרופיל לשלוט ריחות, ולהחליף את שבבי העץ לפני הפגישה.
      2. מקם מצלמות אחד או יותר כדי להקליט את האינטראקציה. מצלמה לפחות עמדה אחת מול המנגנון כך שמראה על הקיר האחורי של המכשיר יכולה לספק פרספקטיבה נוספת לניתוח.
      3. אחזר בעלי חיים אחד בכל פעם ולהחזיק בעלי החיים במול המצלמה, כך שהתכונות הייחודיות של דפוס הפרווה ניתן לציין. תכונות זיהוי של אלההפרווה יכולה לשמש כדי להבחין חולדות במהלך ניתוח ולא באופן מלאכותי לציון בעלי החיים.
         הערה: מאחר שהיבטים רבים של אינטראקציה חברתית מכרסם כרוכים אותות חוש הריח ומריח את השותף, בכל מקום שיש להימנע ריחות זרים מציגים אפשריים. יש חולדות-אוונס ארוכים בדרך כלל כמה תכונה של תבנית הפרווה שיכול להיות מנוצל כדי להבחין כל זוג נתון של בעלי חיים. לזנים אחרים (למשל, Sprague-Dawley חולדות) יכולות לשמש גישות אלטרנטיביות, כגון סימון הזנב עם צבע unscented. חשוב להכיר בכך שהתנהגויות רבות של עניין מופנות למטרות ספציפיות (לדוגמא., Anogenital מושך בנחיר בבימויו ליד בסיס הזנב, התקפות שובבות המכוונות לעורף, או ההתקפות אגרסיביות המכוונות לצלעות או בטן). סימון בעלי החיים קרובים יותר לקצה הזנב רחוק ממטרות של עניין אלה מומלץ.
      4. הקלטת וידאו של האינטראקציה החברתית דקות לפחות 12.
      5. צג בעלי חיים ללחימה לאורך כל הפגישה. במידת האפשר, לצפות בבעלי החיים באמצעות צג או חלון, כך שהנסיין הוא לא בחדר במהלך הפגישה.
         הערה: הלוחם נצפה רק לעתים רחוקות במחקרים על חולדות מבוגרות, לעומת זאת, צריכים להיות במעקב בעלי החיים לאורך כל הפגישה. הפגישה צריכה להיות חדלה אם יש לחימה מוגזמת או יש סימנים של נזק או פגיעה בבעלי חיים.
3. קידוד התנהגות וניתוח.
   1. לזהות את ההתנהגויות של העניין הבא כמו לכל עבודה קודמת עם PAE ^1,18. לכמת את המשך, התדירות והשהיה למופע הראשון של ההתנהגויות הבאות; היאבקות (כולל מצמיד), אגרוף, זחילה (מעבר) מעל / מתחת השותף, anogenital מרחרח, מרחרח אחר בגופו של בן הזוג (גוף מרחרח), allogrooming (טיפוח של השותף), גידול, ומרחרח / חופר בשבבי העץ . דוגמאות של כל התנהגות הן להמחישד ברכיב הווידאו של מאמר זה.
   2. לכמת את ההתנהגויות החברתיות של ריבית מהווידאו. השג את התדירות, משך הזמן כולל והשהיה לערכאה ראשונה לכל התנהגות של עניין.
      הערה: קבלת אמצעים אלה ניתן להשיג באופן ידני, עם זאת, כימות של אמצעים אלה באמצעות ניתוח ממוחשב של וידאו דיגיטלי מומלצת. תסריט Matlab (www.mathworks.com) עבור השמעה של הווידאו וכימות של התנהגויות מסופק כתוספת למאמר זה.
   3. לאחר הקידוד הושלם לכל חולדות נתוני משך, תדירות וזמן אחזור וכתוצאה מכך הם ניתחו עם חבילה סטטיסטית.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

במהלך סיבובי רבייה רבים חולדות נקבות במצב אתנול לשתות באופן עקבי ממוצעת של כ 2.1 גר '/ קילוגרם של אתנול לפגישת שתייה 4 שעות. סכרי עכברוש צורכים כמחצית מכלל ארבע שעות במהלך 15 עד 30 דקות הראשונות לאחר כניסתה של צינורות השתייה, וכתוצאה מכך ריכוז שיא אימהי אתנול בסרום של כ -6...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

הפרדיגמה החשיפה לאלכוהול לפני הלידה המתוארת כאן כרוכה הצריכה מרצון של אתנול (5% v / v) על ידי סכרי עכברוש במהלך הריון. ישנם מספר פרוטוקולים לחשיפת בעלי חיים שאינם בני אדם לאתנול במהלך התפתחות המוח המיוצגת בספרות, אשר נבדלת ביחס לעיתוי, המינון, המשך והמסלול של ממשל אתנול, ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Saccharin sodium salt hydrate	Sigma	S1002
190 proof ethanol	Sigma	493538
Beaded glass drinking tubes	Fisher	14-955K
Natural rubber white #4 stopper one hole	Plasticoid	LSG4M181
1" bend tubes-ball point	Ancare	TD-199-3"
Paper rulers	N/A	N/A	www.vendian.org/mncharity/dir3/paper_rulers
Apparatus for social interaction	Custom built	N/A	95 cm X 47 cm X 43 cm
Video cameras	N/A	N/A	Capable of recording low/no light conditions
Infrared illuminators	Vitek	VT-IR1-12
Teklad laboratory grade sani-chips	Harlan	7090A
Brush and dustpan	N/A	N/A
Isopropyl alcohol	Sigma	W292907
Chlorine Dioxide (1.5 mg Tablets)	Quiplabs	N/A	Prepare per manufacturer's recommendation