Moderate Pränatale Alkoholexposition und Quantifizierung von Sozialverhalten bei erwachsenen Ratten

Zusammenfassung

The goal of the protocol presented here is to describe procedures to expose rats to moderate levels of alcohol during prenatal brain development and to quantify resulting alterations in social behavior during adulthood.

Zusammenfassung

Alterations in social behavior are among the major negative consequences observed in children with Fetal Alcohol Spectrum Disorders (FASDs). Several independent laboratories have demonstrated robust alterations in the social behavior of rodents exposed to alcohol during brain development across a wide range of exposure durations, timing, doses, and ages at the time of behavioral quantification. Prior work from this laboratory has identified reliable alterations in specific forms of social interaction following moderate prenatal alcohol exposure (PAE) in the rat that persist well into adulthood, including increased wrestling and decreased investigation. These behavioral alterations have been useful in identifying neural circuits altered by moderate PAE¹, and may hold importance for progressing toward a more complete understanding of the neural bases of PAE-related alterations in social behavior. This paper describes procedures for performing moderate PAE in which rat dams voluntarily consume ethanol or saccharin (control) throughout gestation, and measurement of social behaviors in adult offspring.

Einleitung

Schätzungsweise 1-5% der Kinder mit Fetal Alcohol Spectrum Disorders (FASDs) ^2, das Fetale Alkoholsyndrom (FAS), Teil FAS (PFA) und alkoholbedingte neurologische Entwicklungsstörungen (Arnds) ³ sind diagnostiziert. Defizite im sozialen Verhalten und Kognition gehören zu den häufigsten unerwünschten Ergebnissen bei Kindern mit FASDs ^4-7 beobachtet. Negative Folgen sind nicht zu schwer pränatalen Exposition Alkohol (PAE), als moderat PAE, die nicht der auffällige morphologische, Verhaltens- und kognitive Defizite Merkmal FAS führt, bei Menschen mit FASDs ^8-10 begrenzt vergleichsweise subtile, aber dennoch anhalt verursachen, Defizite und nicht-menschlichen Tieren zu Ethanol während der Gehirnentwicklung ¹¹ ausgesetzt. Die Bedeutung von Verständnis der Verhaltens-und neurobiologische entsprechenden Folgen moderate PAE wird von aktuellen Schätzungen darauf hinweist, dass die große Mehrheit der FASD Fällen innerhalb weniger s fallen unterstrichenevere Bereich des Spektrums ^12.

Mehrere unabhängige Laboratorien haben Veränderungen in Nagetier Sozialverhalten im Zusammenhang mit Exposition während der Entwicklung des Gehirns Ethanol berichtet, einschließlich verringerte Untersuchung und Zusammenspiel ^1,13-15, veränderte Spiel ^14,16,17, erhöhte aggressive Interaktionen ^17,18, Veränderungen in Reaktion auf soziale Stimuli ^19-21, und Defizite in sozial erworbenen Nahrungspräferenzen und soziale Anerkennung Speicher ^22. Soziales Verhalten Defizite wurden nach Exposition gegenüber Schwer (Blutethanolkonzentrationen (BECs) ~ 300 mg / dl) ^22,23 oder eher moderaten Ethanol (BECs ~ 80 mg / dl) ¹ und in einem breiten Spektrum von Parametern für andere bedeutende beobachtet Faktoren wie Belichtungszeit, Dauer der Exposition, und Alter zum Zeitpunkt der Verhaltensmessung.

Zurück Forschung hat in bestimmten Aspekten der sozialen int gezeigt, dass Änderungeneraction im Erwachsenenalter zu unterscheiden Ratten auf moderatem Niveau von Alkohol aus den Kontrolltieren zu Saccharin ^1,18 ausgesetzt. Insbesondere hat moderate PAE konsequent mit robusten erhöht im Ringen, die Erhöhungen der aggressives Verhalten und geringere soziale Untersuchung (zB Schnupfen des Partners) im Erwachsenenalter legt nahe, in Verbindung gebracht. Da Veränderungen im Sozialverhalten sind zuverlässig Folgen PAE kann die Quantifizierung von Sozialverhalten folgenden PAE Bedeutung für Fortschritte in Richtung auf ein besseres Verständnis der neuronalen Grundlagen der PAE bedingten Veränderungen im Sozialverhalten und der Entwicklung von Interventionsansätze zu halten. Das Ziel dieser Arbeit und der damit verbundenen Video ist zu Anweisungen auf dem moderaten PAE-Protokoll und Methoden zur Quantifizierung von Sozialverhalten bei erwachsenen Nachkommen, aufweisen zuverlässig unterschieden pränatale Alkohol-exponierten von nicht-exponierten Ratten-Nachwuchs.

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Protokoll

Alle hier und im zugehörigen Video beschriebenen Verfahren wurden von den Institutional Animal Care und Verwenden Ausschüsse des Health Sciences Center und dem Hauptcampus der University of New Mexico zugelassen.

1. Die pränatale Exposition Ethanol

1. Erhalten alle notwendigen Materialien und Chemikalien: Saccharin-Natriumsalz-Hydrat, Proof-Ethanol 190 (95% vol), Perlen Glas Trinkröhrchen, Naturkautschuk weiß # 4 Anschlag ein Loch, 1 "gebogenen Rohren-Kugelschreiber, Papier Herrscher von www gedruckt .vendian.org / mncharity / dir3 / paper_rulers /.
2. Erhalten bewährten Erwachsenen Züchter Ratten von einem Händler oder alternative Quelle. Verwenden Long-Evans Züchter für die Methoden und repräsentative Daten in diesem Protokoll vorgestellt. Frauen wiegen 125-150 g und 6-7 Wochen alt bei der Ankunft, dass sie etwa 9-10 Wochen alt zum Zeitpunkt der Zucht sind (Schritt 1.5). Stellen Sie sicher, dass alle potenziellen Dämme Erstgebärenden. Stellen Sie sicher, dass Männer 12Wochen alt bei der Ankunft und 15 Wochen alt zu Beginn des Züchtungsprotokoll.
3. Haus die Tiere einzeln in Kunststoffkäfigen bei 22 ° C auf einer Umkehr 12 Stunden hell / dunkel Zeitplan (Licht an 21.00 bis 09.00 h). Zugang zu Lebensmitteln und Leitungswasser ad libitum während der Studie, darunter in allen Trinkgelage. Lassen Sie mindestens 1 Woche für Akklimatisierung an der Anlage, bevor zu Schritt 1.4.
4. Erhalten Ausgangskörpergewicht für jeden weiblichen Ratte.
5. Werten Sie vor der Schwangerschaft trinken Ebenen bei weiblichen Ratten für 2 Wochen. Führen Sie die Schritte 1.5.1-1.5.6 in Ordnung.
   1. An den Tagen 1 und 2 zu füllen ein Trinkröhrchen, das 0,066% Saccharin-Lösung (ohne Ethanol) in Leitungswasser. Zur Quantifizierung Verbrauch befestigen ein Papier Lineal mit mm Genauigkeit auf den Trinkschlauch vor dem Füllen sie. Verwenden Sie diese Methode, wie sie bei der Messung mit einem Gewicht von Röhrchen Ethanolkonsum zu quantifizieren assoziiert reduziert Fehler. Das Rohr wird auf die 20 mm-Marke auf dem Lineal. Beginnen vierstündigen drinking Sitzungen (Schritte 1.5.1-1.5.6 und 1,7) 1 Stunde nach dem Beginn der Dunkelphase (10.00 h), wenn die Aktivität und Trink Ebenen am höchsten sind.
   2. Am Ende jedes Trinkgelage Quantifizierung des Volumens des Saccharin-Lösung, die verbraucht wurde. Um die Messung zu erleichtern, bestimmen das Volumen der Lösung pro mm auf dem Lineal im Voraus und konvertieren mm bis Bände. Bei den hier empfohlenen Rohren jeweils mm entspricht 0,366 ml.
   3. An den Tagen 3 und 4 zu füllen ein Rohr mit 2,5% Ethanol (v / v) und 0,066% Saccharin-Lösung in Leitungswasser. Am Ende jeder Sitzung Quantifizierung der Menge an Ethanol-Lösung (Gewicht pro kg Körpergewicht), die verbraucht wurde.
   4. Am Tag 5 und danach Füllen eines Rohres mit 5% Ethanol (v / v) und 0,066% Saccharin-Lösung in Leitungswasser. Am Ende jeder Sitzung Quantifizierung der Menge an Ethanol-Lösung (Gewicht pro kg Körpergewicht), die verbraucht wurde.
   5. Nach Abschluss der vor der Schwangerschaft trinken Phase wiegen die Ratten und berechnet den Mittelwert Ethanol consumption und Standardabweichung für die gesamte Gruppe. Ratten, für die bedeuten Verbrauch größer als 1 Standardabweichung über oder unter dem Gruppendurchschnitt aus der Studie, um die Variabilität der freiwilligen Trinken während der Schwangerschaft zu verringern.
   6. Ordnen die verbleibenden Ratten entweder mit dem Saccharin Steuerung oder PAE solchen Bedingungen, dass die vor der Schwangerschaft Trinkpegel so dicht wie möglich für die zwei Gruppen angepasst ist.
6. Innerhalb 1-14 Tage Paar jeweils weiblichen Ratten mit einem bewährten männlichen Züchter. Weibliche Ratten haben während der Brutphase nicht Ethanol konsumieren. Schwangerschaft zu bestätigen durch die Anwesenheit von einer vaginalen Stecker, wiegen die weiblichen Ratte und beherbergen sie einzeln. Dies wird als Schwangerschafts Tag 1. Optional definiert, lassen Sie die weiblichen Ratten mit einem männlichen Züchter für bis zu 5 Tage, nach dem Entfernen der Frauen aus der Studie.
   Hinweis: Da Ethanolkonsum während der Schwangerschaft beginnt um 10:00 h am Tag der Gestation 1 Prüfung auf das Vorhandensein von einer vaginalen Stecker durchgeführt werden sollbis zu diesem Zeitpunkt.
7. Bereitzustellen Ethanol oder Saccharin Lösungen während 4 Stunden pro Tag (1.000 bis 1.400 hr) für die Dauer der Schwangerschaft.
   1. Ab dem Tag der Gestation 1 stellen die weiblichen Ratten mit 0% oder 5% Ethanol und 0,066% Saccharin-Lösung in Leitungswasser auf der Grundlage der Gruppenzuordnung. Sicherzustellen, dass das Volumen der 0% igen Ethanollösung, um Saccharin Kontrollratten vorgesehen ist, um das mittlere Volumen von 5% Ethanol-Lösung von Ethanol Ratten konsumierten abgestimmt. Am Ende jeder Sitzung Quantifizierung der Menge an Ethanol-Lösung (Gewicht pro kg Körpergewicht) oder Saccharin, die verbraucht wurde.
   2. Wiegen Ratten-Muttertiere wöchentlich zu einer Gewichtszunahme von Müttern zu bewerten.
   3. Sorgen für Speis und Leitungswasser jederzeit einschließlich der Trinkgelage.
   4. Hört die Ethanolexposition Verfahren, wenn der Nachwuchs geboren werden. Notieren Sie die Zahl der lebenden Welpen und Welpen Gewichte bei der Geburt. Bestimmen Sie den Tag der Geburt als postnatalen Tag 0.
   5. Cull das Katzenklo zu 10 Welpen um postnatalen Tag 2-3. Versuchen to pflegen eine gleiche Verhältnis von männlichen zu weiblichen Tieren in jedem Wurf. Wenn dies nicht möglich ist, filtern bis 10 Welpen mit einer ungleichen Anzahl von Männchen und Weibchen.
   6. Nehmen pup Gewichte 2-3 Tage nach der Geburt.
   7. Wean die Tiere auf etwa postnatalen Tag 21 bis 24 und Haus in gleichgeschlechtlichen Paaren mit einem Tier aus dem gleichen pränatalen Behandlung Zustand. Verwenden Sie nicht mehr als 1-2 Ratten aus jedem Wurf pro Versuch, potenzielle Wurf Auswirkungen zu begrenzen.

2. Sozialverhalten

1. Erhalten und bereiten alle notwendigen Materialien und Geräte.
   1. Besorgen Sie ein Gerät für die soziale Interaktion. Verwenden Sie eine Kammer mit einem offenen Oberteil Material aufgebaut ist, die leicht zu reinigen und zu desinfizieren ist. Die Vorderseite des Gerätes sollte mit starren transparenten Kunststoff (~ 2 mm Dicke) für die Dreharbeiten abgedeckt werden. Linie die Innenwände und Boden mit transparentem Kunststoff (~ 2 mm Dicke), um bei der Reinigung und Geruchskontrolle zu unterstützen. Platz Spiegeln entlang der Rückseite Innen wall Analyse helfen.
      HINWEIS: Für die repräsentative Daten hier ein benutzerdefiniertes Kammer (95 cm lang x 47 cm breit x 43 cm hoch) mit einer offenen Oberseite und starren transparenten Kunststoff (2 mm Dicke), die die Innenseiten und Boden des Gerätes gemeldet verwendet wurde. Spiegel wurden an der Rückwand angebracht. Die spezifischen Abmessungen und Materialien sind nicht kritisch für die Messung des Sozialverhaltens, aber es wird empfohlen, dass die Abmessungen ausreichend groß, dass eine echte soziale Interaktion gewährleisten können von anderen Verhaltensweisen unterschieden werden können. Das heißt, die Vorrichtung sollte groß genug sein, so dass Tiere nicht immer in unmittelbarer Nähe zueinander.
   2. Erhalten Videokameras in der Lage, Aufnahmen bei geringer oder keiner Lichtverhältnissen wie alle Dreharbeiten mit wenig oder gar kein Umgebungslicht im sichtbaren Spektrum durchgeführt. Stellen Sie sicher, dass die Kamera hat eine hohe Auflösung im Infrarotspektrum jedoch jede Kamera, die Aufnahme bei schlechten Lichtverhältnissen in seiner nativenNacht-Modus oder mit zusätzlicher Infrarot-Strahler sollte ausreichend sein.
   3. Position Infrarotstrahler in der Umgebung der Vorrichtung zur Beleuchtung der Vorrichtung in der Videoaufzeichnung zu verbessern.
   4. Erhalten Laborqualität Hackschnitzel (Espe Chip).
   5. Besorgen Sie sich einen Pinsel, Kehrschaufel, Chlordioxid und Isopropylalkohol (70%) für die Reinigung des Gerätes zwischen den Sitzungen und Geruchskontrolle.
2. Apparat Akklimatisierung und Sozialverhalten
   1. Für diese Phase des Experiments, machen Messungen bei erwachsenen Ratten, die mindestens 90 Tage alt sind.
   2. Vor jeder Sitzung entfernen Sie alle Wald-Chips, wischen Sie das Gerät sauber mit Isopropylalkohol, um Gerüche zwischen den Sitzungen zu steuern und für frische Holzspäne. Sicherzustellen, dass die Holzspäne vollständig bedeckt die Unterseite der Vorrichtung. Reinigen von der Vorrichtung mit einem geeigneten Mittel, wie beispielsweise Chlordioxid, wie nötig.
   3. Für drei aufeinander folgenden Tagen stellen ein Tier und seinem Käfig Kollegen in derKammer für 30 Minuten, um die Tiere an die Vorrichtung zu akklimatisieren. Während der Akklimatisierung Sitzungen alle Raumbeleuchtung ausgeschaltet sind.
   4. Am Ende des dritten Akklimatisierung Sitzung Haus die Tiere einzeln in neue Käfige mit frischer Bettwäsche, Lebensmittel und Wasser für 24 Stunden, um die soziale Interaktion zu motivieren.
   5. Record soziale Interaktion am folgenden Tag 24 Stunden nach Einsetzen der Tiere wurden getrennt.
      1. Entfernen Hackschnitzel aus dem Gerät, Reinigen von mit Chlordioxid, wischen Sie mit Isopropyl-Alkohol, um Gerüche zu kontrollieren, und ersetzen Sie die Holzspäne vor der Sitzung.
      2. Positionieren Sie eine oder mehrere Kameras, um die Interaktion zu erfassen. Position mindestens einer Kamera vor der Vorrichtung, so daß die Spiegel auf der Rückwand der Vorrichtung eine zusätzliche Perspektive für die Analyse bereitzustellen.
      3. Abrufen Tieren ein zu einer Zeit und halten das Tier vor der Kamera, so dass die einzigartigen Eigenschaften des Pelzmuster zu verzeichnen. Diese Identifikationsmerkmale vondas Fell kann verwendet werden, um Ratten während der Analyse und nicht künstlich Kennzeichnung der Tiere zu unterscheiden.
         Hinweis: Da viele Aspekte der Nager soziale Interaktion beinhalten olfaktorischen Signale und riechen Sie den Partner, wo immer möglich, die Einführung fremder Gerüche zu vermeiden. Long-Evans-Ratten haben in der Regel eine Funktion der Fellmuster, die genutzt werden, um eine bestimmte Paar von Tieren zu unterscheiden. Bei anderen Stämmen (zB Sprague-Dawley-Ratten) Alternative Ansätze, wie Markieren der Schwanz mit einem fusselfreien Farbstoff verwendet werden. Es ist wichtig zu erkennen, dass viele Verhaltensweisen von Interesse sind, auf bestimmte Ziele ausgerichtet (z. B. anogenitale Sniffing in der Nähe der Basis des Schwanzes gerichtet, verspielt Angriffe am Nacken oder aggressive Angriffe gegen die Flanken oder Bauch gerichtet). Kennzeichnung der Tiere näher zu der Spitze des Endstücks weit von diesen interessierende Ziele empfohlen.
      4. Nehmen Sie Video von der sozialen Interaktion für mindestens 12 min.
      5. Überwachen Tiere für den Kampf in der gesamten Sitzung. Wenn möglich, beobachten Sie die Tiere über einen Monitor oder ein Fenster, so dass der Versuchsleiter ist nicht im Zimmerpreis während der Sitzung.
         HINWEIS: Bekämpfung wurde nur selten in Studien mit erwachsenen Ratten beobachtet jedoch, sollten die Tiere während der gesamten Sitzung überwacht werden. Die Sitzung sollte beendet werden, wenn es übermäßige Bekämpfung oder Anzeichen von Schäden oder Verletzungen an ein Tier.
3. Verhaltens Codierung und Analyse.
   1. Identifizieren Sie die folgenden Verhaltensweisen von Interesse nach früheren Arbeiten mit PAE ^1,18. Quantifizierung der Dauer, Häufigkeit und Latenzzeit bis zum ersten Auftreten der folgenden Verhaltensweisen; Wrestling (einschließlich Pinning), Boxen, Krabbeln (Kreuzung) über / unter dem Partner, anogenitale Schnupfen, andere Schnüffeln der Körper des Partners (Körper Sniffing) allogrooming (Pflege des Partners), Aufzucht und schnüffeln / Graben in den Holzspänen . Beispiele für jedes Verhalten zu veranschaulichend in der Video-Komponente in diesem Artikel.
   2. Quantifizierung der Sozialverhalten von Interesse aus dem Video. Besorgen Sie sich die Frequenz, Gesamtdauer und Latenz an die erste Instanz für jedes Verhalten von Interesse.
      HINWEIS: Die Beschaffung dieser Maßnahmen kann manuell erreicht werden, aber die Quantifizierung dieser Maßnahmen mit Hilfe computergestützter Analysen der digitalisierten Video empfohlen. Ein Matlab (www.mathworks.com) Skript für die Wiedergabe des Videos und Quantifizierung von Verhalten ist als Ergänzung zu diesem Artikel.
   3. Nach der Codierung wird für alle Ratten beendet die erhaltenen Dauer, Häufigkeit und Latenz-Daten werden mit einem Statistikpaket analysiert.

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Ergebnisse

Im Laufe vieler Zucht Runden weiblichen Ratten in der Ethanol Zustand konsistent trinken durchschnittlich etwa 2,1 g / kg Ethanol pro 4 Stunden Trinkgelage. Ratte Dämme verbrauchen etwa eine Hälfte des vier hr Gesamt während der ersten 15 bis 30 Minuten nach der Einführung der Trinkröhrchen, was zu einem Spitzen mütterlichen Serum Ethanolkonzentration von etwa 60 mg / dl, gemessen in 45 Minuten-Zeitpunkt. Über den verbleibenden 3,5 Stunden des Trink Zeitraums erhalten sie auf 5% Ethanol, bei einer niedrigeren, ab...

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Diskussion

Die hier beschriebene pränatalen Exposition Alkohol Paradigma beinhaltet freiwilligen Verbrauch von Ethanol (5% v / v) von Ratten-Muttertiere während der Schwangerschaft. Es gibt eine Reihe von Protokollen für die während der Entwicklung des Gehirns in der Literatur, die in Bezug auf die Zeitwahl, Dosis, Dauer und Art der Verabreichung Ethanol sowie untersuchten Art unterscheiden dargestellt Belichten nicht-menschlichen Tieren zu Ethanol. Obwohl eine sorgfältige Behandlung der Vorteile der verschiedenen Belichtungs...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Saccharin sodium salt hydrate	Sigma	S1002
190 proof ethanol	Sigma	493538
Beaded glass drinking tubes	Fisher	14-955K
Natural rubber white #4 stopper one hole	Plasticoid	LSG4M181
1" bend tubes-ball point	Ancare	TD-199-3"
Paper rulers	N/A	N/A	www.vendian.org/mncharity/dir3/paper_rulers
Apparatus for social interaction	Custom built	N/A	95 cm X 47 cm X 43 cm
Video cameras	N/A	N/A	Capable of recording low/no light conditions
Infrared illuminators	Vitek	VT-IR1-12
Teklad laboratory grade sani-chips	Harlan	7090A
Brush and dustpan	N/A	N/A
Isopropyl alcohol	Sigma	W292907
Chlorine Dioxide (1.5 mg Tablets)	Quiplabs	N/A	Prepare per manufacturer's recommendation