Moderado pré-natal álcool Exposição e quantificação do comportamento social em ratos adultos

Resumo

The goal of the protocol presented here is to describe procedures to expose rats to moderate levels of alcohol during prenatal brain development and to quantify resulting alterations in social behavior during adulthood.

Resumo

Alterations in social behavior are among the major negative consequences observed in children with Fetal Alcohol Spectrum Disorders (FASDs). Several independent laboratories have demonstrated robust alterations in the social behavior of rodents exposed to alcohol during brain development across a wide range of exposure durations, timing, doses, and ages at the time of behavioral quantification. Prior work from this laboratory has identified reliable alterations in specific forms of social interaction following moderate prenatal alcohol exposure (PAE) in the rat that persist well into adulthood, including increased wrestling and decreased investigation. These behavioral alterations have been useful in identifying neural circuits altered by moderate PAE¹, and may hold importance for progressing toward a more complete understanding of the neural bases of PAE-related alterations in social behavior. This paper describes procedures for performing moderate PAE in which rat dams voluntarily consume ethanol or saccharin (control) throughout gestation, and measurement of social behaviors in adult offspring.

Introdução

Estima-se que 1-5% das crianças são diagnosticadas com Transtornos do Espectro Alcoólico Fetal (FASDs) ^2, que incluem a Síndrome Alcoólica Fetal (SAF), FAS parcial (DFP), e ligados ao álcool neurodesenvolvimento transtornos (Arnds) ^3. Os déficits de comportamento social e cognição estão entre os resultados adversos mais comuns observados em crianças com FASDs ^4-7. Consequências negativas não se limitam a exposição pré-natal pesado de álcool (PAE), como moderado PAE que não leva ao déficit morfológicas, comportamentais e cognitivas conspícua característica do FAS pode causar relativamente sutil, mas mesmo assim persistente, déficit em humanos com FASDs ^10/08 e animais não-humanos expostos ao etanol durante o desenvolvimento do cérebro ^11. A importância de compreender as consequências neurobiológicas e comportamentais correspondentes de moderada PAE é sublinhada pelas estimativas atuais indicam que a grande maioria dos casos FASD estão dentro dos menos severe gama do espectro ^12.

Vários laboratórios independentes relataram alterações no comportamento social roedor relacionadas à exposição ao etanol durante o desenvolvimento do cérebro, incluindo a diminuição da investigação e interação ^1,13-15, alteradas jogo ^14,16,17, aumento das interações agressivas ^17,18, alterações na capacidade de resposta a estímulos sociais ^19-21 e déficits nas preferências alimentares socialmente adquiridos e memória de reconhecimento social ^22. Déficits de comportamento social têm sido observadas após a exposição aos pesados ​​(concentrações de etanol no sangue (CEBs) ~ 300mg / dl) níveis mais moderados de etanol (CEBs ~ 80mg / dl) ¹ ou ^22,23, e através de uma ampla gama de parâmetros para outro significativo fatores, incluindo tempo de exposição, duração da exposição, e idade no momento da medição comportamental.

Pesquisas anteriores já haviam demonstrado que as alterações nos aspectos específicos da int sociaiseraction na idade adulta discriminar ratos expostos a níveis moderados de álcool a partir de animais de controle expostos a sacarina ^1,18. Em particular, moderada PAE tem sido consistentemente associada com aumentos robustos no wrestling, o que sugere aumentos de comportamento agressivo, e níveis mais baixos de investigação social (por exemplo, farejando do parceiro) na idade adulta. Por causa alterações no comportamento social são consequências confiáveis ​​de PAE, a quantificação do comportamento social seguinte PAE pode deter importância para progredir em direção a uma compreensão mais completa das bases neurais de alterações relacionadas à PAE no comportamento social e do desenvolvimento de abordagens de intervenção. O objetivo deste artigo e o vídeo associado é fornecer instruções sobre o protocolo PAE moderada e métodos para a quantificação do comportamento social em filhos adultos que têm seguramente distinguidos pré-natal da prole não expostos ratos expostos ao álcool.

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Protocolo

Todos os procedimentos descritos aqui e no vídeo que o acompanha foram aprovados pelos Comitês de cuidado e uso de animais Institucional do Centro de Ciências da Saúde e do principal campus da Universidade do Novo México.

1. Pré-natal Ethanol Exposição

1. Obter todos os materiais e produtos químicos necessários: Sacarina hidrato de sal de sódio, 190 etanol de prova (95% de álcool por volume), tubos de vidro de consumo de contas, borracha natural branco # 4 rolha de um buraco, um "ponto de dobrar tubos de bola, os governantes de papel impresso a partir www .vendian.org / mncharity / pasta3 / paper_rulers /.
2. Obter ratos comprovadas adulto criador de um fornecedor ou fonte alternativa. Use criadores Long-Evans para os métodos e os dados representativos apresentados neste protocolo. Fêmeas pesam 125-150 g e 6-7 semanas de idade no momento da chegada de tal forma que eles são aproximadamente 9-10 semanas de idade na altura da reprodução (passo 1.5). Assegure-se que todas as barragens prospectivos são mães pela primeira vez. Certifique-se de que os homens são 12semanas de idade no momento da chegada e 15 semanas de idade no início do protocolo de reprodução.
3. Casa os animais individualmente em gaiolas de plástico a 22 ° C em um 12 horas de luz / escuridão cronograma reverso (luzes acesas 21:00-09:00 hr). Proporcionar o acesso a comida e água da torneira ad libitum durante todo o estudo, incluindo durante todas as sessões de consumo. Permitir que pelo menos uma semana para aclimatação à facilidade antes de prosseguir para a etapa 1.4.
4. Obter pesos corporal basal para cada rato fêmea.
5. Avalie os níveis de consumo pré-gravidez em ratas durante 2 semanas. Siga os passos 1.5.1-1.5.6 em ordem.
   1. Nos dias 1 e 2 encher um tubo de beber contendo solução de 0,066% de sacarina (sem etanol) em água da torneira. Para quantificar o consumo de apor uma régua de papel com mm de precisão para o tubo de beber antes de preenchê-lo. Utilizar este método, uma vez que reduz o erro de medição associado com tubos de pesagem para quantificar o consumo de etanol. Encha o tubo até a marca de 20 milímetros na régua. Comece quatro horas drinkisessões ng (passos 1.5.1-1.5.6 e 1,7) 1 h após o início da fase de obscuridade (10:00 horas) quando os níveis de actividade e de consumo são mais elevadas.
   2. No fim de cada sessão de beber quantificar o volume da solução de sacarina que foi consumido. Para facilitar a medição, determinar o volume de solução por mm na régua de antecedência e converter mm para volumes. Para os tubos aqui recomendados cada mm corresponde a 0,366 ml.
   3. Nos dias 3 e 4 encher um tubo com etanol a 2,5% (v / v) e solução de sacarina 0,066% em água da torneira. No fim de cada sessão de quantificar a quantidade de solução de etanol (peso por kg de peso corporal) que foi consumido.
   4. No dia 5 e depois disso encher um tubo com 5% de etanol (v / v) e solução de sacarina 0,066% em água da torneira. No fim de cada sessão de quantificar a quantidade de solução de etanol (peso por kg de peso corporal) que foi consumido.
   5. Após a conclusão da fase de pré-gravidez beber pesar os ratos e calcular o consum média etanolption e desvio padrão para todo o grupo. Remover os ratos para os quais o consumo médio é maior do que um desvio padrão acima ou abaixo da média do grupo do estudo para reduzir a variabilidade na ingestão voluntária durante a gravidez.
   6. Atribuir os ratos restantes, quer o controle sacarina ou condições PAE tais que os níveis de consumo pré-gravidez são correspondidos, tanto quanto possível para os dois grupos.
6. Dentro de 1-14 dias par cada rato fêmea com um macho reprodutor comprovado. Ratas não consomem etanol durante a fase de reprodução. Confirmar gravidez pela presença de um tampão vaginal, pesar o rato fêmea, e abrigar seu individualmente. Isto é definido como o dia gestacional 1. Opcionalmente, deixar as ratas com um reprodutor masculino para até 5 dias, após o que removem as fêmeas do estudo.
   Observação: Como o consumo de etanol durante a gravidez começa às 10:00 h na gestacional dia 1 de inspeção para a presença de um plug vaginal deve ser realizadaantes deste horário.
7. Fornecer soluções de etanol ou a sacarina durante 4 horas por dia (1000 a 1400 h) durante o período da gravidez.
   1. Começando no dia gestacional 1 proporcionar a rata quer com 0% ou 5% de etanol e solução de sacarina 0,066% na água da torneira com base no trabalho de grupo. Certifique-se de que o volume da solução de etanol desde 0% a ratos de controlo sacarina é comparado com a média do volume de solução etanólica a 5% de álcool consumido pelos ratos. No fim de cada sessão de quantificar a quantidade de solução de etanol (peso por kg de peso corporal) ou a sacarina que foi consumido.
   2. Pesar barragens rato semanalmente para avaliar o ganho de peso materno.
   3. Fornecer alimentos e água da torneira em todas as ocasiões, incluindo as sessões de beber.
   4. Cessar os procedimentos de exposição ao etanol quando a prole nascem. Anote o número de filhotes vivos e do peso das crias ao nascer. Designar o dia do nascimento como pós-natal dia 0.
   5. Abater o lixo para 10 filhotes ao redor dia pós-natal 2-3. Tentativa to manter uma proporção igual de macho para fêmeas em cada ninhada. Se isso não for possível, a abater 10 crias com um número desigual de machos e fêmeas.
   6. Grave peso das crias de 2-3 dias após o nascimento.
   7. Desmamar os animais no dia pós-natal aproximadamente 21-24 e casa em pares do mesmo sexo com um animal da mesma condição de tratamento pré-natal. Não use mais de 1-2 ratos de cada ninhada por experimento para limitar os efeitos potenciais de maca.

2. Comportamento Social

1. Obtenha e preparar todos os materiais e equipamentos necessários.
   1. Obter um aparelho para a interação social. Use uma câmara com uma parte superior aberta construída de material que é fácil de limpar e desinfetar. A parte da frente do aparelho deve ser coberto com plástico transparente rígido (~ 2 mm de espessura) para a filmagem. Linha as paredes interiores e chão com plástico transparente (~ 2 mm) para ajudar na limpeza e controle de odor. Coloque espelhos ao longo do wa interior de voltall para auxiliar a análise.
      NOTA: Para obter os dados representativos aqui relatado uma câmara de costume (95 cm de comprimento x 47 centímetros de largura × 43 cm de altura) com uma parte superior aberta e plástico rígido transparente (2 mm de espessura) que cobre o interior eo chão do aparelho foi usado. Espelhos foram colocados ao longo da parede traseira. As dimensões e materiais específicos não são críticos para a medição do comportamento social, no entanto, recomenda-se que as dimensões de ser suficientemente grande para garantir que a interacção social genuíno pode ser distinguido de outros comportamentos. Isto é, o aparelho deve ser suficientemente grande de modo a que os animais não são sempre em estreita proximidade um do outro.
   2. Obter câmeras de vídeo capaz de gravar em condições de baixa ou nenhuma luz como todos filmagens é conduzido com pouca ou nenhuma iluminação ambiente dentro do espectro visível. Certifique-se de que a câmera tem uma resolução alta dentro do espectro infravermelho, no entanto, qualquer câmera capaz de gravar em ambientes escuros em sua nativamodo de noite ou com iluminadores infravermelhos adicionais deve ser suficiente.
   3. Posição iluminadores infravermelhos em todo o aparelho para melhorar a iluminação do aparelho de gravação de vídeo.
   4. Obter lascas de madeira de grau de laboratório (chip Aspen).
   5. Obter uma escova, pá, dióxido de cloro e álcool isopropílico (70%) para a limpeza do aparelho e entre as sessões de controlo de odores.
2. Aclimatação aparelhos e comportamento social
   1. Para esta fase da experiência, fazer as medições em ratos adultos que são pelo menos 90 dias de idade.
   2. Antes de cada sessão remover todas as fichas madeiras, limpe o aparelho limpo com álcool isopropílico para controlar odores entre as sessões e fornecer lascas de madeira frescas. Certifique-se de que as aparas de madeira cobrir totalmente o fundo do aparelho. Limpar e higienizar o aparelho com um agente apropriado, tal como o dióxido de cloro, na medida do necessário.
   3. Durante três dias consecutivos colocar um animal e sua gaiola-mate para ocâmara durante 30 minutos a aclimatar os animais ao aparelho. Durante as sessões de aclimatação todas as luzes da sala estão desligados.
   4. No final da terceira sessão de casa aclimatação os animais individualmente em gaiolas novas com roupas de cama, comida e água durante 24 horas para motivar a interação social.
   5. Interação social Record no dia seguinte 24 horas após os animais foram separados.
      1. Retire as aparas de madeira a partir do aparelho, limpar e higienizar com dióxido de cloro, limpar com álcool isopropílico para controlar odores, e substituir as aparas de madeira antes da sessão.
      2. Coloque uma ou mais câmeras para registrar a interação. Posição, pelo menos, uma câmara em frente do aparelho de modo que os espelhos na parede traseira do aparelho pode proporcionar uma perspectiva adicional para análise.
      3. Recuperar animais um de cada vez e mantenha o animal em frente da câmera para que as características originais do teste padrão da pele pode ser notado. Estes elementos de identificação dea pele pode ser utilizada para distinguir os ratos durante a análise, em vez de marcação artificialmente os animais.
         Nota: Como muitos aspectos do roedor interação social envolvem sinais olfativos e sentir o cheiro do parceiro, sempre que possível odores estranhos introduzem deve ser evitado. Ratos Long-Evans têm tipicamente alguma característica do padrão da pele que podem ser utilizados para distinguir um determinado par de animais. Para outros estirpes (por exemplo, ratos Sprague-Dawley) abordagens alternativas, tais como marcação da cauda com um corante sem perfume pode ser utilizado. É importante reconhecer que muitos comportamentos de interesse são direcionados para alvos específicos (por exemplo., Anogenital sniffing dirigido perto da base da cauda, ​​os ataques lúdicas dirigidas à nuca, ou ataques agressivos dirigidos para os flancos ou barriga). Marcando os animais mais próximo da ponta da cauda longe destes alvos de interesse é recomendada.
      4. Grave vídeo da interação social por pelo menos 12 min.
      5. Monitorar os animais para o combate ao longo da sessão. Se possível, observar os animais através de um monitor ou janela para que o pesquisador não está na sala durante a sessão.
         NOTA: A luta tem sido raramente observada em estudos com ratos adultos, no entanto, os animais devem ser monitorados durante toda a sessão. A sessão deve ser interrompido se houver luta excessiva ou há sinais de danos ou lesões a um animal.
3. Codificação e análise comportamental.
   1. Identificar os seguintes comportamentos de interesse de acordo com o trabalho anterior com PAE ^1,18. Quantificar a duração, frequência e latência para a primeira ocorrência dos seguintes comportamentos; luta livre (incluindo fixando), boxe, rastejando (cruzamento) sobre / sob o parceiro, anogenital sniffing, outro sniffing do corpo do parceiro (corpo sniffing), allogrooming (aliciamento do parceiro), criação e sniffing / cavando as lascas de madeira . Exemplos de cada comportamento são ilustrard no componente de vídeo deste artigo.
   2. Quantificar os comportamentos sociais de interesse do vídeo. Obter a frequência, a duração total e latência para a primeira instância para cada comportamento de interesse.
      NOTA: A obtenção dessas medidas pode ser alcançado manualmente, no entanto, é recomendado quantificação destas medidas, utilizando análises computadorizadas de vídeo digitalizado. Um script Matlab (www.mathworks.com) para a reprodução de vídeo e quantificação dos comportamentos é fornecido como um complemento a este artigo.
   3. Após a codificação é concluída para todos os ratos os dados duração, frequência e latência resultantes são analisados ​​com um pacote estatístico.

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Resultados

Ao longo de muitos ciclos de reprodução ratas na condição etanol beber consistentemente uma média de cerca de 2,1 g / kg de etanol por sessão de beber 4 h. Rato barragens consumir cerca de metade do total de quatro horas durante os primeiros 15 a 30 minutos depois da introdução dos tubos de bebida, resultando numa concentração de etanol no soro materno de pico de cerca de 60 mg / dl, medida no ponto de tempo de 45 min. Durante o restante 3,5 h do período de ingestão, eles continuam a consumir etanol a 5%, a ...

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Discussão

O paradigma de exposição pré-natal álcool descrito aqui envolve o consumo voluntário de etanol (5% v / v) por barragens de rato durante a gravidez. Há um número de protocolos de exposição dos animais não-humanos para etanol durante o desenvolvimento do cérebro representado na literatura, os quais diferem no que diz respeito ao tempo, dose, a duração e via de administração de etanol, bem como as espécies em estudo. Apesar de um tratamento exaustivo das vantagens de vários protocolos de exposição não ?...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Saccharin sodium salt hydrate	Sigma	S1002
190 proof ethanol	Sigma	493538
Beaded glass drinking tubes	Fisher	14-955K
Natural rubber white #4 stopper one hole	Plasticoid	LSG4M181
1" bend tubes-ball point	Ancare	TD-199-3"
Paper rulers	N/A	N/A	www.vendian.org/mncharity/dir3/paper_rulers
Apparatus for social interaction	Custom built	N/A	95 cm X 47 cm X 43 cm
Video cameras	N/A	N/A	Capable of recording low/no light conditions
Infrared illuminators	Vitek	VT-IR1-12
Teklad laboratory grade sani-chips	Harlan	7090A
Brush and dustpan	N/A	N/A
Isopropyl alcohol	Sigma	W292907
Chlorine Dioxide (1.5 mg Tablets)	Quiplabs	N/A	Prepare per manufacturer's recommendation