Modéré exposition prénatale à l'alcool et la quantification du comportement social chez les rats adultes

Résumé

The goal of the protocol presented here is to describe procedures to expose rats to moderate levels of alcohol during prenatal brain development and to quantify resulting alterations in social behavior during adulthood.

Résumé

Alterations in social behavior are among the major negative consequences observed in children with Fetal Alcohol Spectrum Disorders (FASDs). Several independent laboratories have demonstrated robust alterations in the social behavior of rodents exposed to alcohol during brain development across a wide range of exposure durations, timing, doses, and ages at the time of behavioral quantification. Prior work from this laboratory has identified reliable alterations in specific forms of social interaction following moderate prenatal alcohol exposure (PAE) in the rat that persist well into adulthood, including increased wrestling and decreased investigation. These behavioral alterations have been useful in identifying neural circuits altered by moderate PAE¹, and may hold importance for progressing toward a more complete understanding of the neural bases of PAE-related alterations in social behavior. This paper describes procedures for performing moderate PAE in which rat dams voluntarily consume ethanol or saccharin (control) throughout gestation, and measurement of social behaviors in adult offspring.

Introduction

On estime que 1-5% des enfants sont diagnostiqués avec des troubles causés par l'alcoolisation fœtale (ETCAF) ^2, qui comprennent le syndrome d'alcoolisation fœtale (SAF), le SAF partiel (SAFp), et liés à l'alcool troubles neurodéveloppementaux (ARNDs) ^3. Déficits du comportement et de la cognition sociale sont parmi les résultats indésirables les plus fréquemment observés chez les enfants atteints FASDs ^4-7. Conséquences négatives ne sont pas limités à lourde exposition prénatale à l'alcool (PAE), modérée PAE qui ne conduit pas à la remarquable déficits morphologiques, comportementales et cognitives caractéristique du SAF peut causer relativement subtile, mais néanmoins persistante, les déficits dans les humains avec FASDs ^8-10 et des animaux non humains exposés à l'éthanol pendant ¹¹ le développement du cerveau. L'importance de comprendre les conséquences neurobiologiques et comportementales correspondantes de modérée PAE est soulignée par les estimations actuelles indiquent que la grande majorité des cas de l'ETCAF relèvent les moins de sEvere gamme du spectre ^12.

Plusieurs laboratoires indépendants ont signalé des modifications dans le comportement social des rongeurs liés à l'éthanol exposition pendant le développement du cerveau, y compris diminution de l'enquête et de l'interaction ^1,13-15, jeu ^14,16,17 modifié, augmenté interactions agressives ^17,18, modifications de la réactivité aux stimuli sociaux ^19-21, et les déficits dans les préférences alimentaires socialement acquises et la mémoire de reconnaissance sociale ^22. Déficits de comportement social ont été observés après une exposition à lourds (concentrations d'éthanol dans le sang (BEC) ~ 300 mg / dl) ^22,23 ou des niveaux plus modérés de l'éthanol (BEC ~ 80mg / dl) ^1, et à travers un large éventail de paramètres pour autre significatif facteurs y compris le calendrier d'exposition, durée d'exposition, et l'âge au moment de la mesure comportementale.

Des recherches antérieures ont démontré que des altérations dans des aspects spécifiques de int socialeeraction discrimination à l'âge adulte chez les rats exposés à des niveaux modérés d'alcool provenant d'animaux de contrôle exposés à la saccharine ^1,18. En particulier, modérée PAE a toujours été associée à des augmentations robustes en lutte, ce qui suggère une augmentation des comportements agressifs, et des niveaux inférieurs de l'enquête sociale (par exemple, en reniflant du partenaire) à l'âge adulte. Parce que des modifications dans le comportement social sont fiables conséquences de PAE, la quantification du comportement social suivante PAE peut tenir importance pour progresser vers une compréhension plus complète des bases neurales de modifications PAE liées dans le comportement social et le développement d'approches d'intervention. Le but de ce papier et la vidéo associée est de donner des instructions sur le protocole et les méthodes de PAE modérée pour la quantification du comportement social chez les descendants adultes qui ont facilement distingué prénatale exposé à l'alcool à partir enfants non exposés rat.

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Protocole

Toutes les procédures décrites ici et dans la vidéo qui l'accompagne ont été approuvés par les soins et l'utilisation des comités institutionnels animaux de la Health Sciences Center et le campus principal de l'Université du Nouveau-Mexique.

1. prénatale éthanol exposition

1. Obtenir tous les matériaux et produits chimiques nécessaires: saccharine hydrate de sel de sodium, éthanol 190 proof (95% d'alcool par volume), tubes de boire de verre perles, caoutchouc naturel blanc # 4 bouchon à un trou, une «point de pliage tubes-ball, les dirigeants de papier imprimées à partir de www .vendian.org / mncharity / rep3 / paper_rulers /.
2. Obtenir éprouvées rats surgénérateurs adulte auprès d'un fournisseur ou d'une source alternative. Utilisez éleveurs Long-Evans pour les méthodes et les données représentatives présentées dans ce protocole. Les femelles pèsent de 125 à 150 g et 6-7 semaines d'âge à l'arrivée de telle sorte qu'ils sont environ 9-10 semaines au moment de la reproduction (étape 1.5). Veiller à ce que tous les barrages potentiels sont mères pour la première fois. Assurez-vous que les hommes sont 12semaines d'âge à l'arrivée et 15 semaines vieux au début du protocole d'élevage.
3. Maison les animaux individuellement dans des cages en plastique à 22 ° C sur 12 heures de lumière / obscurité horaire inverse (allume 21h00-9h00 h). Fournir un accès à la nourriture et l'eau du robinet ad libitum pendant toute l'étude, y compris pendant toutes les sessions de consommation. Prévoyez au moins 1 semaine pour l'acclimatation à l'installation avant de procéder à l'étape 1.4.
4. Obtenir le poids corporel de référence pour chaque rat femelle.
5. Évaluer les niveaux de consommation d'alcool avant la grossesse chez les rats femelles pendant 2 semaines. Suivez les étapes 1.5.1-1.5.6 dans l'ordre.
   1. Les jours 1 et 2 Remplir un tube potable contenant 0,066% de la saccharine solution (pas d'éthanol) dans l'eau du robinet. Pour quantifier la consommation apposer une règle de papier avec précision mm au tube potable avant de le remplir. Utilisez cette méthode car elle réduit erreur de mesure associée à la pesée des tubes de quantifier la consommation d'éthanol. Remplissez le tube jusqu'à la marque de 20 mm sur la règle. Commencez drinki-quatre heuressessions ng (étapes 1.5.1-1.5.6 et 1,7) 1 h après le début de la phase d'obscurité (10:00 h) lorsque les niveaux d'activité et de consommation sont les plus élevés.
   2. A la fin de chaque session de boisson quantifier le volume de la solution de saccharine qui a été consommé. Pour faciliter la mesure, de déterminer le volume de solution par mm sur la règle à l'avance et à convertir mm volumes. Pour les tubes recommandés ici chaque mm correspond à 0,366 ml.
   3. Les jours 3 et 4 remplir un tube avec 2,5% d'éthanol (v / v) et une solution de saccharine 0,066% dans l'eau du robinet. A la fin de chaque session de quantifier la quantité de solution d'éthanol (poids par kg de poids corporel) qui a été consommé.
   4. Au jour 5 et ensuite remplir un tube avec 5% d'éthanol (v / v) et une solution de saccharine 0,066% dans l'eau du robinet. A la fin de chaque session de quantifier la quantité de solution d'éthanol (poids par kg de poids corporel) qui a été consommé.
   5. À la fin de la phase de pré-grossesse potable peser les rats et calculer la consom éthanol moyenneption et l'écart type pour le groupe entier. Retirer les rats dont la consommation moyenne est supérieure à 1 écart-type au-dessus ou en dessous de la moyenne du groupe de l'étude pour réduire la variabilité dans l'eau potable volontaire pendant la grossesse.
   6. Affectez les rats restants soit le contrôle de la saccharine ou PAE conditions telles que les niveaux de consommation d'alcool avant la grossesse sont appariés aussi étroitement que possible pour les deux groupes.
6. Dans 1-14 jours paire chaque rat femelle avec un mâle reproducteur prouvé. Des rats femelles ne consomment pas d'éthanol pendant la phase de reproduction. Confirmer la grossesse par la présence d'un bouchon vaginal, peser le rat femelle, et la loger individuellement. Ceci est défini comme jour de gestation 1. En option, laisser les rats femelles avec un mâle reproducteur pour un maximum de cinq jours, après quoi enlever les femmes de l'étude.
   NOTE: Parce que la consommation d'éthanol pendant la grossesse commence à 10:00 h sur gestationnel jours une inspection de la présence d'un bouchon vaginal doit être réaliséeavant cette heure.
7. Fournir des solutions d'éthanol ou la saccharine pendant 4 heures par jour (1000 à 1400 hr) pendant la durée de la grossesse.
   1. À partir du jour de gestation fournir une le rat femelle à 0% ou 5% d'éthanol et une solution de saccharine 0,066% dans l'eau du robinet sur la base de l'attribution de groupe. Assurez-vous que le volume de solution d'éthanol à 0% prévu pour les rats témoins saccharine est adaptée au volume moyen de la solution de 5% d'éthanol consommée par les rats de l'éthanol. A la fin de chaque session quantifier la quantité de solution d'éthanol (poids par kg de poids corporel) ou la saccharine, qui a été consommé.
   2. Peser barrages de rat par semaine pour évaluer le gain de poids de la mère.
   3. Fournir de la nourriture et de l'eau du robinet en tout temps, y compris les beuveries.
   4. Cesser les procédures d'exposition d'éthanol lorsque la progéniture est né. Notez le nombre de chiots vivants et du poids des petits à la naissance. Désigner le jour de naissance jour postnatal 0.
   5. Cull la litière à 10 chiots autour de jour postnatal 2-3. Tentative to maintenir un ratio égal d'hommes aux animaux femelles dans chaque portée. Si ce ne est pas possible, abattre 10 chiots avec un nombre inégal de mâles et les femelles.
   6. Enregistrez poids des ratons 2-3 jours après la naissance.
   7. Sevrer les animaux au jour environ 21-24 postnatale et la maison de paires de même sexe avec un animal de la même condition de traitement prénatal. Ne utilisez pas plus de 1-2 rats de chaque portée par expérience pour limiter les effets de la litière potentiels.

2. Comportement social

1. Obtenir et préparer tous les matériaux et l'équipement nécessaires.
   1. Obtenir un appareil pour l'interaction sociale. Utilisez une chambre avec un sommet ouvert construit d'un matériau qui est facile à nettoyer et désinfecter. La face avant de l'appareil devrait être recouverte de plastique rigide transparent (~ de 2 mm d'épaisseur) pour le tournage. Ligne les murs intérieurs et le sol avec du plastique transparent (~ de 2 mm d'épaisseur) pour aider dans le nettoyage et le contrôle des odeurs. miroirs de place le long de la wa intérieur retourll pour faciliter l'analyse.
      NOTE: Pour les données représentatives rapportés ici une chambre de mesure (95 cm de long x 47 cm de large x 43 cm de hauteur) avec un sommet ouvert et plastique transparente rigide (de 2 mm d'épaisseur) couvrant les côtés intérieurs et le plancher de l'appareil a été utilisé. Miroirs ont été placés le long de la paroi arrière. Les dimensions et les matériaux spécifiques ne sont pas critiques pour la mesure du comportement social, cependant, il est recommandé que les dimensions soient suffisamment grands pour se assurer que l'interaction sociale réelle peut être distingué d'autres comportements. Autrement dit, l'appareil doit être suffisamment grand pour que les animaux ne sont pas toujours à proximité immédiate de l'autre.
   2. Obtenir caméras vidéo capable d'enregistrer en conditions de faible ou de non-légers tout le tournage est réalisé avec un éclairage peu ou pas ambiante dans le spectre visible. Veiller à ce que la caméra a une haute résolution dans le spectre infrarouge, cependant, ne importe quel appareil capable d'enregistrer dans des conditions sombres dans son natifmode nuit ou avec des projecteurs à infrarouge supplémentaires devrait être suffisante.
   3. Position illuminateurs infrarouges proches de l'appareil en vue d'améliorer l'éclairage de l'appareil dans l'enregistrement vidéo.
   4. Obtenir des copeaux de bois de qualité de laboratoire (de copeaux de peuplier faux-tremble).
   5. Obtenir une brosse, pelle, le dioxyde de chlore et d'alcool isopropylique (70%) pour le nettoyage de l'appareil entre les sessions et le contrôle des odeurs.
2. Appareil acclimatation et le comportement social
   1. Pour cette phase de l'expérience, effectuer des mesures chez des rats adultes qui sont au moins 90 jours d'âge.
   2. Avant chaque session enlever les bois puces, essuyez l'appareil propre avec de l'alcool isopropylique pour contrôler les odeurs entre les sessions et les copeaux de bois frais. Se assurer que les copeaux de bois couvrent entièrement le fond de l'appareil. Nettoyer et désinfecter l'appareil avec un agent approprié, tel que le dioxyde de chlore, le cas échéant.
   3. Pendant trois jours consécutifs placer un animal et sa cage-mate dans lechambre pendant 30 minutes pour acclimater les animaux dans l'appareil. Pendant les séances d'acclimatation toutes lumières de la salle sont éteintes.
   4. À la fin de la troisième maison de la session d'acclimatation des animaux individuellement dans de nouvelles cages avec litière fraîche, la nourriture et l'eau pour 24 heures pour motiver l'interaction sociale.
   5. Interaction sociale inscrits le jour 24 heures après les animaux ont été séparées.
      1. Retirer les copeaux de bois de l'appareil, nettoyer et désinfecter avec du dioxyde de chlore, essuyer avec de l'alcool isopropylique pour contrôler les odeurs, et de remplacer les copeaux de bois avant la session.
      2. Placez une ou plusieurs caméras pour enregistrer l'interaction. Position au moins une caméra en face de l'appareil de sorte que les miroirs sur la paroi arrière de l'appareil peut fournir une perspective supplémentaire pour l'analyse.
      3. Récupérer animaux un à la fois et de tenir l'animal en face de la caméra de sorte que les caractéristiques uniques de la structure de la fourrure peuvent être notées. Ces caractéristiques d'identification dela fourrure peut être utilisé pour distinguer les rats au cours de l'analyse au lieu de marquage artificiellement les animaux.
         NOTE: Parce que de nombreux aspects de rongeurs interaction sociale impliquent signaux olfactifs et sentir le partenaire, chaque fois que possible l'introduction d'odeurs étrangères doivent être évités. Rats Long-Evans ont typiquement une caractéristique du motif de fourrure qui peut être utilisé pour distinguer ne importe quelle paire donnée d'animaux. Pour les autres souches (par exemple, des rats Sprague-Dawley) approches alternatives telles que le marquage de la queue avec un colorant non parfumé pourraient être utilisés. Il est important de reconnaître que de nombreux comportements d'intérêt sont dirigés vers des cibles spécifiques (par exemple., Anogénitale sniffing dirigés près de la base de la queue, les attaques ludiques dirigées à la nuque, ou des attaques agressives dirigées vers les flancs ou le ventre). Le marquage des animaux plus près de la pointe de la queue loin de ces objectifs d'intérêt est recommandé.
      4. Enregistrement vidéo de l'interaction sociale pendant au moins 12 min.
      5. De surveiller les animaux pour lutter contre toute la session. Si possible, observer les animaux via un moniteur ou une fenêtre de sorte que l'expérimentateur ne est pas dans la salle au cours de la session.
         REMARQUE: Les combats ont été que rarement observées dans les études avec les rats adultes, cependant, les animaux doivent être surveillés pendant toute la session. La séance devrait être cessé se il ya des combats excessifs ou se il ya des signes de sévices ou de blessure d'un animal.
3. Codage et l'analyse comportementale.
   1. Identifier les comportements suivants d'intérêt que par des travaux antérieurs avec PAE ^1,18. Quantifier la durée, la fréquence et la latence de la première apparition des comportements suivants; lutte (y compris épinglant), la boxe, rampant (traversée) sur / sous le partenaire, anogénitale reniflant, autre reniflement du corps du partenaire (corps sniffing), allotoilettage (toilettage du partenaire), l'élevage, et reniflage / creuser dans les copeaux de bois . Des exemples de chaque comportement sont illustrentd dans le composant vidéo de cet article.
   2. Quantifier les comportements sociaux d'intérêt de la vidéo. Obtenir la fréquence, la durée totale et la latence de première instance pour chaque comportement d'intérêt.
      NOTE: L'obtention de ces mesures peut être réalisé manuellement, cependant, la quantification de ces mesures au moyen d'analyses informatisées de vidéo numérisée est recommandé. A Matlab (www.mathworks.com) script pour la lecture de la vidéo et la quantification des comportements est fourni en complément de cet article.
   3. Après le codage est terminée pour tous les rats les données durée, la fréquence et latence résultant sont analysés avec un logiciel statistique.

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Résultats

Au cours de nombreux cycles de reproduction des rats femelles à la condition de l'éthanol boivent régulièrement une moyenne d'environ 2,1 g / kg d'éthanol par session potable de 4 heures. barrages de rats consomment environ la moitié du total de quatre heures au cours de la 15 à 30 premières minutes après l'introduction des tubes de boisson, d'où une concentration maximale de la mère de l'éthanol dans le sérum d'environ 60 mg / dl, mesurée au point de temps 45 min. Au cours de l...

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Discussion

Le paradigme de l'exposition prénatale à l'alcool décrit ici implique la consommation volontaire d'éthanol (5% v / v) par des barrages de rat au cours de la grossesse. Il ya un certain nombre de protocoles pour exposer les animaux non humains à l'éthanol au cours du développement du cerveau représenté dans la littérature, qui diffèrent par rapport au calendrier, la dose, la durée et la voie d'administration de l'éthanol ainsi que les espèces visées par l'enquête. Bien qu'u...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Saccharin sodium salt hydrate	Sigma	S1002
190 proof ethanol	Sigma	493538
Beaded glass drinking tubes	Fisher	14-955K
Natural rubber white #4 stopper one hole	Plasticoid	LSG4M181
1" bend tubes-ball point	Ancare	TD-199-3"
Paper rulers	N/A	N/A	www.vendian.org/mncharity/dir3/paper_rulers
Apparatus for social interaction	Custom built	N/A	95 cm X 47 cm X 43 cm
Video cameras	N/A	N/A	Capable of recording low/no light conditions
Infrared illuminators	Vitek	VT-IR1-12
Teklad laboratory grade sani-chips	Harlan	7090A
Brush and dustpan	N/A	N/A
Isopropyl alcohol	Sigma	W292907
Chlorine Dioxide (1.5 mg Tablets)	Quiplabs	N/A	Prepare per manufacturer's recommendation