פיתוח של מעכבי חלבונים אינטראקציות דרך להחליף: בקשה לעיצוב ומעכבי CDK התחרותי הפיתוח ללא ATP

Summary

We describe implementation of the REPLACE strategy for targeting protein-protein interactions. REPLACE is an iterative strategy involving synthetic and computational approaches for the conversion of optimized peptidic inhibitors into drug like molecules.

Abstract

החלף היא אסטרטגיה ייחודית שפותחה כדי למקד בצורה יעילה יותר אינטראקציות חלבון-חלבון (PPIS). מטרתו להרחיב את שטח יעד סמים זמין על ידי מתן המתודולוגיה משופרת לזיהוי מעכבים לאתרי קישור כזה ושמייצג את רוב המטרות פוטנציאליות לתרופה. המטרה העיקרית של מאמר זה היא לספק סקירה המתודולוגית של השימוש וביישום של האסטרטגיה להחליף הכוללת גישות כימיה חישובית וסינתטיות. להחליף מודגם באמצעות היישום שלה לפיתוח של קינאזות אינה ATP cyclin התחרותי תלויה (CDK) מעכבים כתרופות אנטי-סרטנית. CDKs לעתים קרובות חוסר פיקוח ממשלתי בסרטן ולכן נחשבים כמטרות חשובות לפיתוח תרופות. עיכוב של / cyclin CDK2 בשלב S דווח לקידום אפופטוזיס סלקטיבית של תאים סרטניים באופן עצמאי p53 דרך מסלול E2F1. מיקוד האינטראקציה בין חלבונים בbindin cyclinחריץ גרם (CBG) הוא גישה שתאפשר העיכוב הספציפי של מחזור תא על CDKs תעתיק. CBG מוכר על ידי רצף קונסנסוס נגזר ממצעי CDK וחלבונים המדכאים גידול כינה cyclin מחייב מוטיב (CBM). CBM כבר בעבר מותאם לoctapeptide מp21Waf (HAKRRIF) ולאחר מכן נקטע נוסף לpentapeptide שמירת פעילות מספיק (RRLIF). פפטידים בכלל לא תא חדיר, הם מטבולית לא יציבים ולכן (ההחלפה חלקית עם יגנד חלופות דרך חישובית העשרה) יחליף אסטרטגיה יושמה כדי ליצור יותר מעכבים כמו סמים. האסטרטגיה מתחילה עם העיצוב של פפטידים שבר ligated מעכבים (הטלות) שסלקטיבי לעכב מתחמי CDK / cyclin מחזור התא. הטלות נוצרו על ידי iteratively החלפת שאריות של HAKRRLIF / RRLIF עם בר כמו מולקולות קטנות (מכסת קבוצות), החל מN-הסופית (Ncaps), ואחריו תחליף בC-סופית. תרכובות אלו מתחילות נקודות עבור הדור של מעכבי CDK התחרותיים שאינו ATP כתרופות אנטי-סרטנית.

Introduction

במאמר זה, מקרה של יישום (ההחלפה עם חלופות יגנד חלקיות באמצעות חישובית העשרה) תחליף אסטרטגיה להמיר מעכבי peptidic של אינטראקציות בין חלבונים ליותר מולקולות רלוונטיות pharmaceutically מתואר ^1-3. בעוד PPIs מהווה מקור עשיר אבל underexploited של מטרות פוטנציאליות לתרופה, מתודולוגיות קיימות הן במידה רבה לא מספיק כדי להפוך לנגישים אלה באופן נרחב. אסטרטגיות נוכחיים כולל עיצוב בר מבוסס ^4, הקרנת תפוקה גבוהה ⁵ ופפטידים מהודקים ⁶ סיפקו התקדמות, אך אלה הם במקרים רבים לא יעילות. כתוצאה מכך, נדרשות יותר התקדמות וגישות יעילה יותר. להחליף אומת באופן מלא בפיתוח מעכבי קינאז ששיפרו תכונות כמו סמים ויש להם פוטנציאל להמשך פיתוח כתרופה אנטי-סרטנית. אסטרטגיה זו באה לידי ביטוי בפיתוח מעכבים שאינם ATP של תאCDKs והמחזור כרוך כדלקמן: 1) קבלת מידע מבני 3D באינטראקציות של HAKRRLIF / RRLIF עם cyclin מחייב חריץ; 2) קביעת הגורמים המחייבים החשובים לאינטראקציה פפטיד; 3 חיתוך) של פפטיד N-סופית המכילים גורמים אחד או יותר מחייב; 4) זיהוי חישובית של חלופות מולקולה קטנות פוטנציאליות (חלופות חלקיות יגנד, PLAs) לחלק הקטוע של פפטיד ואשר שומרות על אינטראקציות מפתח של פפטיד האם; 5) סינתזה או המקור מסחרי של PLAs חזה כדי לאגד בשקיקה עם האתר תת הכבוש בעבר על ידי שאריות פפטיד נמחק (ים); 6) סינתזה של מדפדף קשירה של PLAs הטוב ביותר לפפטיד הקטוע באמצעות סינתזת שלב מוצקה; 7) בדיקה של סלטות במבחנה מחייבת או assay הפונקציונלי (קיטוב הקרינה בהקשר / cyclin CDK) ואחריו אפיון נוסף בassay כדאיות תא. ייצוג סכמטי של להחליף strategy מוצג באיור 1. במאמר זה, חזרות של האסטרטגיה להחליף נדונות והבקשה לCDK2 / cyclin תיארה בפירוט. CDKs הם האמינו להיות במישרין או בעקיפין deregulated ברוב המכריע של גידולים ולכן נחשב מטרות תרופה לסרטן מתאים ^7. CDKs דורש שיתוף עם cyclins להפעלה מלאה ולאחר מכן phosphorylate חלבונים עיקריים מעורבים בויסות מחזור תא ^8. שתי קבוצות העיקריות של CDKs הן isotypes השולטים מחסומי מחזור התא [G1 / S (cdk4 / Cyclin D, CDK6 / cyclin D וcdk4 / E cyclin), שלב S (CDK2 / cyclin) וG2 / M (CDK1 / cyclin B)] והרגולטורים של RNA פולימראז באמצעות זירחון (H CDK7 / cyclin, CDK8 C / cyclin, CDK9 / T cyclin). צעד מפתח בהתקדמות שלב S מתרחש כאשר גורם שעתוק E2F1 יוצר מורכב עם חלבוני DP שנקשר ל- DNA ויוזם שעתוק הגנים. CDK2 / cyclin נדרש לנטרל תעתיק E2F1פעילות באמצעות זירחון ויגרום לשחרור של מתחם E2F1-DP והשפלה הבאה שלה. עיכוב של / cyclin CDK2 הוא האמין כדי לשמור על E2F1 במדינה מחויבת DNA שלו שהובילה להפעלה מתמשכת. הרמה כתוצאה של פעילות E2F-1 תעבור את הסף הנדרש כדי לגרום לאפופטוזיס p53 העצמאי לכן מציע אסטרטגיה טיפולית. בשל חוסר פיקוח הממשלתי p53 ומסלולי PRB, רמות גבוהות של E2F-1 לעתים קרובות מתרחש בתאי סרטן ועיכוב של / cyclin CDK2 צריך להוביל לאפופטוזיס סלקטיבי בגידולים ויכולים להיחשב כיעד סרטן תוקף ^7.

מבחינה קלינית מעכבי CDK נחקרו למקד את האתר מחייב ATP השמור ביותר המוביל לחצות תגובתיות בין קינאז החלבון גדול יותר מ -500 בkinome האדם והפוטנציאל הולידו תופעות לוואי ורעילות ^9. גישה חלופית היא לא ATP-עיכוב תחרותי על ידי מיקוד גיוס מצע דרך CBGקיים במקטע רגולציה חיובי cyclin ושלכן ברור ורחוק מATP מחייב אתר ^10,11. CBG הוא בעיקר חריץ הידרופובי נוכחי בcyclin, cyclin D ו- E cyclin והוכח להכיר רצף קונסנסוס מצא במצעים ומדכאי גידול. כפפטיד מבודד, מוטיב cyclin מחייב (CBM) נקשר לCBG והוכח לעכב פעילות קינאז של CDKs מחזור התא. CBM כבר מותאם לoctapeptide (HAKRRLIF, CDK2 / cyclin IC ₅₀ 0.07 ± 0.02 מיקרומטר, cdk4 D / cyclin, IC ₅₀ 0.88 ± 0.34 מיקרומטר) וכמו כן קטוע לpentapeptide מייצג פשרה טובה בין משקל המולקולרי לסמים דמות והעצמה (RRLIF, CDK2 / cyclin IC ₅₀ 1.01 ± 0.17 מיקרומטר, Cdk4 D / cyclin, IC ₅₀ 25.12 ± 2.97 מיקרומטר) ^12,13. CBGs מורכב מכיס הידרופובי המשני קטן עיקרי גדול ואשר גישרו על ידי acidiאזור ג (כולל Glu220, Glu224 וAsp283). הגורמים המחייבים המפתח של HAKRRLIF כוללים אינטראקציה של Ala2 עם אג"ח כיס הידרופובי המשני, זיווג יון מימן ושל Lys3, 4 Arg וArg5 עם האזור חומציים ורמה גבוהה של השלמה של Leu6 וPhe8 עם אתר lipophilic העיקרי. בנוסף, קשרי מימן רבים הם תרמו מעמוד שדרת פפטיד תוך Ile7 פועל כשאריות spacer מאפשרות מגע אופטימלי עם הכיס העיקרי. המצב והאינטראקציות של HAKRRLIF עם CBG מחייב מוצגים באיור 2.

מיקוד האינטראקציה בין חלבונים CBM / CBG יהיה לעכב פעילות קינאז של CDK2 / cyclin, CDK2 / E cyclin & cdk4 / cyclin D וזה צריך לעורר E2F1 אפופטוזיס בתיווך של תאי סרטן בזמן שלא לפגוע בתאים בריאים ^7. למרות פפטידים CBM נגזר הם מעכבים יעילים של CDKs מחזור התא, אין זה סביר שהם יהיו שימושיים כמו תרופות בשל חילוף החומרים שלהםחוסר יציבות וחוסר כללי של חדירות תא. לשם כך, יש לנו ליישם את האסטרטגיה להחליף כדי להמיר מעכבי peptidic החזקים אלה ליותר תרכובות כמו סמים להמשך פיתוח של תרופות אנטי-סרטני ניצול E2F1 deregulated דרך CDK2 / cyclin עיכוב. הפרוטוקול הבא מסכם עבודה שהושלמה ביישום של להחליף לחריץ cyclin. במקרה הראשון, מחליפים קבוצת מכסת כמו סמים לtetrapeptide N- המסוף של HAKRRLIF זוהו. יתר על כן שיפורים בקבוצות אלה נחקרו במחקר אימות נוסף להחלפה. נציגי תוצאות ממחקרים אלה גם מוצגות.

Protocol

1. חישובית זיהוי של פוטנציאל קטן קבוצות מכסת מולקולה

הערה: באופן עקרוני, במגוון שיטות חיפוש עגינה או pharmacophore יכול לשמש כדי לחזות קבוצות מכסת פוטנציאליות. המטרה העיקרית של מחקרים חישובית בREPLACE היא לזהות מולקולות קטנות ששומרות על התכונות ואינטראקציות של חומצות אמינו שהם מחליפים.

1. אימות של פרוטוקול העגינה LigandFit ¹⁴

הערה: במחקרים קודמים, שיטת העגינה (LigandFit ^15, מודול בסוויטת תכנית ההדמיה המולקולרית, גילוי Studio 3.0) קבל תוקף על מנת להבטיח כי אלגוריתם זה הוא מספיק כדי לשחזר מצבים מחייבים של Ncaps הידוע ולהראות שהתוצאות שהתקבלו עבור תרכובות ידועות הן חזויה ^14.

1. באמצעות השלבים (1.2-1.5) הבאים, לזהות פרמטרים אופטימליים לLigandFit כדלקמן: PLP1 enרשת ergy לדור תנוחה, מזעור של תנוחות שנוצרו ואת פונקצית ניקוד PLP1 לניתוח של תנוחות.
2. כדי להגביל את התצורות שהושגו ולמצב את ligands כראוי להיווצרות קשר קוולנטי בפפטיד כתרים, להגדיר את אטומי חנקן וחנקן אמיד אינדול של Trp217 וGln254 בהתאמה כמסנני אינטראקציה לקשרי מימן.
3. עיצוב ולעגן ספרייה של חלופות בר לCDK2 / cyclin קולט (2UUE). לתעדף קבוצות מכסת פוטנציאל לסינתזה ומקור מסחרי המבוסס על ניקוד PLP1, אינטראקציות עם מסנני אינטראקציה והשלמה עם CBG. נדרשים לעגינת LigandFit צעדים השונים הם כדלקמן.

2. הכנת אתר קישור קולט ¹⁴
   1. לייבא CDK2 / cyclin מבנה הגבישי (id PDB: 2UUE) לחלון הדמיה בתוכנה. מבנה זה מכיל FLIP זוהה בעבר 5-מתיל-1-פניל-1H-1, 2,4-3-carboxamido triazole RLIF (3,5-DCPT) קשורה לחריץ cyclin (איור 3).
   2. למחוק או לשמור במקום השאריות RLIF (C-סופית). כאשר רצף הפפטיד נשמר, להשתמש בקבוצת אמינו N-מסוף של פפטיד כמסנן אינטראקציה ליגנד. מכלי "אינטראקציות קולטן ליגנד", ליצור מרחב סביב N-הכובע 3,5-DCPT מתחום / הסתר אתר הצג. תחום נוצר כדי להגדיר את האזור הפעיל באתר הקישור שבו אינטראקציות יגנד-רצפטור מותר להתרחש במהלך מחייב.
   3. הגדר את אתר הקישור נוסף מ" האתר תמצא כנפח של יגנד נבחר "ולמחוק את יגנד 3,5-DCPT מהחלבון. לבצע צעד זה כדי להגדיר את עוצמת הקול של מחייב בתחום יצר.
   4. הגדר את אטומי חנקן וחנקן אמיד אינדול של שאריות Trp217 וGln254 כמסנני אינטראקציה לקשרי מימן. הגדר את מסנני אינטראקציה כל כך שרק מי שתנוחות InteRact עם אטומים של שאריות סט יהיה מסונן בתהליך העגינה לכן שימור אינטראקציות חשובות בתנוחות עגנו.
3. הכנת ligands ¹⁴
   1. עיצוב ספרייה של 100 קבוצות מכסת פוטנציאליות על פי קריטריונים הכוללים משקל מולקולרי של פחות מ -500, נוכחות של קבוצת carboxylate לקשירה עם פפטיד הקטוע וההכללה של קבוצות המתאימות הידרופובי (קבוצת פניל ​​הוחלף) לאינטראקציה אן דר ואלס בכיס המשני כ מוצג בטבלה 1.
   2. בחר טבעות הטרוציקלית לחיקוי אינטראקציות מליטה מימן פפטיד עם Trp217 ומתמירים כלולים להחלפת אינטראקציות יון-זיווג של שרשרות צד בסיסיות של HAKRRLIF. לעגן את ligands כמולקולות אלדהיד בהתאמה, כך שחמצן קרבוניל יכול לקיים אינטראקציה עם אטום החנקן אמיד של Gln254 דומה לשדרת פפטיד בפפטיד ההורה (טבלת 1).
   3. לפני docהמלך, למזער ligands נועד קונפורמציה אנרגיה נמוכה ולהכין במדינת יינון מתאימה באמצעות הפרוטוקול "הכן ligands". צייר ולייצא כובעי N הפוטנציאליים אלה בפורמט של קובץ .sdf בChemDraw לגיליון אלקטרוני לפני מיובא לתוך התוכנה.
      הערה: הכן פרוטוקול ligands משמש כדי למזער את כל הליגנדים שעגנו למדינות האנרגיה הנמוכה ביותר שלהם וחיובי היינון יושמו אטומים הישימים. פרמטרים ברירת מחדל משמשים לצעד זה.
4. עגינה של ligands לCyclin Groove ¹⁴
   1. בחר את שגרת LigandFit מסט פרוטוקול אינטראקציות קולט ליגנד של התוכנה. השתמש בקולט וligands מוכן כקלט לפרוטוקול זה.
   2. לPLP1 בחר ריצות אלה כרשת אנרגיה, ציין כי מציבה להיות אנרגיה ממוזערת וכי מספר התנוחות שנוצרו כ10. השאירו את כל הפרמטרים האחרים בערכי ברירת המחדל.
      הערה: LigandFit הואשיטת עגינה אשר יכול לזהות וליצור תנוחות גבוהות השלמה וזיקה פוטנציאלית עם האתר הפעיל של חלבון באמצעות מסנן השוואת צורה מבוססת אשר בשילוב עם אלגוריתם חיפוש קונפורמציה מונטה קרלו. רשת האנרגיה המשמשת את תכנית העגינה היא שדה הכוח ליצירת אינטראקציות יגנד-רצפטור ותנוחות פוטנציאליות. PLP1 הוא פוטנציאל ליניארי piecewise שדווקא עדיפות לאינטראקציות מליטה מימן ובי סוג אטום PLP מוקצה לכל אטום יגנד שאינו מימן או אטום קולט הלא-מימן.
5. ניתוח התוצאות
   1. במקרה הראשון, תצוגה מהווה בתכנית Visualizer ולאחר מכן מיין לפי יורד ערכים של ציון PLP1. להשתמש בפונקציות ניקוד כגון PLP1 להעריך את הזיקה המחייבת של יגנד עגן מבוסס על יגנד מועמד להוות גיאומטריה ואינטראקציה שאינה קוולנטיים עם מבנה הקולטן היעד.
      שים לב: כאן, פונקצית ניקוד PLP1 נמצאה give את התוצאות הטובות ביותר כפי שהוא כולל הערכה של קשרי מימן.
   2. superimposability) לנתח מבחינה ויזואלית 25% העליונים של תנוחות וכבש עבור 1 עם הקבוצה הידועה מכסת (יש סטייה מרובעת ממוצעת היחסית (RMSD) ערך פחות מ 2 א), 2) מילא מסנני אינטראקציה ו -3) השלמה חזותית עם חריץ cyclin . הוא מקובל שבצורה נכונה עגן פוזה (בהשוואה למבנה ניסיוני) יש ערך RMSD של <2.
   3. לבחון תנוחות להשלמה חזותית, אשר מוגדרת כבעל מילוי יעיל של הכיס מחייב באופן שעולה בקנה אחד עם יחסי מבנה-פעילות ידועות. מסנני אינטראקציה מוגדרים כוללים מגבלות אטום שדורשות קשר מולקולאריים הידוע להיות קריטי לכריכה ו / או נדרשים למצב קבוצת מכסת הפוטנציאלית בגיאומטריה הנכונה לאג"ח אמיד היווצרות. שלוש דוגמאות של תנוחות עגנו של קבוצות מכסת-N פוטנציאל ליצור את קשרי מימן עם interactioמסנני n מוצגים באיור 4.

2. סינתזה ואפיון של קבוצות N -capping פוטנציאליות

1. סינתזה של קבוצות מכסת-N.
2. לסינתזה, להשתמש בכל חומרים מסחריים, ממסים וחומרים כימיים מתחילים כפי שמתקבל. לסנתז קבוצות מכסת-N פוטנציאליות על ידי כימיה קונבנציונלית סינתטית אורגנית (איור 5 ^12,13 לדוגמא).
3. בצע כרומטוגרפיה שכבה דקה (TLC) על סיליקה ג'ל לניטור תגובות.
   1. ממיסים את החומר המוצא ותערובת תגובה (1 מ"ג) בשלב הנייד ולזהות אותם על צלחת TLC באמצעות צינורות נימים.
   2. מניחים את צלחת TLC לתא המכיל שלב נייד (אתיל אצטט והקסאן ביחס 35:65). ברגע שהשלב הנייד מגיע 90% מצלחת TLC, להסיר ואוויר יבש הצלחת.
   3. השתמש באור UV כדי לזהות את תערובות חומר ותגובה החלו ככתמים גלויים. קאלculate _ו R של כל הנקודות (יחס של מרחק שעובר מקום והשלב הנייד).
      הערה: התגובה הושלמה כאשר אין מקום לראות _בו R של החומר מוצא.
4. לאחר השלמת תגובה לעבוד עד תערובת התגובה על ידי הנחת במשפך separatory ושטיפה עם חומצה מימית או פתרון בסיס כמתאים. לאסוף הממס האורגני, להתאדות זה במאייד סיבובי ולייבש את המוצר הגולמי הושג תחת ואקום.
5. ממיסים 500 מ"ג של מוצר גולמי ב 3-5 מיליליטר של ממס המתאים ולהוסיף ל1 גרם של samplet סיליקה או RP18 ויבש תחת אוויר. מניחים את samplet מכיל המוצר הגולמי בסיליקה מחסניות הבזק / RP SNAP ולטהר את החומר הגולמי באמצעות כרומטוגרפיה הבזק ביצועים גבוהים אוטומטית (על פי הפרוטוקול של היצרן) העסקת עמודת G SNAP 100 עם ריצת שיפוע החל מ -6% אתיל אצטט: 94 hexanes% עד 50% אתיל אצטט ו -50% מעל hexanes15 כרכי טור.
6. ייבש את המוצר המטוהר נאסף בממס מבזק כרומטוגרפיה באמצעות מאייד סיבובי על ידי מתאדה כל הממס ליובש ועוד לייבש את המוצר תחת ואקום כדי להסיר את כל השאריות חומר המסה. לבצע אפיון של המוצר המטוהר על ידי NMR, טרשת נפוצה וHPLC אנליטי.
   1. ^ל1 H NMR ו- ¹³ C NMR, שוקל כ 10 מ"ג של המדגם המטוהר, לפזר אותו בממס deuterated מתאים, ולהעביר את התכולה לצינור NMR יבש להקלטת ספקטרום NMR ^2,14.
   2. רשום את H NMR ¹ ו ^-13 ספקטרום NMR C עם שדה גבוה NMR ספקטרומטר (300 MHz המינימום). לרכוש ספקטרום המוני באמצעות (זמן טנדם המרובע-1 של ספקטרומטר מסת טיסה) QTOF, יינון electrospray (ESI) או 70S VG ^2,14 (ספקטרומטר מסת מגזר מגנטי, EI התמקדות-זוגי).
   3. נתח את טוהר של מוצרים על ידי HPLC עם גלאי דיודה-מערך ומצויד בC18 (2) 100, 250 x 4.6 מ"מ, 5 מיקרומטר טור לניתוח. השתמש בריצת שיפוע החל מ- 100% מים (0.1% חומצת trifluoroacetic) לאצטוניטריל 60% (0.1% חומצת trifluoroacetic) מעל 30 דקות ולהחזיק את השיפוע למשך 4 דקות. חלץ את chromatograms ב226 ^ו2,14 254 ננומטר.
      הערה: purities אנליטית של תרכובות הערכה היו> 95%.

3. סינתזה שלב מוצקה לדור של הטלות ²

1. סינתזה של הטלות הכתיר N
   1. להרכיב תרכובות peptidic תרים-N באמצעות שיטות סינתזה מוצק שלב סטנדרטית באמצעות השלבים הבאים.
      1. הפעל 5 שווה של חומצת אמינו C-מסוף (FMOC-Phe) ב4.4 שווה של O -Benzotriazole- N, N, N ', N' -tetramethyl-uronium-hexafluoro-פוספט (HBTU, 221.93 מ"ג) ב 2 מיליליטר של DMF במשך 5 דקות. טען את תערובת HBTU FMOC-Phe על שרף רינק באמצעות 6 שווה של diisopropylethyl אמין (DIPEA, 103.13מ"ג) במשך שעה 1 ב RT.
      2. הסר את קבוצת הגנת FMOC משאריות C-מסוף באמצעות piperidine 20% ב 3 מיליליטר של DMF במשך 10 דקות. חומצות אמינו שלאחר מכן זוג (למשל, FMOC-איל, FMOC-Leu, FMOC-Arg-PMC) צעד אחר צעד. בכל שלב, זוג 5 equiv של חומצת אמינו הבאה באמצעות 6 שווה של DIPEA (103.13 מ"ג) ו -4.4 שווה של HBTU (221.93 מ"ג) ב 2 מיליליטר של DMF עבור שעה 1 ב RT.
      3. החל מחזורי שטיפה (5 x 10 מיליליטר של DMF + 5 x 10 מיליליטר של DCM) לאחר צעדי צימוד חומצת אמינו וdeprotection FMOC שתוארו לעיל. לאחר ההרכבה פפטיד, זוג N-מכסת קבוצות משתמשים 6 שווה של DIPEA (103.13 מ"ג) ו -4.4 שווה של HBTU (221.93 מ"ג) ב 2 מיליליטר של DMF עבור שעה 1 ב RT.
      4. עם השלמת ההרכבה פפטיד, לטפל בתערובת התגובה עם 2 מיליליטר של תערובת המחשוף O (90: 5 5 TFA / H ₂ O / TIPS) / N כדי להסיר שרשרת צד הגנה על קבוצות, ותדבק הטלות מהשרף. Triturate המוצר וכתוצאה מכך עם אתר קר diethyl כדי לזרז ואניתרכיז צורך F במאייד סיבובי.
2. סינתזה של הטלות N-הכתיר כתרים-C
   1. לשקול ולפזר את הפפטיד Arg-Leu N-סופני כתרים ומוגנים (16.1 מ"ג, 0.02 mmol) בdichloromethane, ולהוסיף [4 (3-chlorophenoxy) י.ל.-pyridin-2] methanamine (C-כובע) יחד עם O - benzotriazole- N, N, N ', N' hexafluorophosphate -tetramethyluronium (HBTU; 16.7 מ"ג, 0.02 mmol) ו- N, -diisopropylethylamine N (DIPEA; 6.5 מ"ג, 0.02 mmol).
   2. מערבבים ולעקוב אחר התגובה על RT עד TLC / HPLC מציין את הצריכה של חומר מוצא המלאה. לאחר השלמת התגובה, לרכז את תערובת התגובה גולמי באמצעות מאייד סיבובי ולאחר מכן מחיצה בין אתיל אצטט ומים.
   3. הפרד את השכבה המימית ואורגנית; לשטוף את השכבה האורגנית עם 1 N NaOH, 1 N HCl, ומלח. ייבש את השכבה האורגנית עם על 1 גרם של נתרן גופרתי ולהתרכז המוצר במאייד סיבובי. FINAlly לטפל O המוצר / N עם תערובת המחשוף (95: 2.5: 2.5 חומצת trifluoroacetic / H ₂ O / TIPS) לdeprotection.
   4. Triturate המוצר וכתוצאה מכך עם אתר diethyl קר ואם יש צורך להתרכז במאייד סיבובי כדי להשלים יובש כדי להסיר את כל הממס. נוסף לייבש את המוצר תחת ואקום כדי להסיר את כל השאריות חומר המסה.
3. טיהור ואפיון של הטלות
   1. לטהר הטלות גולמי בשיטות HPLC למחצה preparative ההפוך-שלב. Lyophilize ההטלות המטוהרים ולאפיין המסה המולקולרית שלהם באמצעות ספקטרומטר מסת ^2,14.
   2. לקבוע את טוהר אנליטי של ההטלות על ידי HPLC עם גלאי דיודה-מערך ומצויד בC18 (2) 100, 250 x 4.6 מ"מ, 5 מיקרומטר טור. השתמש בשיטת שיפוע החל מ -95% H ₂ O (0.1% חומצת trifluoroacetic) אצטוניטריל / 5% (0.1% חומצת trifluoroacetic) עד 35% ₂ O (0.1% חומצת trifluoroacetic) אצטוניטריל / 65% (0.1% trifluoroace Hחומצת טיק) מעל 30 דקות ולהחזיק את השיפוע למשך 4 דקות. תמצית chromatograms ב226 ו- 254 ננומטר.

4. הקרינה קיטוב כריכת Assay לקביעה תחרותית כריכת ^2,14

1. בצע את assay ב384 גם שחור (138 μl) צלחות באמצעות ההליך הבא.
2. לדלל את הדגימות, פפטידים נותב (4 ננומטר), ומתחמי קינאז (CDK2 / cyclin - 18 מיקרוגרם / מיליליטר, cdk4 D / cyclin - 37 מיקרוגרם / מיליליטר) לריכוזים הנדרשים במאגר assay (pH 25 מ"מ HEPES 7, 10 מ"מ NaCl, 0.01% Nonidet P-40, dithiothreitol 1 מ"מ (DTT).
3. היטב בכל הצלחת 384 היטב, מוסיף: 5 μl של CDK4D1 או CDK2CA (0.3 מיקרוגרם / מורכב גם מטוהר רקומביננטי אדם קינאז), פתרון מתחם 5 μl, 5 μl של 30 פפטיד נותב ננומטר (fluoresceinyl-Ahx-Pro-אל -Lys-Arg-Arg-Leu- (3ClPhe) -Gly או הפפטיד נותב fluoresceinyl-Ahx-Pro-אל-ליס-Arg-Arg-Leu-Phe-גלאי). השתמש 5 μl של כל DMSO (6%), buffer, נותב וDMSO 5 μl (6%), מורכב קינאז, נותב כבארות שליטה
4. לאחר התוספת של כל הרכיבים, צנטריפוגות הצלחת ב 500 סל"ד דקות 1 (41.16 XG) ב RT ואז דגירה הצלחת עם תסיסה במשך 45 דקות ב RT. באמצעות קורא צלחת multimode וגלאי מצויד ב485 ננומטר / 535 ננומטר עירור / מסנני פליטה ומראה dichroic לקרוא את עוצמת ההעמסה של כל טוב בצלחת.
5. לחשב את הקיטוב היחסי הממוצע (MP) עבור כל דגימות הבדיקה באמצעות המשוואה מראה מתחת. לקבוע IC ₅₀ ערכים על ידי רגרסיה לוגריתמית באמצעות התאמת חברי פרלמנט יחסי ובדיקת ריכוזים.

תוצאות

האינטראקציות של HAKRRLIF עם חריץ cyclin מוצגות באיור 2. שאריות פפטיד המייצגות את הגורמים מחייבים העיקריים כוללות Ala2, Arg4, Leu6 וPhe8 עם שאריות אחרות מתן תרומות קטנות ^12,13,18. במחקר מקרה זה האסטרטגיה להחליף נוצלה כדי למצוא חלופות שבר לשאריות בtetrapeptide N- המסוף של HAKRRLIF, בע?...

Discussion

Targeting protein-protein interactions (PPI) in drug discovery is highly challenging as these typically involve a large shallow contact interface comprised of numerous and diffuse contacts¹⁹. Furthermore, peptidic compounds which inhibit PPI’s that are amenable to drug discovery are problematic due to their higher molecular mass, metabolic instability and poor bioavailability²⁰. Current strategies that have been applied for the development of PPI inhibitors include design of proteomimetics and...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Computational Chemistry
Accelyrs Discovery studio 3.0
Dell Optiplex Workstations
Synthetic Organic Chemistry
Silica gel (GF-254 plates) for TLC, Biotage (Uppsala, Sweden) for flash chromatography, Waters Alliance 2695 HPLC with a 2996 diode-array detector and equipped with a C18 (2) 100 A, 250 x 4.6 mm, 5 μm column (Phenomenox Luna) for purity determination, 1H NMR and 13C NMR spectra were recorded with a Varian Mercury 300 and 400 Spectrometer, respectively. Mass spectra were measured with a Micromass QTOF (Tandem quadruple-1 time of flight mass spectrometer), electrospray ionization (ESI) and VG 70S (Double-focusing magnetic sector mass spectrometer, EI).
Flourescence Polarization Assay
384 micro well plates, Micro pipets	Grenier Bio-one	110256602
CDK4D1 and CDK2CA (well purified recombinant human kinase complex)	BPS Bio Sciences	40094(CDK4/Cyclin D), 41101(CDK2/Cyclin A)
assay buffer (25 nM HEPES pH 7, 10 mM NaCl, 0.01% Nonidet P-40, 1 mM dithiothretiol (DTT))
25 nM HEPES	CALBIOCHEM	375368
NaCl	Fisher	127838
Nonidet P-40	US Biological	N3500
DTT	Aldrich
-70 °C freezer	Revco (Ultima II)
DTX880 multimode detector fitted with 485 nm/535 nm excitation/emission filters and a dichroic mirror suitable for fluorescein	Beckman Coulter, Brea, CA
Cell Culture
96 well plates	Fisher
Frozen stocks of U2OS (osteosarcoma) and DU145 (prostate cancer) cell lines	ATCC
NU serum, DMEM media, trypsin, PEN/STRIP, MTT reagent	Fisher, Life technology, Alfa Aesar
Heamocytometer	VWR
-70 °C freezer	Revco (Ultima II)
Incubator	Thermo electron corporation
Centrifuge	Eppendorf	5804 R
Refrigerator 4-8 °C	Isotemp Fisher
DTX880 multimode detector fitted with 595 nm filter	Beckman Coulter, Brea, CA