Immunostaining לדמיין פיתוח מערכת עצבים Murine מעיים

Summary

The enteric nervous system is formed by neural crest cells that proliferate, migrate and colonize the gut. Neural crest cells differentiate into neurons with markers specific for their neurotransmitter phenotype. This protocol describes a technique for dissecting, fixing and immunostaining of the murine embryonic gastrointestinal tract to visualize enteric nervous system neurotransmitter expression.

Abstract

The enteric nervous system is formed by neural crest cells that proliferate, migrate and colonize the gut. Following colonization, neural crest cells must then differentiate into neurons with markers specific for their neurotransmitter phenotype. Cholinergic neurons, a major neurotransmitter phenotype in the enteric nervous system, are identified by staining for choline acetyltransferase (ChAT), the synthesizing enzyme for acetylcholine. Historical efforts to visualize cholinergic neurons have been hampered by antibodies with differing specificities to central nervous system versus peripheral nervous system ChAT. We and others have overcome this limitation by using an antibody against placental ChAT, which recognizes both central and peripheral ChAT, to successfully visualize embryonic enteric cholinergic neurons. Additionally, we have compared this antibody to genetic reporters for ChAT and shown that the antibody is more reliable during embryogenesis. This protocol describes a technique for dissecting, fixing and immunostaining of the murine embryonic gastrointestinal tract to visualize enteric nervous system neurotransmitter expression.

Introduction

מערכת תפקוד מעי עצבים (ENS), השולטת בתנועתיות, מזין קליטה, וזרימת דם מקומית, היא חיונית לחיים ^1. ENS נוצר על ידי תאים עצביים פסגה (NCC) שמתרבים, להעביר וליישב את הבטן, שבו הם להתמיין הנוירונים הגרעינים המכילים ותאי גלייה. מחלת הירשפרונג (תורשה של מנדל HSCR, באינטרנט באיש), הפרעה מולדת multigeneic עם שכיחות של 1 ב4,000 לידה חי, יכולה להיחשב המחלה אבטיפוס ללימוד היווצרות ENS שיבש. בHSCR, NCC לא מצליח להעביר ולליישב אורכים משתנה של המעי האחורי דיסטלי ^2. בנוסף, במערכת העיכול נפוצה אחרת (GI) פגמים התפתחותיים באוכלוסיית הילדים, כגון מומים אנו-רקטליות, atresias מעיים, והפרעות תנועתיות קשורות עם הפרעות בתפקודים בסיסיים ENS, וצפויה הקשורים בשינויים קלים, אינם מוערכים, אנטומיים ושינויים תפקודיים ב^3-6 ENS. לכן, טכניקות שתאפשרנה לנו להבין את הגורמים התפתחותיים של היווצרות ENS עשויות לשפוך אור על הפתוגנזה וטיפול פוטנציאלי של הפרעות בדרכי עיכול בילדים.

בעקבות הגירה והתישבות, NCC מבדיל לתוך הנוירונים עם סמנים ספציפיים לפנוטיפ העצבי שלהם. נוירונים כולינרגית מהווים כ 60% מתאי עצב מעיים ^7, ויכולים להיות מזוהים על ידי מכתים לacetyltransferase כולין (צ'אט), אנזים הסינתזה להנוירוטרנסמיטר אצטילכולין מעורר. מבחינה הסטורית, מנסה לדמיין נוירונים כולינרגית היו מבולבל על ידי שונה סגוליות אנטיגן של נוגדנים המכוונים נגד מערכת עצבים מרכזית (CNS) צ'אט לעומת מערכת עצבים היקפית (PNS) צ'אט ^8-10. עם זאת, נוגדנים המכוונים נגד צ'אט שליה להכיר שני צ'אט המרכזי והיקפי ^11-13, ויש לנו טכניקות מתוארות לאחרונה המאפשרות לvisualization של נוירונים כולינרגית ENS עם רגישות גבוהה מוקדם יותר בפיתוח מאשר הושג עם קווי כתב צ'אט ^14.

כאן, אנו מציגים טכניקה לנתח, לתקן וimmunostaining של מערכת העיכול עוברי עכברית לדמיין ביטוי עצבי ENS בתאי עצב. למחקרים אלה, שנוצלנו עכברי הצ'אט-Cre הזדווגו עם R26R: בעלי חיים tdTomato לייצר צ'אט-Cre; R26R: floxSTOP עכברי tdTomato (המוגדרים כצ'אט-Cre tdTomato ברחבי כתב היד): floxSTOP. בעלי חיים אלה ולאחר מכן היו הזדווגו עם עכברי כתב צ'אט-GFP הומוזיגוטים, להשיג עכברים להביע שני כתבי ניאון המזהים ביטוי צ'אט ^14. שני בעלי חיים אלה הם כתב על רקע C57BL / 6J והם זמינים מסחריים (ג'קסון מעבדות, בר הרבור, ME).

Protocol

אוניברסיטת ויסקונסין טיפול בבעלי חיים ושימוש הוועדה אישרה את כל הנהלים.

1. הכנה של פתרונות

1. השתמש פוספט 1x שנאגרו (PBS) כחיץ לנתיחה ופתרון שטיפה.
2. הכן סוכרוז 30% על ידי במשקל 30 גרם של סוכרוז ומקום לבקבוק. להוסיף 99 מיליליטר של 1x PBS ולהוסיף 1 מיליליטר 10% אזיד הנתרן. מערבבים היטב עד שכל סוכרוז הוא נמס. עד נדרשת חנות ב 4 מעלות צלזיוס.
3. הכן חסימת פתרון על ידי ערבוב 1x PBS, 3% אלבומין בסרום שור (BSA) ושל 0.1% Triton-X-100. מערבבים היטב ולאחסן במקרר עד צורך.
4. הכן 8% paraformaldehyde פתרון (PFA) ב1x PBS על ידי שקילת הכמות המתאימה של PFA לPBS 1x ולאחר מכן לדגור על 65 מעלות צלזיוס עד שהוא נמס לגמרי. חנות ב -25 aliquots מיליליטר ב-20 ° C במקפיא עד צורך. לדלל את PFA 4% ב- ​​PBS 1x ביום שימוש.

2. העובר וגוט לנתחיון

1. בהתאם למוסדי טיפול בבעלי חיים ושימוש הוועדה אישר פרוטוקולים, להרדים עכבר בהריון בעיתוי ולהעביר את הרחם לקרח קר המכיל 60 מ"מ צלחת פטרי 1x PBS.
2. תחת מיקרוסקופ לנתיחה באמצעות מספריים חדים, לחתוך את דופן הרחם הפתוחה לחשוף את העוברים. הסר את העוברים מן הרחם והמקום ל-60 מ"מ צלחת פטרי המכילה נקייה קר כקרח 1x PBS.
3. להרדים כל עובר על ידי עריפת הראש ב1x קר כקרח PBS. אם אתה משתמש בעכברים מהונדסים המכילים חלבוני ניאון, תחת תאורת הקרינה, לזהות את העוברים מהונדסים החיוביים.
4. לנתח את מערכת עיכול מכל עובר באמצעות מיקרוסקופ לנתיחה. בעזרת מלקחיים בסדר, לכוון את העובר כך שצד השמאל פונה כלפי מעלה וצד ימין הוא נגד החלק התחתון של צלחת פטרי. הסר את קיר הגוף העליון מהעובר כדי לחשוף את האיברים הפנימיים. הכנס מלקחיים עדינים בין קיר גוף גב והאיברים הפנימיים. CrOSS מלקחיים אחד נגד השני בפעולת חיתוך כמו מספריים כדי להסיר את האיברים הפנימיים של העובר.
5. בהמשך תת-לנתח את מערכת העיכול מהאיברים שמסביב ואז למקם את כל מערכת עיכול לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר המכיל קר כקרח 1x PBS.

3. קיבוע של קטעי GI

1. יש לשטוף את כל מערכת עיכול 3 פעמים עם 1x קר כקרח PBS ולאחר מכן להחליף עם PFA 4%. תקן את שטחי GI בצינורות 1.5 מיליליטר microcentrifuge על פלטפורמת נדנדה ב RT תמורת 1.5 שעות. יש לשטוף את שטחי GI 3 פעמים במשך 5 דקות ב RT ולאחר מכן במשך שעה 1 על פלטפורמת הנדנדה. בשלב זה, לאחסן קטעי GI על 4 מעלות צלזיוס בסוכרוז 30% ב 1x PBS המכיל 0.1% אזיד הנתרן עד צורך.
   הערה: לחלופין, לאחסן את העוברים בסוכרוז 30% לשנה עד אחת ללא כל השפעה על שלמות הרקמות. אחסון של הדגימות בסוכרוז 30% מאפשר עיבוד מאוחר יותר של הדגימות או לimmunostaining או לאוקטובר לcryo-מדור שng. לחלופין, להמשיך בפרוטוקול immunostaining מפורט להלן.

4. Immunostaining פרוטוקול

1. אם דגימות אוחסנו ב -30% סוכרוז, לשטוף אותם 3 פעמים במשך 20 דקות ב1x PBS על פלטפורמת נדנדה.
2. מניחים את שטחי GI לפתרון חסימה על פלטפורמת נדנדה 1h ב RT.
3. הסר את פתרון חסימת דגירה שטחי GI עם הכמות המתאימה של נוגדנים עיקריים מדולל חסימת פתרון גם עבור 4 שעות ב RT או O / N ב 4 ° C על פלטפורמת נדנדה. השתמש 1: 1,000 דילול של נוגדן אנושי אנטי-הו (סרום המתקבל ממטופל), 1: 1,000 דילול של נוגדן עוף אנטי-ירוק חלבון פלואורסצנטי (GFP) ו -1: של נוגדן אנטי צ'אט עז 100 דילול.
   הערה: אנו מנצלים נוגדן אנטי-הו אנושי שהושג באופן מקומי ממטופל, לעומת זאת, נוגדנים נגד הו זמינים מסחרי, למשל, עכבר אנטי-הו, (שימוש ב1: 500 דילול).
4. יש לשטוף את שטחי GI ב1x PBS3 פעמים במשך 5 דקות ולאחר מכן עבור שעה 1 ב RT על פלטפורמת נדנדה.
5. החלף את PBS 1x עם נוגדנים משני בדילול 1: 500 בחסימת פתרון על פלטפורמת נדנדה לאו 4 שעות על RT או O / N ב 4 מעלות צלזיוס. השתמש צבע אמין-reactive אנטי אנושי חמור כגון DyLight, Cy2 אנטי-עוף חמור וCy5 אנטי-העז החמור. אם נוגדן אנטי-הו העכבר באמצעות לאחר מכן להשתמש דילול 1: 500 של צבע אמין-reactive החמור אנטי עכבר 405.
   הערה: עוצמת GFP אנדוגני וביטוי tdTomato והבהירות של immunostaining עלייה עם גיל התפתחותי. אנחנו בדרך כלל immunostain אומץ עוברי בנפרד ב0.2 מיליליטר צינורות עם 150 μl של פתרון מכתים במטרה לצמצם את הנפח של נוגדן המשמש וגם כדי להבטיח צביעה יעילה של הרקמות.
6. יש לשטוף את שטחי GI בPBS 3 פעמים 1x למשך 5 דקות ולאחר מכן עבור שעה 1 ב RT על פלטפורמת נדנדה.
7. מניחים כמה טיפות של מדיום הרכבה הקרינה עם DAPI על גבי זכוכית. לטבול את tra GICT להרכבה בינוני הקרינה ולהוסיף מכסה זכוכית ישירות על גבי הרקמה. הקרינה ההרכבה -G הבינוני היא תרכובת מסיס במים המספקת חותם חצי קבוע.
   הערה: הרכבה בינונית הקרינה השימוש כגון Vectashield שהוא גליצרול מבוסס הרכבה בינונית שמונע דהייה וphotobleaching של נוגדנים. שני מוצרים אלה מאפשרים רקמות להיות מאוחסנות במשך תקופות ארוכות של זמן על 4 מעלות צלזיוס.
8. צלם תמונות של כל אחד מfluorophore באמצעות מיקרוסקופ confocal. השתמש באורכי גל עירור לfluorophores ומסננים המועסקים מוצגת בלוח 3.
9. לבצע ניתוח תמונה בעזרת מחשב באמצעות תוכנה מתאימה, בהתאם לסוג של confocal משמש ללכידת תמונות.

תוצאות

שתארנו בעבר את הדור של עכברים המבטאים את שני כתבי ניאון GFP וtdTomato המזהים ביטוי צ'אט ^14. בקצרה, עכברי צ'אט-Cre זווגו עם R26R: floxSTOP: בעלי חיים tdTomato לייצר צ'אט-Cre; R26R: עכברי tdTomato (נקראים צ'אט-Cre tdTomato): floxSTOP. בעלי חיים אלה ולאחר מכן היו הזדוו?...

Discussion

המעבדה ואחרים שלנו הראו כי ליקויים במערכת העיכול בHSCR אינם מוגבלים למעי גס aganglionic אבל הרחיבו proximally, אפילו למעי הדק ganglionated ^5,15,16. שינויים אלה כוללים שינויים בפנוטיפ צפיפות והעצבי העצבי ENS ועשויים להסביר dysmotility שנצפה בחולים עם HSCR. יש לנו מנוצלים הטכניקות לעיל במאמצי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate buffered saline	Oxoid	BR0014G
Sucrose	Fisher	S2
Sodium azide	Fisher	BP9221
Bovine serum albumin	Fisher	BP1605
Triton X-100	Sigma	X100
Paraformaldehyde	Sigma	158127
60 mm Petri dishes	Fisher	FB0875713A
Fluorescence microscope	Nikon	SMZ-18 stereoscope
Dissection microscope	Nikon	SMZ-18 stereoscope
Fine forceps	Fine science tools	11252-20
1.5 ml Eppendorf tubes	VWR	20170-038
Fluoromount-G	SouthernBiotech, Birmingham, AL	0100-01
Glass slides	Fisher	12-550-15
Cover glass	VWR	16004-330
Confocal microscope	Nikon	Nikon A1
Nikon Elements	Nikon