Immunfärbung zu Murine enterische Nervensystem Entwicklung visualisieren

Zusammenfassung

The enteric nervous system is formed by neural crest cells that proliferate, migrate and colonize the gut. Neural crest cells differentiate into neurons with markers specific for their neurotransmitter phenotype. This protocol describes a technique for dissecting, fixing and immunostaining of the murine embryonic gastrointestinal tract to visualize enteric nervous system neurotransmitter expression.

Zusammenfassung

The enteric nervous system is formed by neural crest cells that proliferate, migrate and colonize the gut. Following colonization, neural crest cells must then differentiate into neurons with markers specific for their neurotransmitter phenotype. Cholinergic neurons, a major neurotransmitter phenotype in the enteric nervous system, are identified by staining for choline acetyltransferase (ChAT), the synthesizing enzyme for acetylcholine. Historical efforts to visualize cholinergic neurons have been hampered by antibodies with differing specificities to central nervous system versus peripheral nervous system ChAT. We and others have overcome this limitation by using an antibody against placental ChAT, which recognizes both central and peripheral ChAT, to successfully visualize embryonic enteric cholinergic neurons. Additionally, we have compared this antibody to genetic reporters for ChAT and shown that the antibody is more reliable during embryogenesis. This protocol describes a technique for dissecting, fixing and immunostaining of the murine embryonic gastrointestinal tract to visualize enteric nervous system neurotransmitter expression.

Einleitung

Eine funktionierende enterische Nervensystem (ENS), der Motilität, Nährstoffaufnahme, und lokale Durchblutung steuert, ist lebens ^1. Die ENS wird von Neuralleistenzellen (NCC), die Proliferation, Migration und besiedeln den Darm, wo sie in die Ganglien enthalten Neuronen und Gliazellen differenzieren gebildet. Hirschsprung-Krankheit (HSCR, Online Mendelian Inheritance in Man), ein multigeneic angeborene Störung mit einer Inzidenz von 1 in 4.000 Lebendgeburten, kann als das prototypische Krankheiten für das Studium unterbrochen ENS Bildung werden. In HSCR, NCC nicht zu migrieren und zu kolonisieren variabler Länge des distalen Enddarm ^2. Zusätzlich sind andere gemeinsame gastrointestinale (GI) Entwicklungsstörungen bei Kindern und Jugendlichen, wie anorektalen Fehlbildungen, Darmatresien und Motilitätsstörungen mit Störungen im Grund ENS Funktionen verbunden, und werden wahrscheinlich mit subtilen, unterschätzt, anatomischen Veränderungen und funktionelle Veränderungen in assoziiertdie ENS ^3-6. Daher können Techniken, die uns, die Entwicklungs Determinanten der ENS Bildung verstehen lassen das Licht auf die Entstehung und mögliche Behandlung von GI-Trakt Erkrankungen pädiatrischen vergießen.

Nach der Migration und Besiedlung, unterscheidet NCC in Neuronen mit bestimmten für ihre Neurotransmitter-Phänotyp-Marker. Cholinergen Neuronen umfassen etwa 60% des enterischen Neuronen ⁷ und kann durch Färbung auf Cholinacetyltransferase (ChAT), dem synthetisierenden Enzyms zur exzitatorischen Neurotransmitter Acetylcholin nachgewiesen werden. Historisch versucht visualisieren cholinergen Neuronen wurden von unterschiedlichen Antigen-Spezifität von Antikörpern gegen das zentrale Nervensystem gerichtet verwechselt (CNS) ChAT gegen peripheren Nervensystem (PNS) ChAT ^8-10. Jedoch Antikörper gegen Plazenta ChAT gerichtet erkennen sowohl zentrale und periphere ChAT ^11-13, und wir haben vor kurzem beschriebenen Techniken, die für Visualisierungs ermöglichensierung von ENS cholinergen Neuronen mit hoher Empfindlichkeit früher in Entwicklung, als es mit Chat Reporter Linien ¹⁴ erreicht.

Hier präsentieren wir eine Technik zum Präparieren, Fixierung und Immunfärbung des murinen embryonalen GI-Trakt zu ENS Neurotransmitter Expression in Neuronen zu visualisieren. FloxSTOP:: tdTomato Tiere zu produzieren Chat Cre; R26R: Für diese Studien haben wir ChAT-Cre Mäusen mit R26R gepaart genutzt floxSTOP: tdTomato Mäusen (zB Chat-Cre tdTomato ganzen Manuskript definiert). Diese Tiere wurden dann mit homozygot ChAT-GFP-Reporter Mäusen gepaart, um Mäuse, die sowohl fluoreszierenden Reportern, dass ChAT Ausdruck ¹⁴ erkennen zu erhalten. Diese beiden Reporter Tiere sind auf einem C57BL / 6J Hintergrund und im Handel erhältlich (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME).

Protokoll

Die University of Wisconsin Animal Care und Verwenden Committee genehmigt alle Verfahren.

1. Herstellung der Lösungen

1. Verwenden 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) als Puffer und Dissektion Spüllösung.
2. Bereiten Sie 30% Saccharose von einem Gewicht von 30 g Saccharose und Ort in eine Flasche. In 99 ml 1x PBS und 1 ml 10% Natriumazid. Es wird gründlich gemischt, bis die gesamte Saccharose gelöst. Lagerung bei 4 ° C bis zur Verwendung.
3. Vorbereitung Blockierungslösung durch Mischen 1x PBS, 3% Rinderserumalbumin (BSA) und 0,1% Triton-X-100. Gründlich mischen und im Kühlschrank aufbewahren, bis sie benötigt.
4. Vorbereitung 8% Paraformaldehyd (PFA) Lösung in 1x PBS durch Wiegen der entsprechenden Menge an PFA in 1x PBS gewaschen und dann bei 65 ° C inkubieren, bis es vollständig gelöst ist. Shop in 25 ml-Teilmengen in dem -20 ° C Gefrierschrank bis zum Gebrauch. Verdünnt auf 4% PFA in 1x PBS am Tag der Verwendung.

2. Embryo und Gut DissectIon

1. Gemäß Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt Protokolle, einschläfern zeitlich schwangere Maus und übertragen Sie die Gebärmutter in eine 60 mm Petrischale mit eiskaltem 1x PBS.
2. Unter einem Dissektionsmikroskop mit einer scharfen Schere, schneiden Sie die Gebärmutterwand geöffnet, um die Embryonen aus. Entfernen Sie die Embryonen aus der Gebärmutter und der Ort in ein sauberes 60 mm Petrischale mit eiskaltem 1x PBS.
3. Euthanize jedem Embryo durch Enthauptung in eiskaltem 1x PBS. Wenn Sie mit transgenen Mäusen, fluoreszierende Proteine ​​enthalten, werden unter Fluoreszenzbeleuchtung, identifizieren die positive transgenen Embryos.
4. Präparieren Sie die GI-Trakt von jedem Embryo mit einem Dissektionsmikroskop. Verwendung einer feinen Pinzette, richten den Embryo, so dass die linke Seite nach oben gerichtet ist und die rechte Seite ist an dem Boden der Petrischale. Entfernen Sie die obere Körperwand aus dem Embryo, die inneren Organe aus. Legen feinen Pinzette zwischen der dorsalen Körperwand und der inneren Organe. Cross die Zange gegeneinander in einer scherenartigen Schneidwirkung auf die inneren Organe aus dem Embryo zu entfernen.
5. Weitere Unter sezieren die GI-Trakt entfernt von den umliegenden Organe und legen Sie dann jedes GI-Trakt in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit eiskaltem 1x PBS.

3. Fixierung der GI Tracts

1. Mit eiskaltem 1x PBS spülen jedes GI-Trakt 3 mal und dann mit 4% PFA ersetzen. Befestigen Sie die Verdauungstrakt in den 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen auf einem Wippschüttler bei RT für 1,5 Std. Spülen Sie den Verdauungstrakt 3 mal für 5 min bei RT und dann für 1 Stunde auf dem Wippschüttler. In dieser Phase speichert die Verdauungstrakt bei 4 ° C in 30% Saccharose in 1 × PBS mit 0,1% Natriumazid, bis sie benötigt.
   HINWEIS: Sie speichern die Embryonen in 30% Sucrose für bis zu einem Jahr ohne irgendeine Wirkung auf die Integrität der Gewebe. Lagerung der Proben in 30% Saccharose ermöglicht die spätere Verarbeitung der Proben entweder Immunofärbung oder in OCT für Cryo-sectioning. Alternativ fahren Sie mit dem unten beschriebenen Immunfärbung Protokoll.

4. Immunfärbung Protocol

1. Wenn Proben in 30% Saccharose gespeichert worden ist, spülen Sie sie 3-mal für 20 min in 1x PBS auf einem Wippschüttler.
2. Legen Sie die Verdauungstrakt in Blocking-Lösung auf einem Wippschüttler für 1 h bei RT.
3. Entfernen Sie die Blockierlösung und Inkubation der Verdauungstrakt mit der entsprechenden Menge des primären Antikörper in Blockierungslösung entweder für 4 h bei RT oder O / N bei 4 ° C auf einem Wippschüttler verdünnt. Verwenden Sie 1: 1000-Verdünnung von menschlichen Anti-Hu-Antikörper (Serum von Patienten gewonnen), 1: 1000-Verdünnung von Huhn anti-grün fluoreszierende Protein (GFP) Antikörper und 1: 100 Verdünnung von Ziegen-Anti-ChAT-Antikörper.
   ANMERKUNG: Wir verwenden einen menschlichen Anti-Hu-Antikörper, der lokal von einem Patienten erhalten wurde, jedoch sind Anti-Hu-Antikörper im Handel erhältlich, beispielsweise Maus-Anti-Hu, (Einsatz bei 1: 500 Verdünnung).
4. Spülen Sie die Verdauungstrakt in 1x PBS3 mal für 5 min und dann für 1 h bei RT auf einer Schüttelplattform.
5. Ersetzen Sie die 1x PBS mit Sekundärantikörper 1: 500 verdünnt in Blockierungslösung auf einem Wippschüttler für entweder 4 h bei RT oder O / N bei 4 ° C. Verwenden Esel anti-human aminreaktiven Farbstoff wie DyLight, Esel anti-Huhn Cy2 und Esel anti-Ziege Cy5. Bei Verwendung der Maus-Anti-Hu-Antikörper dann mit einem 1: 500 Verdünnung der Esel anti-Maus-Amin-Reaktivfarbstoff 405.
   HINWEIS: Die Intensität des endogenen GFP und tdTomato Expression und die Klarheit der Immunsteigerung mit Entwicklungsalter. Wir typischerweise um die Antikörpervolumen zu reduzieren und auch um eine effiziente Färbung des Gewebes sicherzustellen Immunfärbung embryonalen Eingeweide einzeln in 0,2 ml-Röhrchen mit 150 & mgr; l Färbelösung.
6. Spülen Sie die Verdauungstrakt in 1x PBS 3 mal für 5 Minuten und dann für 1 h bei RT auf einem Wippschüttler.
7. Legen Sie ein paar Tropfen Fluoreszenz Eindeckmedium mit DAPI auf einen Objektträger. Tauchen Sie die GI-tract in die Fluoreszenz Eindeckmedium und fügen Sie ein Deckglas direkt auf das Gewebe. Die Fluoreszenz Eindeckmediums -G eine wasserlösliche Verbindung, die eine semi-permanente Abdichtung bietet.
   HINWEIS: Verwenden Sie Fluoreszenz Eindeckmedium wie Vectashield das eine Glycerin basierte Einschlussmittel, das Verblassen und Photobleichen von Antikörpern verhindert ist. Beide dieser Produkte ermöglichen Gewebe für längere Zeiträume bei 4 ° C gelagert werden.
8. Machen Sie Bilder von jedem Fluorophor mit einem konfokalen Mikroskop. Verwenden Anregungswellenlängen für Fluorophore und verwendeten Filter in Tabelle 3 dargestellt.
9. In die computergestützte Bildanalyse unter Verwendung geeigneter Software in Abhängigkeit von der Art des konfokalen verwendet, um Bilder zu erfassen.

Ergebnisse

Wir haben bereits beschrieben die Erzeugung von Mäusen, die sowohl GFP und tdTomato fluoreszierenden Reportern, dass ChAT Ausdruck ¹⁴ zu erkennen. FloxSTOP:: Kurz gesagt, wurden Chat Cre Mäusen mit R26R gepaart tdTomato Tiere zu produzieren Chat Cre; R26R: floxSTOP: tdTomato Mäusen (genannt ChAT-Cre tdTomato). Diese Tiere wurden dann mit homozygot ChAT-GFP-Reporter Mäusen gepaart. Embryos wurden isoliert und Gewebe wurden vor ihrer festen sezi...

Diskussion

Labor und andere haben gezeigt, dass Darmfehlern HSCR sind nicht auf die aganglionären Kolon sogar ins ganglionated Dünndarm ^5,15,16 beschränkt, sondern proximal verlängert. Diese Veränderungen umfassen Veränderungen der ENS neuronalen Dichte und Neurotransmitter-Phänotyp und können für Motilitätsstörungen, die bei Patienten mit HSCR beobachtet wurde, Rechnung zu tragen. Wir haben die oben genannten Techniken in unseren Bemühungen, die Determinanten der ENS Bildung verstehen genutzt. Insbesondere ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate buffered saline	Oxoid	BR0014G
Sucrose	Fisher	S2
Sodium azide	Fisher	BP9221
Bovine serum albumin	Fisher	BP1605
Triton X-100	Sigma	X100
Paraformaldehyde	Sigma	158127
60 mm Petri dishes	Fisher	FB0875713A
Fluorescence microscope	Nikon	SMZ-18 stereoscope
Dissection microscope	Nikon	SMZ-18 stereoscope
Fine forceps	Fine science tools	11252-20
1.5 ml Eppendorf tubes	VWR	20170-038
Fluoromount-G	SouthernBiotech, Birmingham, AL	0100-01
Glass slides	Fisher	12-550-15
Cover glass	VWR	16004-330
Confocal microscope	Nikon	Nikon A1
Nikon Elements	Nikon