Fare Enterik Sinir Sistemi Geliştirme gözünüzde canlandırın için immün

Özet

The enteric nervous system is formed by neural crest cells that proliferate, migrate and colonize the gut. Neural crest cells differentiate into neurons with markers specific for their neurotransmitter phenotype. This protocol describes a technique for dissecting, fixing and immunostaining of the murine embryonic gastrointestinal tract to visualize enteric nervous system neurotransmitter expression.

Özet

The enteric nervous system is formed by neural crest cells that proliferate, migrate and colonize the gut. Following colonization, neural crest cells must then differentiate into neurons with markers specific for their neurotransmitter phenotype. Cholinergic neurons, a major neurotransmitter phenotype in the enteric nervous system, are identified by staining for choline acetyltransferase (ChAT), the synthesizing enzyme for acetylcholine. Historical efforts to visualize cholinergic neurons have been hampered by antibodies with differing specificities to central nervous system versus peripheral nervous system ChAT. We and others have overcome this limitation by using an antibody against placental ChAT, which recognizes both central and peripheral ChAT, to successfully visualize embryonic enteric cholinergic neurons. Additionally, we have compared this antibody to genetic reporters for ChAT and shown that the antibody is more reliable during embryogenesis. This protocol describes a technique for dissecting, fixing and immunostaining of the murine embryonic gastrointestinal tract to visualize enteric nervous system neurotransmitter expression.

Giriş

Motilite, besin emilimini ve lokal kan akımını kontrol eden işleyen Enterik Sinir Sistemi (ENS), hayat ¹ esastır. ENS, göç ve gangliyon içeren nöron ve glial hücreleri ayırt gut, kolonize çoğaltacak nöral tepe hücreleri (NCC) oluşturulmaktadır. Hirschsprung Hastalığı (Man HSCR Online Mendel Kalıtım), 1 4,000 canlı doğumda bir insidans ile multigeneic konjenital bozukluk, kesintiye ENS oluşumunu incelemek için prototipik hastalık olarak kabul edilebilir. HSCR yılında KKK göç ve distal hindgut ² değişken uzunlukta kolonize başarısız. Ayrıca, diğer ortak gastrointestinal sistem (GİS) gibi anorektal malformasyon, bağırsak atreziler ve motilite bozuklukları gibi pediatrik popülasyonda gelişimsel bozukluklar, temel ENS fonksiyonları bozuklukları ile ilişkilidir ve muhtemelen ince, underappreciated, anatomik değişiklikler ve fonksiyonel değişiklikler ile ilişkilidirENS ^3-6. Bu nedenle, bize ENS formasyonunun gelişimsel belirleyicilerini anlamak için izin teknikleri patogenez ve pediatrik GI bozukluklarının olası tedavisi ışık tutabilir.

Göç ve kolonizasyon sonrasında, KKK kendi nörotransmitter fenotip için özel işaretleri ile nöronların içine ayırır. Kolinerjik nöronlar, enterik nöronların ^7, yaklaşık% 60 ihtiva eder ve kolin asetiltransferaz (ChAT), uyarıcı nörotransmiter asetilkolin için sentezleme enzimi için lekeleme ile tespit edilebilir. Tarihsel olarak, kolinerjik sinir hücreleri merkezi sinir sistemi karşı yönelik antikorların antijen özelliği farklı karmakarışık edildi görselleştirmek için çalışır (CNS) ^8-10 ChAT periferal sinir sisteminin (PNS) karşı ChAT. Bununla birlikte, plasental ChAT'nin karşı yönlendirilen antikorlar, hem merkezi hem periferik ChAT ^11-13 tanır, ve Visua izin en son tarif edilen teknikler varYüksek hassasiyetle ENS kolinerjik nöronların katmanlara ayrılmasına önceki gelişim ChAT raportör hatları ¹⁴ ile elde edilmiş daha.

Burada, biz, diseksiyon nöronlarda ENS nörotransmitter ifadesini görselleştirmek için fare embriyonik gastrointestinal sabitleme ve immün için bir teknik sunuyoruz. Üretmek için tdTomato hayvanlar ChAT-Cre; R26R: floxSTOP: Bu çalışmalar için, R26R ile birleşir ChAT Cre fareler kullanmışlardır floxSTOP (yazının içinde ChAT Cre tdTomato olarak tanımlanır) tdTomato fareler. Bu hayvanlar daha sonra ChAT ifadesini ¹⁴ tespit floresan gazetecilere hem ifade fareler elde etmek için, homozigot ChAT-GFP muhabiri fareler ile evlendirilen bulundu. Bu iki raportör hayvanlar, bir C57BL / 6J background ve ticari olarak (Jackson Laboratuarları, Bar Harbor, ME) mevcuttur.

Protokol

Wisconsin Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi Üniversitesi bütün prosedürleri onayladı.

Çözümler 1. Hazırlanması

1. Diseksiyon tamponu ve durulama çözeltisi olarak 1 x fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) kullanın.
2. Bir şişeye, sükroz ve yeri 30 g ağırlığındaki% 30 sukroz hazırlayın. 1x PBS 99 ml ilave edilir ve 1 ml% 10 sodyum azit ilave edin. Sükrozun tüm çözünene kadar iyice karıştırılır. 4 ° C'de saklayın kadar gerekli.
3. 1 x PBS,% 3 bovin serum albümini (BSA) ve% 0.1 Triton-X-100, karıştırılarak Bloke edici çözelti hazırlayın. İyice karıştırın ve gerektiği kadar buzdolabında saklayın.
4. 1x PBS içine PFA uygun miktarda tartılarak 1x PBS içinde% 8 paraformaldehit (PFA) çözeltisi hazırlayın ve tamamen eriyene kadar sonra 65 ° C de inkübe edilir. -20 ° C dondurucu içinde 25 mi alikotlar içinde gerekli olana kadar saklayın. Kullanım gününde 1 PBS içinde% 4 PFA seyreltin.

2. Embriyo ve Gut Dissectiyon

1. Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu uyarınca protokolleri onayladı, zaman aşımına gebe fare euthanize ve PBS 1x 60 mm Petri içeren buz soğuk içine rahim aktarın.
2. Keskin bir makas kullanarak bir diseksiyon mikroskobu altında, embriyolar maruz açık rahim duvarına kesti. PBS 1x buz soğuk içeren temiz bir 60 mm Petri kabı içine rahim ve yerden embriyolar çıkarın.
3. Buz gibi soğuk 1x PBS dekapitasyon her embriyo Euthanize. Eğer floresan proteinleri içeren transgenik fareler kullanıyorsanız, floresan aydınlatma altında, pozitif transgenik embriyolar tespit.
4. Bir diseksiyon mikroskobu kullanarak her embriyo gastrointestinal sistem parçalara ayır. Ince forseps kullanarak, sol taraf yukarı bakacak ve sağ taraf Petri kabı tabanına karşı olacak şekilde embriyoyu yönlendirin. Iç organları ortaya çıkarmak için embriyo üst beden duvarı çıkartın. Dorsal vücut duvarı ve iç organlar arasında ince forseps yerleştirin. Crembriyo iç organları kaldırmak için bir makas gibi kesici eylem birbirlerine karşı forseps Öss.
5. Bundan başka çevre organlara uzak gastrointestinal sistem alt incelemek ve sonra buz soğukluğunda 1x PBS içeren bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içine, her gastrointestinal sistem yerleştirin.

GI yolları 3. Sabitleme

1. Buz gibi soğuk 1x PBS ile her GI 3 kez durulayın ve ardından% 4 PFA ile değiştirin. 1.5 saat boyunca oda sıcaklığında sallanan bir platform üzerinde bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüplerine GI yolları düzeltildi. Sallanan bir platform üzerinde 1 saat süre ile sonra da RT'de GI yollar 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın ve. Bu aşamada, gerekli olana kadar 1 x PBS,% 0.1 sodyum azid ihtiva eden% 30 sukroz içinde 4 ° C de gastrointestinal yolları saklayın.
   NOT: Alternatif olarak, dokuların bütünlüğü üzerinde herhangi bir etkisi olmaksızın bir yıla kadar% 30 sakaroz embriyolar saklayın. % 30 sukroz içinde numunelerin depolama immün ya da Ekim içine kriyo-sectioni için, ya numune, daha sonra işleme izinng. Alternatif olarak, aşağıda ayrıntılı immün protokolü ile devam edin.

4. immün Protokolü

1. Numuneler% 30 sukroz içinde depolanmış olursa, sallanan bir platform üzerinde onlara 1x PBS içinde 20 dakika boyunca 3 kez yıkayın.
2. Oda sıcaklığında 1 saat için sallanan bir platform üzerinde çözüm engelleme içine GI yolları yerleştirin.
3. Bloke çözeltisi çıkarın ve sallanan bir platform üzerinde 4 ° C'de oda sıcaklığında ya da O / N 4 saat ya da çözüm engelleme seyreltilmiş birincil antikor uygun miktarda gastrointestinal yolları inkübe edin. (Hastadan elde edilen serum) insan anti-Hu antikorun 1000 seyreltme, 1:, tavuk anti-yeşil flöresanlı protein (GFP), antikorun 1000 seyreltme 1: keçi anti-ChAT antikor 100 seyreltme 1 kullanın.
   NOT: bir hastadan elde lokal olarak elde edilen bir insan anti-Hu antikoru kullanan, ancak, anti-Hu, örneğin, ticari olarak temin edilebilir, fare anti-Hu, (1 de kullanımı: 500 seyreltme).
4. 1x PBS GI yollarını durulayın3 kez 5 dakika boyunca ve daha sonra bir sallanan platform üzerinde oda sıcaklığında 1 saat karıştırıldı.
5. 1 seyreltilmiş sekonder antikor ile 1X PBS yerine: 500, 4 ° C'de, oda sıcaklığında ya da O / N oranında ya da 4 saat için sallanan bir platform üzerinde çözüm engelleme. Örneğin DyLight, eşek anti-tavuk 2'ye ait ve eşek anti-keçi Cy5 olarak eşek anti-insan amin reaktif boya kullanın. Eşek anti-fare amin-reaktif boya 405: 500 oranında seyreltilmiş kullanılarak fare anti-Hu antikor, bir 1 kullanın.
   NOT: Endojen GFP ve tdTomato ifade ve gelişimsel yaşla birlikte artış immün açıklık yoğunluğu. Bu, tipik olarak dokuların etkin boyama sağlamak için de kullanılabilir antikorun hacmini azaltmak ve amacıyla tek tek boyama çözeltisi 150 ul 0.2 ml tüpler embriyonik bağırsaklar immunostain.
6. 5 dakika boyunca 1 x PBS 3 kez GI yolları yıkayın ve daha sonra bir sallanan platform üzerinde oda sıcaklığında 1 saat karıştırıldı.
7. Bir cam slayt üzerine DAPI ile, floresan montaj ortamına bir kaç damla yerleştirin. GI tra daldırınfloresan montaj ortamına ct ve doku üzerine direkt olarak cam kapak ekleyin. Orta -G monte floresans yarı kalıcı bir sızdırmazlık sağlayan, suda çözünebilir bir bileşiktir.
   NOT: Vectashield gibi kullanın floresan montaj orta solma ve antikorların photobleaching engelleyen orta montaj tabanlı bir gliserol olduğunu. Her iki ürün de dokular 4 ° C'de uzun bir süre boyunca saklanabilir olanak tanır.
8. Konfokal mikroskop kullanılarak floroforun her görüntüleri yakalayın. Tablo 3'te sunulan fluorophores ve kullanılan filtreler için uyarım dalga boylarını kullanarak.
9. Görüntü yakalamak için kullanılan konfokal türüne bağlı olarak uygun yazılım kullanılarak bilgisayar destekli görüntü analiz gerçekleştirin.

Sonuçlar

Biz daha önce ChAT ifadesini ¹⁴ tespit GFP ve tdTomato floresan gazetecilere hem ifade farelerin nesil tarif var. FloxSTOP: Kısaca, ChAT-Cre fareler R26R ile evlendirilen edildi üretmek için tdTomato hayvanlar ChAT-Cre; R26R: floxSTOP: (ChAT-Cre tdTomato denir) tdTomato fareler. Bu hayvanlar daha sonra homozigot ChAT-GFP muhabiri fareler ile evlendirilen bulundu. Embriyolar izole edildi ve dokular sabit edilmeden önce kesilir ve Tablo...

Tartışmalar

Laboratuvarımız ve diğerleri HSCR bağırsak kusurlar bile ganglionated ince bağırsağın ^5,15,16 içine aganglionik kolon sınırlı ama proksimale genişletilmiş olmadığını göstermiştir. Bu değişiklikler ENS nöronal yoğunluğu ve nörotransmiter fenotip değişiklikleri içerir ve HSCR hastalarda gözlenmiştir dismotilite sorumlu olabilir. Biz ENS formasyonu belirleyicilerini anlamak için çabalarımızı yukarıdaki teknikleri kullanmış olurlar. Spesifik olarak, bu teknikler, nöronal n...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate buffered saline	Oxoid	BR0014G
Sucrose	Fisher	S2
Sodium azide	Fisher	BP9221
Bovine serum albumin	Fisher	BP1605
Triton X-100	Sigma	X100
Paraformaldehyde	Sigma	158127
60 mm Petri dishes	Fisher	FB0875713A
Fluorescence microscope	Nikon	SMZ-18 stereoscope
Dissection microscope	Nikon	SMZ-18 stereoscope
Fine forceps	Fine science tools	11252-20
1.5 ml Eppendorf tubes	VWR	20170-038
Fluoromount-G	SouthernBiotech, Birmingham, AL	0100-01
Glass slides	Fisher	12-550-15
Cover glass	VWR	16004-330
Confocal microscope	Nikon	Nikon A1
Nikon Elements	Nikon