בVivo ההערכה של מכרסמים Plasmodium Parasitemia וMerozoite פלישה על ידי cytometry הזרימה

Summary

פולש טפיל המלריה והמשכפל בתוך תאי דם אדומים. ההערכה מדויקת של פלישת merozoite וparasitemia לכן חיונית בהערכה במהלך הידבקות במלריה. כאן אנו מתארים זרימה cytometry פרוטוקול מבוסס למדידת הפרמטרים הללו במודל עכבר של מלריה.

Abstract

During blood stage infection, malaria parasites invade, mature, and replicate within red blood cells (RBCs). This results in a regular growth cycle and an exponential increase in the proportion of malaria infected RBCs, known as parasitemia. We describe a flow cytometry based protocol which utilizes a combination of the DNA dye Hoechst, and the mitochondrial membrane potential dye, JC-1, to identify RBCs which contain parasites and therefore the parasitemia, of in vivo blood samples from Plasmodium chabaudi adami DS infected mice. Using this approach, in combination with fluorescently conjugated antibodies, parasitized RBCs can be distinguished from leukocytes, RBC progenitors, and RBCs containing Howell-Jolly bodies (HJ-RBCs), with a limit of detection of 0.007% parasitemia. Additionally, we outline a method for the comparative assessment of merozoite invasion into two different RBC populations. In this assay RBCs, labeled with two distinct compounds identifiable by flow cytometry, are transfused into infected mice. The relative rate of invasion into the two populations can then be assessed by flow cytometry based on the proportion of parasitized RBCs in each population over time. This combined approach allows the accurate measurement of both parasitemia and merozoite invasion in an in vivo model of malaria infection.

Introduction

The clinical symptoms associated with malaria occur during the Plasmodium parasite’s asexual replicative cycle within red blood cells (RBCs). Merozoites, released during the liver stage of infection, quickly attach to and invade RBCs. After gaining entry into the cell, the parasite grows and matures, eventually undergoing schizogony, splitting open the cell, and releasing a cluster of newly formed merozoites which go on to repeat this cycle. As such, an assessment of malaria infection often involves monitoring both parasitemia, which is the percentage of RBCs appropriated by one or more parasites, and the rate of merozoite invasion into uninfected RBCs.

Flow cytometry is a powerful tool which can be used to record the properties of vast numbers of cells in a short period of time. This technique has clear applicability for the measurement of malaria parasitemia and invasion, and offers several advantages over traditional microscopy techniques. These include the accurate measurement of very low parasitemia, which would be prohibitively time consuming by microscopy, the unbiased nature of the measurement, and the ability to measure multiple cell parameters simultaneously. Flow cytometry is widely used to determine both parasitemia and merozoite invasion in in vitro culture^1-9, however, techniques for measuring these parameters in vivo are less well developed, and can be complicated by the presence of additional cell types which interfere with analysis. No assays have been described for measurement of in vivo invasion, and while some assays exist for the analysis of in vivo parasitemia, these lack the ability to distinguish between parasitized RBCs (pRBCs) and RBCs containing Howell-Jolly bodies (HJ-RBCs)^10-13. The later issue is particularly important as in mice HJ-RBCs may account for up to 0.9% of mature RBCs^14-16, thereby preventing the accurate measurement of low parasitemia.

We have previously demonstrated an approach for the measurement of parasitemia and merozoite invasion in a rodent model of malaria infection¹⁴. Here, we provide a more detailed protocol and accompanying video. This approach builds on previous methodologies and allows for the accurate identification of parasitized RBCs, as distinct from leukocytes, RBC progenitors, and HJ-RBCs. Additionally, this assay allows the simultaneous measurement of merozoite invasion into two labeled RBC populations, a treated, or target, population, and a control population, thereby providing a robust platform for the assessment of invasion into different cell types.

Protocol

כל הנהלים בוצעו בהתאם למדיניות של אוניברסיטת Macquarie והותאמו למועצה הלאומית לבריאות והמחקר רפואי (NHMRC) הקוד אוסטרלי של תרגול. העבודה בוצעה תחת האתיקה הסכם לא ARA 2012/017 אושר והתקבל מוועדת האתיקה בבעלי חיים באוניברסיטת Macquarie. כל הניסויים בוצעו על עכברי SJL / J אלא אם צוין אחרת.

1. עכברים וזיהום ניסיון מלריה

1. עכברי בית תחת טמפרטורה מבוקרת (21 מעלות צלזיוס) עם מחזור אור-חושך 00:12 שעות.
2. להפשיר aliquot של פ cryopreserved DS Adami chabaudi עם 5% RBCs parasitized (pRBCs) ולהזריק 200 μl לתוך חלל intraperitoneal של C57BL / 6 עכבר תורם.
3. צג parasitemia עכבר תורם כל 1-2 ימים באמצעות cytometry זרימה כפי שתואר בסעיף 3 - 4 לפרוטוקול זה. ברגע שמגיעים לתורמים 5 - parasitemia 15%, לאסוף דם על ידי לנקב לב כדלקמן:
   1. לשאוב מפתרון הפרין (300 U הפרין / מיליליטר בפתרון העכבר Ringer (MTR) (154 מ"מ NaCl, 5.6 מ"מ KCl, 1 מ"מ MgCl _2, 2.2 מ"מ CaCl _2, 20 מ"מ HEPES 100 μl, 10 גלוקוז מ"מ, 30 U / ml הפרין, pH 7.4, 0.22 מסנן מיקרומטר מעוקר)) לתוך מזרק 1 מיליליטר עם מחט 26 G.
   2. להרדים את העכבר על ידי שאיפה עם isofluorane 5%, המאשר את העומק הרצוי של הרדמה על ידי היעדר תגובת נסיגת דוושה ורפלקסים של קרנית.
   3. הנח את העכבר על צידו ומחט להכניס ניצב ממש מתחת למרפק, דרך הצלעות, ואל תוך הלב. משוך את בוכנת מזרק באיטיות ובלסובב מחט עד 0.5-1 מיליליטר של דם מתקבל.
   4. לבצע המתת חסד הומנית נקע בצוואר רחם בהרדמה.
4. לחשב את pRBCs לכל נפח של דם תורם בהנחת ספירה של 9 x 10 ⁶ RBC / μl (דם כלומר, אם התורם היה ב 10% parasitemia כאשר הקריבו, דם יכיל 9 x 10 ⁵pRBC / μl). לדלל דם parasitized בקרבס נאגר מלוח (126 מ"מ NaCl, 2.5 מ"מ KCl, 25 מ"מ NaHCO _3, 1.2 מ"מ לאא ₂ PO _4, 1.2 מ"מ MgCl _2, 2.5 מ"מ CaCl _2, גלוקוז 0.2%, pH 7.2, 0.22 מסנן מיקרומטר מעוקר) כך שהריכוז הוא 1 x 10 ⁴ pRBCs ל-200 μl ולהזריק 200 μl לתוך חלל intraperitoneal של עכברים הנדרשים לתיוג RBC וניסוי עירוי.
5. צג parasitemia כל 1-2 ימים באמצעות cytometry זרימה כמתואר בסעיפים 3-4 לפרוטוקול זה.

2. תיוג של RBCs ועירוי

1. איסוף דם heparinized מעכברים ידי לנקב לב כמתואר בשלב 1.3, ומניח על קרח. לשמור על דם על 4 מעלות צלזיוס בכל העת. לאסוף כ -200 דם μl לכל עכבר להיות מוזרק. במידת צורך, לפצל דם לשתי דגימות ולטפל דגימה אחת כרצוי.
   הערה: בדרך זו, פלישה של samp טופלניתן להשוות le לשליטה, לדוגמא מטופל (ראה איור 1 עבור סכמטית).
2. הכן פתרון 2x של כל תווית RBC ניאון.
   1. לדלל 2 מ"ג / מיליליטר פתרון מניות של Atto 633-N-Hydroxysuccinimide (Atto 633-NHS) בMTR, כך שהריכוז הוא 20 מיקרוגרם / מיליליטר.
   2. לדלל 25 מ"ג / מיליליטר פתרון מניות של ביוטין-N-Hydroxysuccinimide (ביוטין-NHS) בMTR, כך שהריכוז הוא 250 מיקרוגרם / מיליליטר.
3. פיצול דגימות דם לשני צינורות ולהוסיף נפח שווה של פתרון 633-NHS 2x Atto לצינור אחד, ונפח שווה של 2x יוטין-NHS לצינור האחר. מערבבים מייד. דגירה דם על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 עם ערבוב איטי קבוע, או לחלופין, לערבב מדגם כל 10 - 15 דקות.
4. לשטוף 3 פעמים שכותרתו דם עם MTRC (MTR 0.5% אלבומין + סרום שור (BSA), 0.22 מסנן מיקרומטר מעוקר) כדלקמן:
   1. הוסף לפחות 2 כרכים של MTRC, צנטריפוגות ב 750 XG במשך 5 דקות, להסיר את supernatant, וresuspenד גלולה בלפחות 2 כרכים של MTRC. חזור על פי 2 יותר.
   2. לאחר לשטוף הסופיים, צנטריפוגות ב 750 XG דקות ו -5 לשלב דם pelleted בשילובים שונים (כלומר, שלא טופל Atto 633 / ביוטין טופל, ביוטין שלא טופל / טופל Atto 633). להוסיף MTR לעשות עד נפח של 200 μl לכל עכבר להיות מוזרקות.
5. הזרק דם שכותרתו intravascularly לעכברים נגועים במלריה מכרסם או בקרות נגוע כדלקמן:
   1. לבצע עירוי של 2 - parasitemia 15% בשיאו של רְבִיַת שֶׁסַע הטפיל.
      הערה: זה קורה בערך באמצע הדרך דרך המחזור הכהה (כלומר, בין 12-2 בבוקר במחזור אור רגיל, או 12-2 בערב במחזור אור הפוך).
   2. עכברים חמים באמצעות מנורת חום למשך 5-10 דקות כדי להגביר את זרימת דם, אך לנקוט באמצעי זהירות שלא לחמם יותר מדי את העכברים. מניחים עכברים במכשיר הרחקה וintravascularly להזריק 200 μl דם שכותרתו (כ 1 - 2 x 10 RB ⁹Cs) דרך וריד הזנב.
6. לאסוף דגימות דם בנקודות זמן שונות לאחר ההזרקה כפי שתואר בסעיף 3.
   ניתן לכמת שיעורי פלישה פחות מ -10 דקות לאחר הזרקה, בהתאם לparasitemia של עכבר הנמען: הערה.

3. איסוף דגימות דם והכנה לcytometry הזרימה

1. הכן 50 μl של פתרון מכתים לדגימה, בתוספת נוספת, ביום של הניסוי כדלקמן:
   1. להפשיר aliquot של 6 מ"מ JC-1 המאוחסן ב -20 ° C בsulfoxide דימתיל (DMSO).
   2. 50 μl החם של MTRC לדגימה, בתוספת נוספת, עד 37 מעלות צלזיוס.
   3. בעוד ברציפות vortexing MTRC מראש חימם, להוסיף JC-1, כך שהריכוז הסופי הוא 12 מיקרומטר. הדבר נעשה כדי להפחית את היווצרות JC-1 אגרגטים; אם מצרפים אין טופס, לעשות צינור לא צנטריפוגות כמו זה יהיה למנוע הכתמה.
      הערה: כמות קטנה של צבירה לא תשפיע על תוצאות.
   4. להוסיף אנטיCD45 APC eFluor 780 ואנטי-CD71 PerCP eFluor 710, כך שהריכוז הסופי הוא מיקרוגרם / מיליליטר 1. אם ביצוע ניסוי RBC שכותרתו, להוסיף streptavidin PE-Cy7 כך שהריכוז הסופי הוא מיקרוגרם / מיליליטר 1.
2. בצע דימום זנב על ידי קטיעה של קצה הזנב או קריעה של כלי הדם בתוך הזנב. מניחים ירידה של דם זנב על שקופית לשקול סירה או זכוכית קטנה. לאחר איסוף דם, לוודא שדימום הפסק. פיפטה 3 μl דם זנב לתוך 50 μl של פתרון מכתים מראש לחמם 37 ° C ו דגירה דגימות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
3. להפשיר aliquot של 4 מ"מ Hoechst 33342 מאוחסן ב -20 ° C במים מזוקקים (אם באמצעות לייזר 355 ננומטר) או 2 מ"מ Hoechst 34580 מאוחסן ב -20 ° C במים מזוקקים (אם באמצעות לייזר 405 ננומטר). הכן 500 μl לדגימה, בתוספת נוספת, של פתרון 4 מיקרומטר או 2 מיקרומטר של Hoechst בMTRC, בהתאמה.
4. הוסף 500 μl של 4 מיקרומטר Hoechst33342 או 2 מיקרומטר Hoechst 34580 לדגימות לדגור על RT במשך 20 דקות.
5. תאי צנטריפוגה ב 750 XG במשך 3 דקות על 4 מעלות צלזיוס, supernatant קלפים שנזרקו, להוסיף 700 μl MTRC ולנתח ידי cytometry זרימה.

4. cytometry הזרימה

1. ניתוח דגימות באמצעות לייזר 355/488/633 ננומטר או 405/488/633 מכשיר לייזר ננומטר.
2. דגימות מסנן דרך מסננת תא 35 מיקרומטר מייד לפני הניתוח. יש לשטוף את מסננת תא במים מזוקקים בין דגימות ושימוש חוזר.
3. להקליט מספיק אירועים, כך שהאוכלוסייה הקטנה ביותר מכילה לפחות 500 אירועים (בדרך כלל 1,000,000 - 10,000,000 אירועים הכולל לדוגמה).
4. Excite Hoechst 33342 באמצעות לייזר 355 nm ולזהות אירועים דרך מסנן 460/50. Excite Hoechst 34580 באמצעות לייזר 405 nm ולזהות אירועים דרך מסנן 460/50. Excite JC-1, אנטי-CD71 PerCP eFluor 710 וstreptavidin PE-Cy7 באמצעות לייזר 488 ננומטר ולזהות אירועים דרך 530/40, 692/40, ו750LP לסנן בהתאמהly. Excite Atto 633 ואנטי-CD45 APC eFluor 780 באמצעות לייזר 633 ננומטר ולזהות אירועים דרך מסנן 670/30 או 750LP בהתאמה.
5. ביצוע ניתוח ופיצוי באמצעות זרימה מתאימה cytometry תוכנת ניתוח כדלקמן:
   1. בחר תאים שלמים ולא לכלול רעש, פסולת, וטסיות דם המבוססת על FSC מאפיינים / SSC (איור 2 א). בחר תאים בודדים המבוססים על או רוחב דופק הדק (איור 2) או על ידי שימוש באזור שיא FSC יחס גובה (איור 2 ג).
   2. בחר RBCs הבוגר, ולא לכלול אבות RBC וכדוריות דם לבנות, המבוסס על הקרינה שלילית בPerCP eFluor 710 וAPC eFluor 780 הערוצים (איור 2 ד).
   3. אם ביצוע ניסוי RBC המסומן, בחר כל אוכלוסייה של RBCs שכותרתו מבוסס על PE-Cy7 וAtto 633 הקרינה ולנתח בנפרד (איור 3 א) אלה.
   4. בחר pRBCs המבוסס על הקרינה חיובית עבור שני JC-1 וHoechst ( איור 2E-H).

5. חישובים וסטטיסטיקות

1. לחשב parasitemia על ידי חלוקת מספר pRBCs במספר הכולל של תאי דם אדומים (כלומר, מספר האירועים בQ2 שער מחולק במספר האירועים בG4 שער). בעת ביצוע parasitemia assay הפלישה של שתי האוכלוסיות שכותרתו יכולה להיות מחושב על ידי חלוקת מספר pRBCs שכותרתו במספר RBCs שכותרתו באוכלוסייה ש( כלומר, מספר האירועים שנמצאים בשני L1 השערים וQ2, מחולק במספר האירועים בשער L1).
   הערה: parasitemia תווית משתנה במידה ניכרת בהתאם לגורמים כגון parasitemia ומספר merozoites במחזור אנדוגני. מסיבה זו, כדאי לדווח על יחס parasitemia, המחושב כparasitemia של המטופלים האוכלוסייה שהכותרת מחולקת בparasitemia של אוכלוסיית השליטה שכותרתו בכל עכבר בודד. כדי לתקן את השפעות צבע אפשריות, דו"ח תוצאותזה יחס parasitemia ממוצע על פני שני שילובי הצבע.
2. לקבוע מובהקות סטטיסטיות של יחסים באמצעות דגימה אחת -test t עם 1 כממוצע היפותטי.

תוצאות

מדידה של parasitemia.

למדידה parasitemia, צריכים להיות ראשון שנבחרו תאי דם, ורעש, פסולת וטסיות דם נשללו, המבוססים על מאפייני FSC / SSC (איור 2 א). בהתאם לcytometer משמש, אז צריכים להיות נבחרו תאים בודדים המבוססים על או רוחב דופק הדק (איור 2),

Discussion

יש לנו תיארתי שיטה למדידה של שתי פלישת parasitemia וmerozoite של דגימות in vivo. במונחים של מדידת parasitemia, שיטה זו מציעה יתרון על פני שיטות קודמות ^10-13 שבHJ-RBCs ניתן להבחין בין pRBCs, ובכך להפחית את מספר האירועים חיוביים כוזבים. בעוד HJ-RBCs הוא בדרך כלל נדיר בבני אדם, כמה מחקרים מדו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
bisBenzimide H 33342 trihydrochloride	Sigma-Aldrich	B2261	Hoechst 33342. Store a 4 mM stock solution at -20 °C in distilled water
Hoechst 34580	Sigma-Aldrich	63493	Store a 2 mM stock solution at -20 °C in distilled water
JC-1 Dye	Life Technologies	T-3168	Store small aliquots of 6 mM stock solution at -20 °C in DMSO
Anti-Mouse CD45 APC-eFluor 780	eBioscience	47-0451-80	Clone 30-F11
Anti-Mouse CD71 PerCP-eFluor 710	eBioscience	46-0711-80	Clone R17217
Atto 633 NHS ester	Sigma-Aldrich	1464	Atto 633-NHS. Store a 2 mg/ml stock solution at -20 °C in DMF
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin	Thermo Fisher Scientific	21335	Biotin-NHS. Store a 25 mg/ml stock solution at -20 °C in DMF
Streptavidin PE-Cyanine7	eBioscience	25-4317-82	Streptavidin PE-Cy7
Heparin	Sigma-Aldrich	H478
35 µM filter cap tubes	Becton Dickinson	352235
Flow cytometer: BD LSRFortessa	Becton Dickinson
Flow cytometer: BD FACSAria II	Becton Dickinson
Flow cytometer: BD Influx	Becton Dickinson
Flow cytometer: CyAn ADP Analyzer	Beckman Coulter