In Vivo Valutazione del roditore Plasmodium parassitemia e merozoite Invasion di Citometria a flusso

Riepilogo

Gli invade parassita della malaria e replicati all'interno delle cellule rosse del sangue. La valutazione accurata di invasione merozoite e parassitemia è quindi fondamentale per la valutazione nel corso di infezione malarica. Qui si descrive un protocollo basato citometria a flusso per la misurazione di questi parametri in un modello murino di malaria.

Abstract

During blood stage infection, malaria parasites invade, mature, and replicate within red blood cells (RBCs). This results in a regular growth cycle and an exponential increase in the proportion of malaria infected RBCs, known as parasitemia. We describe a flow cytometry based protocol which utilizes a combination of the DNA dye Hoechst, and the mitochondrial membrane potential dye, JC-1, to identify RBCs which contain parasites and therefore the parasitemia, of in vivo blood samples from Plasmodium chabaudi adami DS infected mice. Using this approach, in combination with fluorescently conjugated antibodies, parasitized RBCs can be distinguished from leukocytes, RBC progenitors, and RBCs containing Howell-Jolly bodies (HJ-RBCs), with a limit of detection of 0.007% parasitemia. Additionally, we outline a method for the comparative assessment of merozoite invasion into two different RBC populations. In this assay RBCs, labeled with two distinct compounds identifiable by flow cytometry, are transfused into infected mice. The relative rate of invasion into the two populations can then be assessed by flow cytometry based on the proportion of parasitized RBCs in each population over time. This combined approach allows the accurate measurement of both parasitemia and merozoite invasion in an in vivo model of malaria infection.

Introduzione

The clinical symptoms associated with malaria occur during the Plasmodium parasite’s asexual replicative cycle within red blood cells (RBCs). Merozoites, released during the liver stage of infection, quickly attach to and invade RBCs. After gaining entry into the cell, the parasite grows and matures, eventually undergoing schizogony, splitting open the cell, and releasing a cluster of newly formed merozoites which go on to repeat this cycle. As such, an assessment of malaria infection often involves monitoring both parasitemia, which is the percentage of RBCs appropriated by one or more parasites, and the rate of merozoite invasion into uninfected RBCs.

Flow cytometry is a powerful tool which can be used to record the properties of vast numbers of cells in a short period of time. This technique has clear applicability for the measurement of malaria parasitemia and invasion, and offers several advantages over traditional microscopy techniques. These include the accurate measurement of very low parasitemia, which would be prohibitively time consuming by microscopy, the unbiased nature of the measurement, and the ability to measure multiple cell parameters simultaneously. Flow cytometry is widely used to determine both parasitemia and merozoite invasion in in vitro culture^1-9, however, techniques for measuring these parameters in vivo are less well developed, and can be complicated by the presence of additional cell types which interfere with analysis. No assays have been described for measurement of in vivo invasion, and while some assays exist for the analysis of in vivo parasitemia, these lack the ability to distinguish between parasitized RBCs (pRBCs) and RBCs containing Howell-Jolly bodies (HJ-RBCs)^10-13. The later issue is particularly important as in mice HJ-RBCs may account for up to 0.9% of mature RBCs^14-16, thereby preventing the accurate measurement of low parasitemia.

We have previously demonstrated an approach for the measurement of parasitemia and merozoite invasion in a rodent model of malaria infection¹⁴. Here, we provide a more detailed protocol and accompanying video. This approach builds on previous methodologies and allows for the accurate identification of parasitized RBCs, as distinct from leukocytes, RBC progenitors, and HJ-RBCs. Additionally, this assay allows the simultaneous measurement of merozoite invasion into two labeled RBC populations, a treated, or target, population, and a control population, thereby providing a robust platform for the assessment of invasion into different cell types.

Protocollo

Tutte le procedure sono state condotte in conformità con le politiche di Macquarie University e conformi al Consiglio nazionale della sanità e ricerca medica (NHMRC) Codice australiano di pratica. Il lavoro è stato svolto sotto gli Etica accordo No ARA 2012/017 approvate e ottenuto da parte del Comitato Etico degli animali presso Macquarie University. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti su SJL / J topi se non indicato diversamente.

1. Mouse e Sperimentale Malaria Infezione

1. Mice House a temperatura controllata (21 ° C), con un ciclo luce-buio 12:12 h.
2. Scongelare una aliquota di crioconservati P. chabaudi adami DS con 5% parassitati globuli rossi (pRBCs) e iniettare 200 ml nella cavità intraperitoneale di C57BL / 6 del mouse donatore.
3. Monitorare donatore del mouse parassitemia ogni 1 - 2 giorni in citometria a flusso, come descritto nella Sezione 3 - 4 del presente protocollo. Una volta che i donatori raggiunge 5-15% parassitemia, raccogliere il sangue dalla puntura cardiaca come segue:
   1. Aspirare 100 ml di soluzione di eparina (300 U / ml di eparina in soluzione di Ringer topo (MTR) (154 mM NaCl, KCl 5,6 mM, 1 mM MgCl _2, 2.2 mM CaCl _2, 20 mM HEPES, glucosio 10 mM, 30 U / ml eparina, pH 7,4, 0,22 mM filtro sterilizzato)) in una siringa da 1 ml con un ago 26 G.
   2. Anestetizzare il mouse per inalazione con il 5% isofluorane, confermando la profondità desiderata di anestesia per mancanza di risposta ritiro del pedale e riflessi corneali.
   3. Posizionare il mouse sul suo lato e perpendicolarmente ago inserto appena sotto il gomito, attraverso le costole, e nel cuore. Estrarre lo stantuffo della siringa lentamente e ruotare ago fino a 0,5 - si ottiene 1 ml di sangue.
   4. Eseguire l'eutanasia umana da dislocazione cervicale sotto anestesia.
4. Calcolare i pRBCs per volume di sangue dei donatori assumendo un emocromo di 9 x 10 ⁶ RBC / ml (ossia, se il donatore era al 10% parassitemia quando sacrificati, il sangue conterrà 9 x 10 ⁵pRBC / ml). Diluire il sangue parassitati in Krebs tamponata salina (126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 25 mM NaHCO _3, 1.2 mM NaH ₂ PO _4, 1,2 mM MgCl _2, 2.5 mM CaCl _2, 0.2% di glucosio, pH 7,2, 0,22 mM filtro sterilizzato) in modo che la concentrazione è 1 x 10 ⁴ pRBCs per 200 microlitri e iniettare 200 microlitri nella cavità intraperitoneale di topi necessari per l'etichettatura RBC e sperimentare trasfusione.
5. Monitorare parassitemia ogni 1 - 2 giorni in citometria a flusso, come descritto nei paragrafi 3-4 di questo protocollo.

2. Etichettatura dei globuli rossi e Transfusion

1. Prelevare il sangue eparinizzato da topi mediante puntura cardiaca come descritto al punto 1.3, e disporli sul ghiaccio. Mantenere il sangue a 4 ° C in ogni momento. Raccogliere circa 200 ml di sangue per il mouse da iniettare. Se necessario, dividere il sangue in due campioni e trattare un campione, se lo desideri.
   NOTA: In questo modo, invasione del samp trattatale può essere paragonato ad un controllo, campione non trattato (vedere Figura 1 per schematica).
2. Preparare una soluzione 2x di ogni etichetta RBC fluorescente.
   1. Diluire a / ml soluzione madre 2 mg di Atto 633-N-Hydroxysuccinimide (Atto 633-NHS) in MTR modo che la concentrazione è di 20 mg / ml.
   2. Diluire a / ml soluzione madre 25 mg di biotina-N-Hydroxysuccinimide (biotina-NHS) in MTR modo che la concentrazione di 250 ug / ml.
3. Split campioni di sangue in due provette e aggiungere un volume uguale di soluzione di 2x Atto 633-NHS ad un tubo, e un volume uguale del 2x biotina-NHS per l'altro tubo. Mescolare immediatamente. Incubare sangue a 4 ° C per 1 ora con costante miscelazione lenta, o in alternativa, miscelare campione ogni 10 - 15 minuti.
4. Lavare etichettati sangue 3 volte con MTRC (MTR + 0,5% di siero albumina bovina (BSA), 0,22 mM filtro sterilizzato) come segue:
   1. Aggiungere almeno 2 volumi di MTRC, centrifugare a 750 xg per 5 min, rimuovere il supernatante e resuspend il pellet in almeno 2 volumi di MTRC. Ripetere 2 volte.
   2. Dopo l'ultimo lavaggio, centrifugare a 750 xg per 5 minuti e combinare il sangue pellet in diverse combinazioni (ad esempio, non trattata Atto 633 / trattati biotina, non trattati biotina / trattata Atto 633). Aggiungere MTR per portare a un volume di 200 ml per topo da iniettare.
5. Iniettare sangue marcato per via intravascolare in roditori malaria topi infettati o controlli non infetti come segue:
   1. Eseguire trasfusione a 2 - 15% parassitemia al culmine di parassita schizogonia.
      NOTA: ciò avviene circa a metà del ciclo di buio (cioè tra 12 - 2 am il normale ciclo di luce, o 12 - 2 pm un ciclo di luce inversa).
   2. Topi calda usando una lampada di calore per 5-10 minuti per aumentare il flusso di sangue, ma di prendere precauzioni per non surriscaldare i topi. Inserire topi in un dispositivo di ritegno e iniettare per via intravascolare 200 microlitri di sangue marcato (circa 1 - 2 x 10 ⁹ RBCs) attraverso la vena della coda.
6. Raccogliere campioni di sangue in diversi momenti dopo l'iniezione, come descritto nella Sezione 3.
   NOTA: i tassi di invasione possono essere quantificabili in meno di 10 minuti dopo l'iniezione, a seconda parassitemia del mouse destinatario.

3. Raccolta di campioni di sangue e di preparazione per Citometria a Flusso

1. Preparare 50 ml di soluzione colorante per campione, più extra, il giorno dell'esperimento come segue:
   1. Scongelare una aliquota di 6 JC-1 mM conservati a -20 ° C in dimetil solfossido (DMSO).
   2. Caldo 50 ml di MTRC per campione, più extra, a 37 ° C.
   3. Mentre continua il vortex MTRC pre-riscaldato, aggiungere JC-1 in modo che la concentrazione finale è di 12 micron. Questo viene fatto per ridurre la formazione di aggregati JC-1; se aggregati si formano, fare tubo non centrifuga in modo da evitare la colorazione.
      NOTA: Una piccola quantità di aggregazione non influirà risultati.
   4. Aggiungi anti-CD45 APC eFluor 780 e anti-CD71 PerCP eFluor 710 in modo che la concentrazione finale è di 1 mg / ml. Se si esegue l'esperimento RBC etichetta, aggiungere streptavidina PE-Cy7 in modo che la concentrazione finale è di 1 mg / ml.
2. Eseguire sanguinamento coda da amputazione della punta della coda o lacerazione del vaso sanguigno nella coda. Mettere una goccia di sangue di coda su una piccola barca o pesare vetrino. Dopo la raccolta del sangue, assicurarsi che l'emorragia si è fermata. Pipettare 3 ml di sangue coda in 50 ml di soluzione colorante pre-riscaldato a 37 ° C e incubare i campioni a 37 ° C per 20 min.
3. Scongelare una aliquota di 4 mM Hoechst 33342 conservati a -20 ° C in acqua distillata (se si utilizza un laser 355 nm) o 2 mM Hoechst 34580 conservati a -20 ° C in acqua distillata (se si utilizza un laser 405 nm). Preparare 500 microlitri per campione, più extra, di una soluzione di 4 micron o 2 micron di Hoechst in MTRC rispettivamente.
4. Aggiungere 500 ml di 4 micron Hoechst33342 o 2 mM Hoechst 34580 campioni e incubare a temperatura ambiente per 20 min.
5. Cellule centrifugare a 750 xg per 3 min a 4 ° C, scarto surnatante, aggiungere 700 microlitri MTRC e analizzare mediante citometria a flusso.

4. Citometria a flusso

1. Analizzare i campioni utilizzando un laser 355/488/633 nm o 405/488/633 strumento laser nm.
2. Filtrare i campioni attraverso un colino cella di 35 micron immediatamente prima dell'analisi. Risciacquare filtro cella con acqua distillata tra campioni e riutilizzo.
3. Registra abbastanza eventi in modo che la popolazione più piccola contiene almeno 500 eventi (di solito 1.000.000 - 10.000.000 eventi totali per campione).
4. Excite Hoechst 33342 utilizzando un laser 355 nm e rilevare eventi attraverso un filtro 460/50. Excite Hoechst 34580 utilizzando un laser 405 nm e rilevare gli eventi attraverso un filtro 460/50. Excite JC-1, anti-CD71 PerCP eFluor 710 e PE-Streptavidina Cy7 utilizzando un laser 488 nm e rilevare gli eventi attraverso una 530/40, 692/40, e 750LP filtrare rispettivoly. Excite Atto 633 e anti-CD45 APC eFluor 780 utilizzando un laser 633 nm e di rilevare, rispettivamente, gli eventi attraverso un filtro 670/30 o 750LP.
5. Eseguire l'analisi e la compensazione con flusso adeguato citometria software di analisi come segue:
   1. Selezionare cellule intere ed escludere rumore, detriti e piastrine basato su FSC / proprietà SSC (Figura 2A). Selezionare singole cellule basate su entrambi larghezza di impulso di trigger (Figura 2B) o utilizzando l'area del picco FSC al rapporto di altezza (Figura 2C).
   2. Selezionare globuli rossi maturi, ed escludere progenitori e leucociti RBC, sulla base di fluorescenza negativo nei PerCP eFluor 710 e APC eFluor 780 canali (Figura 2D).
   3. Se si esegue l'esperimento RBC etichetta, selezionare ogni popolazione di globuli rossi etichettati sulla base di PE-Cy7 e Atto 633 fluorescenza e analizzare questi separatamente (Figura 3A).
   4. Selezionare pRBCs basata su fluorescenza positiva sia JC-1 e Hoechst ( Figura 2E-H).

5. Calcoli e Statistiche

1. Calcolare parassitemia dividendo il numero di pRBCs per il numero totale dei globuli rossi (cioè, il numero di eventi in cancello Q2 e il numero di eventi in porta G4). Nell'effettuare la parassitemia dosaggio invasione dei due popolazioni etichettati può essere calcolata dividendo il numero di pRBCs etichettate per il numero di globuli rossi etichettati in quella popolazione (cioè, il numero di eventi che sono sia porte L1 e Q2, diviso per il numero di eventi in porta L1).
   NOTA: etichetta parassitemia varia notevolmente a seconda di fattori quali la parassitemia endogena e il numero di merozoiti circolanti. Per questo motivo, è utile per segnalare il rapporto parassitemia, che viene calcolato come parassitemia della popolazione trattata etichettato diviso per il parassitemia della popolazione di controllo etichettata in ciascun topo. Per correggere eventuali effetti tintura, rapporto risulta uns un rapporto medio parassitemia tra i due combinazioni di tintura.
2. Determinare la significatività statistica dei rapporti con il t-test un campione con 1 come media ipotetica.

Risultati

Misura della parassitemia.

Per la misura di parassitemia, cellule del sangue devono prima essere selezionati, e il rumore, detriti e piastrine esclusi, sulla base di FSC / SSC proprietà (Figura 2A). A seconda del citometro utilizzato, singole cellule devono poi essere selezionati sulla base sia di larghezza di impulso di trigger (Figura 2B), o altezza del picco FSC rapporto dell'area (Figura 2C). Rimanendo eventi dovrebbero consistere di l...

Discussione

Abbiamo descritto un metodo per la misura sia parassitemia e merozoite invasione campioni in vivo. In termini di misurazione parassitemia, questo metodo offre un vantaggio rispetto ai metodi precedenti ^10-13 in quella HJ-globuli rossi possono essere distinti da pRBCs, riducendo così il numero di eventi positivi falsi. Mentre HJ-globuli rossi sono di solito rare negli esseri umani, alcuni studi riportano livelli elevati nei topi ^15,16 la distinzione tra queste cellule e pRBCs importanti pe...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
bisBenzimide H 33342 trihydrochloride	Sigma-Aldrich	B2261	Hoechst 33342. Store a 4 mM stock solution at -20 °C in distilled water
Hoechst 34580	Sigma-Aldrich	63493	Store a 2 mM stock solution at -20 °C in distilled water
JC-1 Dye	Life Technologies	T-3168	Store small aliquots of 6 mM stock solution at -20 °C in DMSO
Anti-Mouse CD45 APC-eFluor 780	eBioscience	47-0451-80	Clone 30-F11
Anti-Mouse CD71 PerCP-eFluor 710	eBioscience	46-0711-80	Clone R17217
Atto 633 NHS ester	Sigma-Aldrich	1464	Atto 633-NHS. Store a 2 mg/ml stock solution at -20 °C in DMF
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin	Thermo Fisher Scientific	21335	Biotin-NHS. Store a 25 mg/ml stock solution at -20 °C in DMF
Streptavidin PE-Cyanine7	eBioscience	25-4317-82	Streptavidin PE-Cy7
Heparin	Sigma-Aldrich	H478
35 µM filter cap tubes	Becton Dickinson	352235
Flow cytometer: BD LSRFortessa	Becton Dickinson
Flow cytometer: BD FACSAria II	Becton Dickinson
Flow cytometer: BD Influx	Becton Dickinson
Flow cytometer: CyAn ADP Analyzer	Beckman Coulter