フローサイトメトリーによるげっ歯類マラリア原虫のin vivo評価とメロゾイト侵略で

要約

マラリア原虫が侵入し、赤血球内で複製する。メロゾイトの侵入および寄生虫の正確な評価は、マラリア感染の経過を評価するので、非常に重要です。ここでは、マラリアのマウスモデルにおいて、これらのパラメータを測定するためのフローサイトメトリーベースのプロトコルを説明する。

要約

During blood stage infection, malaria parasites invade, mature, and replicate within red blood cells (RBCs). This results in a regular growth cycle and an exponential increase in the proportion of malaria infected RBCs, known as parasitemia. We describe a flow cytometry based protocol which utilizes a combination of the DNA dye Hoechst, and the mitochondrial membrane potential dye, JC-1, to identify RBCs which contain parasites and therefore the parasitemia, of in vivo blood samples from Plasmodium chabaudi adami DS infected mice. Using this approach, in combination with fluorescently conjugated antibodies, parasitized RBCs can be distinguished from leukocytes, RBC progenitors, and RBCs containing Howell-Jolly bodies (HJ-RBCs), with a limit of detection of 0.007% parasitemia. Additionally, we outline a method for the comparative assessment of merozoite invasion into two different RBC populations. In this assay RBCs, labeled with two distinct compounds identifiable by flow cytometry, are transfused into infected mice. The relative rate of invasion into the two populations can then be assessed by flow cytometry based on the proportion of parasitized RBCs in each population over time. This combined approach allows the accurate measurement of both parasitemia and merozoite invasion in an in vivo model of malaria infection.

概要

The clinical symptoms associated with malaria occur during the Plasmodium parasite’s asexual replicative cycle within red blood cells (RBCs). Merozoites, released during the liver stage of infection, quickly attach to and invade RBCs. After gaining entry into the cell, the parasite grows and matures, eventually undergoing schizogony, splitting open the cell, and releasing a cluster of newly formed merozoites which go on to repeat this cycle. As such, an assessment of malaria infection often involves monitoring both parasitemia, which is the percentage of RBCs appropriated by one or more parasites, and the rate of merozoite invasion into uninfected RBCs.

Flow cytometry is a powerful tool which can be used to record the properties of vast numbers of cells in a short period of time. This technique has clear applicability for the measurement of malaria parasitemia and invasion, and offers several advantages over traditional microscopy techniques. These include the accurate measurement of very low parasitemia, which would be prohibitively time consuming by microscopy, the unbiased nature of the measurement, and the ability to measure multiple cell parameters simultaneously. Flow cytometry is widely used to determine both parasitemia and merozoite invasion in in vitro culture^1-9, however, techniques for measuring these parameters in vivo are less well developed, and can be complicated by the presence of additional cell types which interfere with analysis. No assays have been described for measurement of in vivo invasion, and while some assays exist for the analysis of in vivo parasitemia, these lack the ability to distinguish between parasitized RBCs (pRBCs) and RBCs containing Howell-Jolly bodies (HJ-RBCs)^10-13. The later issue is particularly important as in mice HJ-RBCs may account for up to 0.9% of mature RBCs^14-16, thereby preventing the accurate measurement of low parasitemia.

We have previously demonstrated an approach for the measurement of parasitemia and merozoite invasion in a rodent model of malaria infection¹⁴. Here, we provide a more detailed protocol and accompanying video. This approach builds on previous methodologies and allows for the accurate identification of parasitized RBCs, as distinct from leukocytes, RBC progenitors, and HJ-RBCs. Additionally, this assay allows the simultaneous measurement of merozoite invasion into two labeled RBC populations, a treated, or target, population, and a control population, thereby providing a robust platform for the assessment of invasion into different cell types.

プロトコル

すべての手順は、マッコーリー大学の方針に従って行われ、国立保健医療研究評議会（NHMRC）練習のオーストラリアのコードに適合​​した。仕事はなしARAが2012/017承認されておらず、マッコーリー大学の動物倫理委員会から得た同意の倫理で行った。特に明記しない限り、全ての実験は、SJL / Jマウスで行った。

1.マウスおよび実験マラリア感染

1. 12：12時間の明暗サイクルで制御された温度（21℃）下でのハウスマウス。
2. 凍結保存したPのアリコートを解凍5％の寄生赤血球（PRBCを）およびC57BL / 6ドナーマウスの腹腔内腔に200μlのを注入するとchabaudiアダミの DS。
3. このプロトコルの4 - 第3節で説明したように、フローサイトメトリーを用いて2日 - ごとに1ドナーマウスの寄生虫血を監視します。ドナーが5に達すると - 15％の寄生虫血を次のように、心臓穿刺により血液を収集してください。
   1. ヘパリン溶液を吸引し、100μlのマウスリンゲル液（MTR）で（300 U / mlのヘパリン（154ミリモルのNaCl、5.6のKCl、1mMのMgCl _2、2.2のCaCl _2、20mMのHEPES、10mMのグルコース、30 U / mlの26 G針を有する1ミリリットル注射器にヘパリン、pHが7.4、0.22μmのフィルター滅菌））。
   2. ペダル引っ込め反応および角膜反射の欠如によって麻酔の所望の深さを確認し、5％イソフルオラン吸入によりマウスを麻酔。
   3. その側にマウスを置き、垂直にちょうど肘下に、リブを通して、心臓に針を挿入します。ゆっくりとシリンジプランジャーを引き出し、0.5まで針を回転させる - 血液1mlのが得られる。
   4. 麻酔下で頸椎脱臼により人道的安楽死を実行します。
4. 犠牲にするときドナーが10％の寄生虫血であった場合（ すなわち、血液が9×10 ^5を含むこと^になる9×10 ⁶ RBC /μLの血球数を想定したドナー血液の体積あたりのPRBCをを計算PRBC /μL）。クレブスで寄生虫を血液を希釈食塩水（126 mMの塩化ナトリウム、2.5mMのKCl、25mMのNaHCO ₃水溶液、1.2ミリモルのNaH ₂ PO _4、1.2のMgCl _2、2.5mMのCaCl _2、0.2％グルコース、pH7.2の、滅菌し、0.22μMフィルター）をバッファリング濃度が200μLあたり1×10 ⁴ PRBCをされ、RBC標識および輸血実験に必要なマウスの腹腔内腔に200μlのを注入するようにします。
5. このプロトコルの4 - セクション3に記載したように、フローサイトメトリーを用いて2日 - ごとに1寄生虫血を監視します。

RBCおよび輸血の2ラベル

1. ステップ1.3で説明したように心臓穿刺によりマウスからヘパリン化血液を収集し、氷上に置きます。すべての回で、4℃で血を保管してください。注射されるマウスあたり約200μlの血液を収集する。必要に応じて、2つのサンプルに血液を分割し、必要に応じて一つのサンプルを扱う。
   注：治療SAMPのこのようにして、侵略ルは、対照、未処理のサンプル（概略については図1を参照）と比較することができる。
2. 各蛍光RBCラベルの2倍溶液を調製する。
   1. 濃度が20μg/ mlのあるようにMTRにアトー633-N-ヒドロキシ（アトー633-NHS）の2mg / mlのストック溶液を希釈する。
   2. 濃度を250μg/ mlとなるようにMTRにおけるビオチンのN-ヒドロキシスクシンイミド（NHSビオチン）の25 mg / mlのストック溶液を希釈する。
3. つのチューブに血液サンプルを分割し、一本のチューブ、および他のチューブに2×ビオチンNHSの等量に2倍アトー633-NHS溶液の等量を加える。すぐに混ぜる。一定のゆっくり混合しながら1時間4℃で血液をインキュベートするか、あるいは、すべての10のサンプルをミックス - 15分。
4. 次のようにMTRC（MTR + 0.5％ウシ血清アルブミン（BSA）、滅菌し、0.22μMフィルター）で標識された血液を3回洗浄する。
   1. 、MTRCの少なくとも2ボリュームを追加し、5分間750×gで遠心、上清を除去し、resuspenMTRCの少なくとも2倍量のペレットはd。 2回以上繰り返します。
   2. 最終洗浄、5分間750×gで遠心分離し、異なる組み合わせでペレット化した血液を組み合わせた後（ すなわち、未処理アトー633 /ビオチン治療、未処理ビオチン/はアトー633処置）。注射されるマウスあたり200μlの容量を最大にするMTRを追加します。
5. 次のように血管内ネズミマラリアに感染したマウスまたは未感染のコントロールにラベル血液を注入：
   1. 寄生虫の増員生殖のピーク時には15％の寄生虫血 - 2での輸血を行います。
      注：これは暗サイクルを通してほぼ中間に発生（ すなわち、12〜 -リバースライトサイクルで午後2時-通常の光サイクルで午前2時、または12）。
   2. 5-10分間加熱ランプを使用して暖かいマウスは、血流を増加させるが、マウスを過熱しないように予防措置を取る。拘束装置にマウスを置き、血管内の血液（約1ラベル200μL注入する- 2×10 ⁹ RBを尾静脈を介してCS）。
6. セクション3で説明したように、注射後の異なる時点で血液サンプルを収集する。
   注：侵入率はレシピエントマウスの寄生虫血に応じて、注射後10分未満を定量することができる。

フローサイトメトリーのための血液試料と準備の3コレクション

1. 次のように実験の日に、染色サンプルあたりのソリューションに加え、余分な50μlのを準備します。
   1. ジメチルスルホキシド中で、-20℃（DMSO）で保存6mMのJC-1のアリコートを解凍。
   2. ウォーム50サンプルあたりMTRCのμL、プラス37℃、余分な。
   3. 最終濃度が12μMになるように継続的に予め温めMTRCにボルテックスしながら、JC-1を追加します。これは、JC-1の凝集体の形成を減少させるために行われる。凝集体は、フォームをすれば、このような遠心分離管は染色を防ぐことができますしないでください。
      注：集計少量の結果には影響しません。
   4. 抗追加CD45 APC eFluor 780及び抗CD71 PerCPをeFluor 710最終濃度を1μg/ mlとなるように。ラベルRBC実験を実施した場合、最終濃度が1μg/ mlのであるように、ストレプトアビジンPE-Cy7はを追加します。
2. テール内の血管の尾や裂傷の先端の切断によりテール出血を実行します。小さな量るボートやスライドガラス上にテール一滴の血液を置きます。採血後、出血が停止したことを確認してください。染色溶液50μlに尾血液のピペット3μlを37℃に予め加温し、20分間37℃でサンプルをインキュベートする。
3. （355 nmのレーザーを使用する場合）を蒸留水中で-20℃で保存し、4mMのヘキスト33342または（405 nmのレーザーを使用する場合）を蒸留水中で-20℃で保存し2mMのヘキスト34580のアリコートを解凍。それぞれ、サンプルあたり500μLを準備し、プラス余分な、MTRCでヘキストの4μMまたは2μMソリューションの。
4. 4μMヘキスト500μlのを追加します。サンプル33342または2μMのヘキスト34580と室温で20分間インキュベートする。
5. 4℃で3分間750×gで遠心細胞、上清を捨てるには、フローサイトメトリーで700μlのMTRCを追加し、分析する。

4.フローサイトメトリー

1. 355/488/633 nmレーザーまたは405/488/633 nmのレーザー機器を使用してサンプルを分析する。
2. 分析の前にすぐに35μMのセルストレーナーを通してフィルター試料。サンプルと再使用との間に蒸留水でセルストレーナーをすすぐ。
3. （ - サンプルあたり千万総イベント通常百万）最小の人口は、少なくとも500のイベントが含まれているように、十分なイベントを記録します。
4. 355 nmのレーザーを使用してヘキスト33342エキサイトと50分の460フィルタを通してイベントを検出。 405 nmのレーザーを使用してヘキスト34580エキサイトと50分の460フィルタを通してイベントを検出。エキサイトJC-1、抗CD71 PerCPをeFluor 710とストレプトアビジンPE-Cy7は488 nmのレーザーを使用し、40分の530を介してイベントを検出し、40分の692、および750LP各フィルタLY。 633nmのレーザーを用いアトー633及び抗CD45 APC eFluor 780を励起し、それぞれ30分の670または750LPフィルターを通してイベントを検出。
5. 次のように適当なフローサイトメトリー分析ソフトウェアを用いて解析し、補正を行う。
   1. 全細胞を選択し、ノイズを排除し、破片、およびFSC / SSCの特性（ 図2A）に基づく血小板。いずれかのトリガーパルス幅（ 図2B）または高さの比（ 図2C）にFSCピーク面積を使用してベース単一細胞を選択する。
   2. 成熟した赤血球を選択し、PerCPをeFluor 710とAPC eFluor 780チャンネル（ 図2D）における負の蛍光に基づいて、赤血球前駆細胞および白血球を除外する。
   3. ラベルRBC実験を実施する場合は、PE-Cy7はとアトー633蛍光に基づいてラベルRBCの各集団を選択し、これらを別々に（ 図3A）を分析。
   4. JC-1とヘキスト（両方に陽性蛍光に基づいてPRBCをを選択図2E-H）。

5.計算と統計

1. RBCの総数でPRBCを数で割ることによって寄生虫血症を計算する（ すなわち、ゲートG4内のイベントの数で割ったゲートQ2のイベント数）。 2標識された集団の浸潤アッセイの寄生虫を行う場合（すなわち、集団における標識されたRBCの数により標識PRBCを数で割ることによって計算することができる、すなわち、ゲートL1及びQ2の両方にあるイベントの数、イベントの数で割ったものゲートL1で）。
   NOTE：寄生虫がかなり内因性寄生虫循環メロゾイトの数などの要因に応じて変化する標識。このため、個々のマウスにおける制御標識集団の寄生虫で除算処理した標識された集団の寄生虫のように計算される寄生虫比を報告することが有用である。可能な色素の影響を補正するために、レポートの結果2染料の組み合わせ全体の平均寄生虫比だ。
2. 仮定の平均として1で1 標本t -testを使用して比率の統計的有意性を決定します。

結果

寄生虫の測定。

寄生虫血の測定のために、血液細胞が最初に選択されるべきであり、ノイズ、破片および血小板は、FSC / SSCの特性（ 図2A）に基づいて、除外した。使用するフローサイトメーターに応じて、単一の細胞を、次いで、面積比（ 図2C）のいずれかでトリガーパルス幅（ 図2B）、またはFSCピーク高さに基づいて選択されるべ?...

ディスカッション

我々は、in vivoでのサンプルの両方寄生虫およびメロゾイトの侵入を測定するための方法を記載している。寄生虫血の測定に関しては、この方法は、それによって偽陽性事象の数を減少させる、PRBCを区別することができるHJ-赤血球における以前の方法^10-13に優る利点を提供する。 HJ-RBCは、ヒトでは通常まれですが、いくつかの研究では、これらの細胞とげっ歯類寄生虫の正確な...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
bisBenzimide H 33342 trihydrochloride	Sigma-Aldrich	B2261	Hoechst 33342. Store a 4 mM stock solution at -20 °C in distilled water
Hoechst 34580	Sigma-Aldrich	63493	Store a 2 mM stock solution at -20 °C in distilled water
JC-1 Dye	Life Technologies	T-3168	Store small aliquots of 6 mM stock solution at -20 °C in DMSO
Anti-Mouse CD45 APC-eFluor 780	eBioscience	47-0451-80	Clone 30-F11
Anti-Mouse CD71 PerCP-eFluor 710	eBioscience	46-0711-80	Clone R17217
Atto 633 NHS ester	Sigma-Aldrich	1464	Atto 633-NHS. Store a 2 mg/ml stock solution at -20 °C in DMF
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin	Thermo Fisher Scientific	21335	Biotin-NHS. Store a 25 mg/ml stock solution at -20 °C in DMF
Streptavidin PE-Cyanine7	eBioscience	25-4317-82	Streptavidin PE-Cy7
Heparin	Sigma-Aldrich	H478
35 µM filter cap tubes	Becton Dickinson	352235
Flow cytometer: BD LSRFortessa	Becton Dickinson
Flow cytometer: BD FACSAria II	Becton Dickinson
Flow cytometer: BD Influx	Becton Dickinson
Flow cytometer: CyAn ADP Analyzer	Beckman Coulter