In-vivo-Bewertung der Nager Plasmodium Parasitämie und Merozoite Invasion durch Durchflusszytometrie

Zusammenfassung

Die Malaria-Parasiten dringt und Wiederholungen in den roten Blutkörperchen. Die genaue Beurteilung der Merozoiten Invasion und Parasitämie ist daher entscheidend für die Beurteilung der Verlauf der Malaria-Infektion. Hier beschreiben wir eine Durchflusszytometrie basiertes Protokoll für die Messung dieser Parameter in einem Maus-Modell der Malaria.

Zusammenfassung

During blood stage infection, malaria parasites invade, mature, and replicate within red blood cells (RBCs). This results in a regular growth cycle and an exponential increase in the proportion of malaria infected RBCs, known as parasitemia. We describe a flow cytometry based protocol which utilizes a combination of the DNA dye Hoechst, and the mitochondrial membrane potential dye, JC-1, to identify RBCs which contain parasites and therefore the parasitemia, of in vivo blood samples from Plasmodium chabaudi adami DS infected mice. Using this approach, in combination with fluorescently conjugated antibodies, parasitized RBCs can be distinguished from leukocytes, RBC progenitors, and RBCs containing Howell-Jolly bodies (HJ-RBCs), with a limit of detection of 0.007% parasitemia. Additionally, we outline a method for the comparative assessment of merozoite invasion into two different RBC populations. In this assay RBCs, labeled with two distinct compounds identifiable by flow cytometry, are transfused into infected mice. The relative rate of invasion into the two populations can then be assessed by flow cytometry based on the proportion of parasitized RBCs in each population over time. This combined approach allows the accurate measurement of both parasitemia and merozoite invasion in an in vivo model of malaria infection.

Einleitung

The clinical symptoms associated with malaria occur during the Plasmodium parasite’s asexual replicative cycle within red blood cells (RBCs). Merozoites, released during the liver stage of infection, quickly attach to and invade RBCs. After gaining entry into the cell, the parasite grows and matures, eventually undergoing schizogony, splitting open the cell, and releasing a cluster of newly formed merozoites which go on to repeat this cycle. As such, an assessment of malaria infection often involves monitoring both parasitemia, which is the percentage of RBCs appropriated by one or more parasites, and the rate of merozoite invasion into uninfected RBCs.

Flow cytometry is a powerful tool which can be used to record the properties of vast numbers of cells in a short period of time. This technique has clear applicability for the measurement of malaria parasitemia and invasion, and offers several advantages over traditional microscopy techniques. These include the accurate measurement of very low parasitemia, which would be prohibitively time consuming by microscopy, the unbiased nature of the measurement, and the ability to measure multiple cell parameters simultaneously. Flow cytometry is widely used to determine both parasitemia and merozoite invasion in in vitro culture^1-9, however, techniques for measuring these parameters in vivo are less well developed, and can be complicated by the presence of additional cell types which interfere with analysis. No assays have been described for measurement of in vivo invasion, and while some assays exist for the analysis of in vivo parasitemia, these lack the ability to distinguish between parasitized RBCs (pRBCs) and RBCs containing Howell-Jolly bodies (HJ-RBCs)^10-13. The later issue is particularly important as in mice HJ-RBCs may account for up to 0.9% of mature RBCs^14-16, thereby preventing the accurate measurement of low parasitemia.

We have previously demonstrated an approach for the measurement of parasitemia and merozoite invasion in a rodent model of malaria infection¹⁴. Here, we provide a more detailed protocol and accompanying video. This approach builds on previous methodologies and allows for the accurate identification of parasitized RBCs, as distinct from leukocytes, RBC progenitors, and HJ-RBCs. Additionally, this assay allows the simultaneous measurement of merozoite invasion into two labeled RBC populations, a treated, or target, population, and a control population, thereby providing a robust platform for the assessment of invasion into different cell types.

Protokoll

Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Macquarie University durchgeführt und entsprach der nationalen Gesundheits-und Medical Research Council (NHMRC) Australian Verhaltenskodex. Die Arbeit wurde im Rahmen des Abkommens Ethik Kein ARA 2012/017 genehmigt und von der Tierethikkommission an der Macquarie Universität erhalten durchgeführt. Alle Experimente wurden an SJL / J-Mäusen durchgeführt, sofern nicht anders angegeben.

1. Mäuse und experimentelle Malariainfektion

1. Hausmäuse bei kontrollierter Temperatur (21 ° C) mit einem 12:12 Stunden Licht-Dunkel-Zyklus.
2. Tauwetter ein Aliquot von kryokonservierten P. chabaudi adami DS mit 5% parasitierten Erythrozyten (PRBCs) und injizieren 200 ul in die Bauchhöhle von C57BL / 6 Spendermaus.
3. Überwachen Spendermaus Parasitämie alle 1 - 2 Tage mittels Durchflusszytometrie, wie in Abschnitt 3 beschrieben - 4 dieses Protokolls. Sobald Spendern erreicht 5 - 15% Parasitämie, sammeln Blut durch Herzpunktion wie folgt:
   1. Aspirat 100 ul Heparin (300 U / ml Heparin in der Maus Ringer-Lösung (MTR) (154 mM NaCl, 5,6 mM KCl, 1 mM MgCl _2, 2,2 mM CaCl _2, 20 mM HEPES, 10 mM Glucose, 30 U / ml Heparin, pH 7,4, 0,22 um Filter sterilisiert)) in eine 1 ml Spritze mit einer 26 G-Nadel.
   2. Anesthetize die Maus durch Inhalation mit 5% Isofluoran bestätigte die gewünschte Tiefe der Anästhesie durch Fehlen Pedalrückzugsreaktion und Hornhautreflexe.
   3. Platzieren der Maus auf die Seite und senkrecht Einstichkanüle gerade unterhalb des Ellenbogens, durch die Rippen und in das Herz. Langsam herausziehen Spritzenkolben und drehen Nadel bis 0,5-1 ml Blut erhalten wird.
   4. Führen humane Sterbehilfe durch Genickbruch unter Narkose.
4. Berechne die prbcS pro Volumen von Spenderblut Annahme einer Blutbild von 9 x 10 ⁶ RBC / ul (dh, wenn der Spender mit 10% Parasitämie bei geopfert Blut 9 x 10 ⁵ enthältpRBC / ul). Verdünne parasitierten Blut in Krebs-gepufferter Salzlösung (126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 25 mM NaHCO _3, 1,2 mM NaH ₂ PO _4, 1,2 mM MgCl _2, 2,5 mM CaCl _2, 0,2% Glucose, pH 7,2, 0,22 um Filter sterilisiert) so dass die Konzentration 1 x 10 ⁴ prbcS pro 200 & mgr; l und 200 & mgr; l Injektion in die Bauchhöhle von Mäusen für die RBC Kennzeichnung und Transfusionsexperiment erforderlich.
5. Überwachen Parasitämie alle 1 - 2 Tage mittels Durchflusszytometrie als in den Abschnitten 3 beschrieben - 4 dieses Protokolls.

2. Markierung der Erythrozyten und Transfusions

1. Sammeln heparinisiertem Blut von Mäusen durch Herzpunktion, wie in Schritt 1.3 beschrieben, und legen Sie auf dem Eis. Halten Blut bei 4 ° C zu allen Zeiten. Sammeln etwa 200 ul Blut pro Maus injiziert werden. Bei Bedarf aufgeteilt Blut in zwei Proben und Behandlung einer Probe, wie gewünscht.
   HINWEIS: Auf diese Weise Invasion der behandelten sample kann zu einer Kontrolle verglichen werden, unbehandelten Probe (siehe Abbildung 1 schematisch).
2. Bereiten Sie eine 2x Lösung von jeder Leuchtstoff RBC-Label.
   1. Verdünne eine 2 mg / ml Stammlösung von Atto 633-N-Hydroxysuccinimid (Atto 633-NHS) in MTR so daß die Konzentration 20 ug / ml.
   2. Verdünne mit 25 mg / ml Vorratslösung von Biotin-N-hydroxysuccinimidester (Biotin-NHS) in MTR so daß die Konzentration 250 ug / ml.
3. Aufgeteilt Blutproben in zwei Röhrchen entnommen und das gleiche Volumen von 2x Atto 633-NHS-Lösung auf ein Rohr, und ein gleiches Volumen von 2x-Biotin-NHS zur anderen Röhre. Mischen Sie sofort. Inkubieren Blut bei 4 ° C für 1 h mit konstantem langsamem Mischen oder alternativ mischen Probe jedes 10-15 min.
4. Blut beschriftet 3 Mal Waschen mit MTRC (MTR + 0,5% Rinderserumalbumin (BSA), 0,22 um Filter sterilisiert) wie folgt:
   1. Fügen Sie mindestens 2 Volumina MTRC, Zentrifuge bei 750 xg für 5 min, entfernen Sie den Überstand und resuspend die Pellets in mindestens 2 Volumina MTRC. Wiederholen Sie 2 weitere Male.
   2. Nach dem letzten Waschen, Zentrifugieren bei 750 × g für 5 min pelletiert und verbinden das Blut in verschiedenen Kombinationen (dh unbehandelten Atto 633 / Biotin behandelten, unbehandelten Biotin / behandelt Atto 633). Hinzufügen MTR bis zu einem Volumen von 200 ul pro Maus zu machen, eingespritzt werden.
5. Injizieren beschriftet Blut intravaskulär in Nagetier Malaria infizierten Mäusen oder infizierten Kontrollen wie folgt:
   1. Führen Trans bei 2 - 15% Parasitämie am Gipfel des Parasiten Schizonten.
      HINWEIS: In diesem Fall etwa in der Mitte durch die Dunkel-Zyklus (dh zwischen 12 bis 2 Uhr morgens an einem normalen Lichtzyklus oder 12-2 Uhr an einem umgekehrten Lichtzyklus).
   2. Warm-Mäuse mit einer Wärmelampe für 5-10 Minuten, um den Blutfluss zu erhöhen, aber keine Vorkehrungen, um die Mäuse überhitzen. Zeigen Mäuse in einem Rückhalteeinrichtung und intravaskulär injizieren 200 ul markierte Blut (ca. 1 - 2 x 10 ⁹ RBCs) über die Schwanzvene.
6. Sammeln von Blutproben zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Injektion, wie in Abschnitt 3 beschrieben.
   HINWEIS: Invasion Raten von weniger als 10 min nach der Injektion quantitativ bestimmt werden, abhängig von Parasitämie der Empfängermaus.

3. Entnahme von Blutproben und Vorbereitung für die Durchflusszytometrie

1. Vorbereitung 50 ul Farblösung pro Probe plus zusätzliche, am Tag des Experiments wie folgt:
   1. Abtauen eines Aliquots von 6 mM JC-1 bei -20 ° C in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelagert.
   2. Warm 50 ul MTRC pro Probe, plus extra, auf 37 ° C.
   3. Während kontinuierlich Vortexen des vorgewärmten MTRC Fügen JC-1, so dass die Endkonzentration 12 & mgr; M. Dies wird gemacht, um die Bildung von JC-1-Aggregate zu reduzieren; wenn Sie bilden Aggregate, nicht Zentrifugenröhrchen, da dies Färbung zu verhindern.
      ANMERKUNG: Eine kleine Menge von Aggregation hat keinen Einfluss auf Ergebnisse.
   4. Anti hinzufügenCD45 APC eFluor 780 und Anti-CD71 PerCP eFluor 710, so dass die Endkonzentration 1 ug / ml. Bei Durchführung des markierten RBC Experiment hinzuzufügen Streptavidin PE-Cy7, so daß die Endkonzentration 1 ug / ml.
2. Führen Schwanz Blutungen durch Amputation der Schwanzspitze oder Platzwunde des Blutgefäßes in den Schwanz. Geben Sie einen Tropfen Blut Schwanz auf eine kleine wiegen Boot oder Glasträger. Nach der Blutentnahme, sicherzustellen, dass die Blutung aufgehört hat. Pipette 3 ul Schwanzblut in 50 & mgr; l Färbelösung auf 37 ° C vorgewärmt und Heizen von Proben bei 37 ° C für 20 min.
3. Abtauen eines Aliquots 4 mM Hoechst 33342 bei -20 ° C in destilliertem Wasser (bei Verwendung eines 355 nm Laser) gespeichert oder 2 mM Hoechst 34580 bei -20 ° C in destilliertem Wasser (bei Verwendung eines 405 nm Laser) gespeichert. Bereiten Sie 500 ul pro Probe, plus extra, einer 4 & mgr; M oder 2 uM Lösung von Hoechst in MTRC auf.
4. Fügen Sie 500 ul von 4 uM Hoechst33.342 oder 2 uM Hoechst 34.580 Proben und Inkubation bei Raumtemperatur für 20 min.
5. Zentrifuge Zellen bei 750 g für 3 min bei 4 ° C, Überstand verwerfen, fügen 700 ul MTRC und durch Strömungs analysieren Zytometrie.

4. Durchflusszytometrie

1. Analysieren Sie die Proben mit einem 355/488/633 nm Laser oder 405/488/633 nm Lasergerät.
2. Filter Proben durch einen 35 um Zellsieb unmittelbar vor der Analyse. Spülen Zellsieb mit destilliertem Wasser zwischen den Proben und Wiederverwendung.
3. Nehmen Sie genug Ereignisse, so dass die kleinste Bevölkerung mindestens 500 Ereignisse (in der Regel eine Million - 10 Millionen Gesamt Ereignisse pro Probe).
4. Excite Hoechst 33342 mit einem 355-nm-Laser und erkennt Ereignisse durch eine 460/50-Filter. Excite Hoechst 34580 mit einem 405-nm-Laser und erkennt Ereignisse durch eine 460/50-Filter. Excite JC-1, anti-CD71 PerCP eFluor 710 und Streptavidin PE-Cy7 mit einem 488-nm-Laser und erkennt Ereignisse durch ein 530/40, 692/40 und 750LP filtern jeweiligenly. Excite Atto 633 und Anti-CD45 APC eFluor 780 mit einem 633-nm-Laser und erkennt Ereignisse durch ein 670/30 oder 750LP-Filter auf.
5. Führen Sie die Analyse und Kompensation mit geeigneten Durchflusszytometrie-Analyse-Software wie folgt:
   1. Wählen ganze Zellen und verstehen sich inklusive Lärm, Schmutz und Blutplättchen basierend auf FSC / SSC Eigenschaften (Abbildung 2A). Auswahl einzelner Zellen, die entweder auf Triggerimpulsbreite (2B) oder mit dem FSC-Peakfläche zu Höhe Verhältnis (2C).
   2. Wählen reifen Erythrozyten und schließen RBC Vorläuferzellen und Leukozyten, basierend auf negativen Fluoreszenz in den PerCP eFluor 710 und APC eFluor 780 Kanäle (2D).
   3. Beim Arbeiten mit der Bezeichnung RBC Experiment, wählen Sie die einzelnen Population markierter Erythrozyten auf Basis von PE-Cy7 und Atto 633 Fluoreszenz und analysieren diese separat (3A).
   4. Wählen Sie basierend auf positive Fluoreszenz sowohl für JC-1 und Hoechst PRBCs ( 2E-H).

5. Berechnungen und Statistik

1. Berechnen Parasitämie durch Dividieren der Anzahl von prbcS durch die Gesamtzahl von Erythrozyten (dh die Anzahl von Ereignissen in Gate Q2 in Gatters G4 geteilt durch die Anzahl von Ereignissen). Bei der Durchführung des Invasionsassay Parasitämie der beiden markierten Populationen, indem die Anzahl der markierten prbcS durch die Anzahl der markierten RBCs in der Population (berechnet, dh, die Anzahl der Ereignisse, die in beide Tore L1 und Q2 sind, dividiert durch die Anzahl der Ereignisse, im Tor L1).
   HINWEIS: Labeled Parasitämie variiert beträchtlich in Abhängigkeit von Faktoren wie beispielsweise die endogene Parasitämie und Anzahl zirkulierender Merozoiten. Aus diesem Grund ist es hilfreich, die Parasitämie Verhältnis, das als das Parasitämie des behandelten markierten Population in jeder einzelnen Maus, geteilt durch die Parasitämie der Steuer markierten Population berechnete melden. Um mögliche Farbeffekte zu korrigieren, führt zu einem Berichts eine durchschnittliche Parasitämie Verhältnis zwischen den beiden Farbstoffkombinationen.
2. Bestimmen Sie eine statistische Signifikanz von Verhältnissen mit dem eine Probe t-Test mit 1 als hypothetische Mittelwert.

Ergebnisse

Die Messung der Parasitämie.

Für die Messung der Parasitämie sollte Blutkörperchen zuerst ausgewählt werden, und Lärm, Schmutz und Plättchen ausgeschlossen, bezogen auf FSC / SSC-Eigenschaften (2A). Abhängig von der Zytometer verwendet wird, sollten einzelne Zellen dann basierend auf jeder Triggerimpulsbreite (2B) oder FSC Peakhöhe auf Flächenverhältnis (2C) ausgewählt werden. Verbleibende Ereignisse sollten von Leukozyten bestehen,...

Diskussion

Wir haben ein Verfahren für die gleichzeitige Messung von Parasitämie und Merozoiten Invasion in vivo Proben beschrieben. In Bezug auf die Parasitämie Messung bietet dieses Verfahren einen Vorteil gegenüber bisherigen Methoden ^10-13 in diesem HJ-Erythrozyten aus PRBCs unterschieden werden, wodurch die Anzahl der falsch-positive Ereignisse zu reduzieren. Während HJ-RBCs sind gewöhnlich beim Menschen selten einige Studien berichten hohen Niveaus in Mäusen ^15,16 die Unterscheidung zwis...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
bisBenzimide H 33342 trihydrochloride	Sigma-Aldrich	B2261	Hoechst 33342. Store a 4 mM stock solution at -20 °C in distilled water
Hoechst 34580	Sigma-Aldrich	63493	Store a 2 mM stock solution at -20 °C in distilled water
JC-1 Dye	Life Technologies	T-3168	Store small aliquots of 6 mM stock solution at -20 °C in DMSO
Anti-Mouse CD45 APC-eFluor 780	eBioscience	47-0451-80	Clone 30-F11
Anti-Mouse CD71 PerCP-eFluor 710	eBioscience	46-0711-80	Clone R17217
Atto 633 NHS ester	Sigma-Aldrich	1464	Atto 633-NHS. Store a 2 mg/ml stock solution at -20 °C in DMF
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin	Thermo Fisher Scientific	21335	Biotin-NHS. Store a 25 mg/ml stock solution at -20 °C in DMF
Streptavidin PE-Cyanine7	eBioscience	25-4317-82	Streptavidin PE-Cy7
Heparin	Sigma-Aldrich	H478
35 µM filter cap tubes	Becton Dickinson	352235
Flow cytometer: BD LSRFortessa	Becton Dickinson
Flow cytometer: BD FACSAria II	Becton Dickinson
Flow cytometer: BD Influx	Becton Dickinson
Flow cytometer: CyAn ADP Analyzer	Beckman Coulter