עשה ואל תעשה בהכנת השריר cryosections לניתוח היסטולוגית

Summary

Here we demonstrate the most efficient methods for freezing, embedding, cryosectioning, and staining of muscle biopsies to avoid freezing artifacts.

Abstract

הערכה היסטולוגית של ביופסיות שריר שימשה ככלי הכרחי בהבנה של ההתפתחות וההתקדמות של הפתולוגיה של הפרעות עצבית-שרירית. עם זאת, על מנת לעשות זאת, טיפול נכון צריך לקחת כאשר מוציא ושימור רקמות להשיג צביעה אופטימלית. אחת שיטות לשימור רקמות כרוכה תיקון רקמות בפורמלין ולאחר מכן הטבעתם בשעוות פרפין. שיטה זו שומרת מורפולוגיה היטב ומאפשרת לאחסון לטווח ארוך ב RT, אבל הוא מסורבל ודורשת טיפול בכימיקלים רעילים. יתר על כן, תוצאות קיבעון פורמלדהיד בקישור צולב אנטיגן, אשר מחייב פרוטוקולים אחזור אנטיגן לimmunostaining היעיל. להיפך, חתך קפוא אינו דורש קיבוע ובכך שומר על קונפורמציה אנטיגן ביולוגית. שיטה זו גם מספקת יתרון בולט בסיבוב מהיר סביב זמן, מה שהופך אותו לשימושי במיוחד במצבי צורך הערכה היסטולוגית מהירה כמו intraoperative ביופסיות כירורגיות. כאן אנו מתארים את השיטה היעילה ביותר להכנת ביופסיות שריר להדמיה עם כתמים היסטולוגית וחיסוניים שונים.

Introduction

בדיקה של היסטולוגיה השריר משחקת תפקיד קריטי בהבנת סוגים שונים של הפרעות עצבית-שרירית של ^1-4. בשילוב עם טכניקות אחרות, זה מאפשר לחוקרים לקבל מושג טוב יותר של הביטוי וההתקדמות של פתולוגיה וגם יכולים להיות חיוני כדי להעריך את היעילות של התערבות טיפולית ^5-10. עם זאת, כדי להיות מדויק, הרקמות צריכה להישמר בצורה הנכונה על מנת לשמר את המצב הפיזיולוגי מייד לפני הכריתה. זה דורש זהירות רבה במהלך ההסרה, שימור, חתך, וצביעה.

ניתן להכין רקמות בשתי דרכים שונות למחקר מיקרוסקופי אור. השיטה, פרפין פורמלין הקבוע הראשון משובץ קטעים (FFPE), דורש רקמות להיות קבועים בפורמלין שנאגרו טבעי 10% לפני שמוטבעים בשעוות פרפין ^11,12. צעד הקיבעון עוזר לשמר מורפולוגיה טובה יותר, אבל יחסי ציבור אנדוגני קישורים גם צולביםoteins לפיכך מחייב נהלים אחזור אנטיגן המורכב עבור immunostaining ומבטל את האפשרות של מכתים האנזימטית בסעיפים כגון ^12. חלקים קפואים, לעומת זאת, לא צריכים להיות מראש קבועים או מעובד; לכן, חלבונים יכולים לשמור תצורות ביולוגיות יליד ^13,14. יתר על כן, חלקים קפואים גם לאפשר לזמן אספקה ​​מהיר, שלעתים יש צורך, למשל באבחון תוך הניתוחי של סרקומות וביופסיות כירורגיות אחרות ^15. עם זאת, אם לא נעשה כראוי, בשיטה זו היא נוטה להקפיא נזק, אשר מציג שינויים בארכיטקטורת שרירים מה שהופכים את החלקים שאינם ראויים לבדיקה היסטולוגית. מאמר זה מתאר את השיטה היעילה ביותר להכנת ביופסיות שריר על מנת להשיג צביעה אופטימלית לבדיקה נאותה.

Protocol

1. רקמות קציר והקפאת רקמות שריר

1. להרדים את העכבר עם מנת יתר של isoflurane (2-כלורו-2- (difluoromethoxy) -1,1,1-trifluoro-אתאן). לבצע שלב זה במנדף ולהשתמש בשיטת בלימה משנית כגון ייבוש או צנצנת פעמון המכילה מקלון צמר גפן הטבול בisoflurane.
2. לאשר מוות על ידי תקיפות לוחצים שודד דרכים. להשתמש בשיטה משנית של המתת חסד כגון נקע בצוואר הרחם.
3. להרטיב את הפרווה עם אלכוהול 70% כדי לצמצם את דבק של קווצות שיער רופפות על השרירים. לקלף את העור מהאיבר באמצעות מלקחיים עדינים כגון מס '5.
4. בזהירות להפריד את השריר של עניין (tibialis קדמי (ת"א) במקרה זה) מהעצמות מתחת, החל מהגיד ולהסיר.
5. בלו השריר, לכסות אותו באוקטובר (מתחם טמפרטורה אופטימלי חיתוך), ולהניח אותה שטוח על תבנית הקפאה חד פעמית שכותרת. ודא שהשרירים הוא בה נטייה פיזיולוגית נורמלית (ועד ראש טאייב) ללא מתיחה. לחלופין, להקפיא את השריר על ריבועי קלקר קטנים ולהצמיד אותו באמצעות סיכות חרקים כדי להבטיח את האורך הנכון של השרירים.
6. צ'יל 2-methylbutane (איזופנטאן) בכוס פלדה באמצעות חנקן נוזלי. זה לוקח על 3 ממוצעת - 5 דקות. שמור ערבוב לסירוגין עד משקעים לבנים מתחילים טופס בתחתית והקירות של הכוס.
   הערה: כאשר זה קורה, הגיע איזופנטאן טמפרטורת הקפאה אופטימלית (-150 ° C)
7. טובלים את התבניות המכילות שרירים ב2-methylbutane המצונן. להקפיא את השרירים קטנים כגון longus digitorum הסרעפת והפושטים (אדי) במשך 6 - 12 שניות ושרירים גדולים יותר כמו soleus הגסטרוקנמיוס (GS) והיד אחורית במשך 15 - 20 שניות. אין להקפיא את השרירים במשך זמן רב מדי שכן הדבר עלול להוביל לפיצוח.
8. העבר את הרקמות הקפואות בקרח יבש וללתת להתאדות איזופנטאן (שים לב שתהליך זה לוקח בממוצע כ -15 - 20 דקות). לעטוף את הרקמות ברדיד אלומיניום ולאחסן אותם בuטמפרטורת ltra נמוכה (C -70 ° C עד -80 °) עד חתך.

2. Embedding הרקמות ב אוקטובר להכין בלוק רקמות

1. רקמות תחבורה על קרח יבש לcyrostat כדי למנוע הפשרה. העברת רקמות לcryostat קאמרית (שנקבע ב -20 ל-24 מעלות צלזיוס, כדי למנוע הפשרה מלאה של רקמות) ולתת להם לאזן במשך 30 דקות.
2. הפעל מפרץ פלטייה קירור ב. אם cryostat אין קירור זה, להשתמש בתרסיס קירור תרסיס להקפיא במהירות OCT. אל תתנו להפשרת שרירים בכל נקודה במהלך ההטבעה כמו זה יכול לגרום לנזק הקפאה.
3. להוסיף שכבה דקה אחידה של אוקטובר בדיסק הדגימה ולתת לו מגניב. כאשר רוב OCT קפוא בתחתית ועדיין נוזליים על גבי, הכנס את הרקמה בכיוון הנכון (בניצב לאוקטובר לסעיפים ומקביל רוחביים לאוקטובר לסעיפים אורך). להשתמש בתרסיס קירור תרסיס להקפיא במהירות אוקטובר לגעת בחלק unembeded של הרקמות עם שלוחה חוםractor ולחכות 45 שניות.
4. להוסיף עוד שכבה דקה של אוקטובר סביב השריר, לרסס עם תרסיס קירור תרסיסים ולחלץ את החום כמו בשלב הקודם.
5. לשמור על הוספת אוקטובר במרווחים קטנים ובמהירות להקפיא ב- OCT באמצעות שילוב של תרסיס ספריי קירור וחולץ חום עד שכל השריר מכוסה.
6. שים חולץ החום בחלק העליון של בלוק הרקמה ולחכות 5 דקות.

3. הכנת סעיפים וזיהוי הסעיפים מאזור אמצע בטן של השרירים

1. הר הדגימה על ראש הדגימה. הדק את הידית כדי לאבטח את הדיסק. ודא שהדיסק הדגימה הוא במגע טוב עם ראש הדגימה.
2. כוון את טמפרטורת החדר לבין -21 ו-24 מעלות צלזיוס ולחכות עד שטמפרטורת הסט מושגת.
3. התאם את הגדרות העובי (7 מיקרומטר); חתוך את הבלוק על ידי קידום או חוזרים בי לחסום באמצעות הגדרות גסות ועדינות.
4. לאסוף את החלקיםבטרום חימם שקופיות מיקרוסקופ טעונות חיובי על ידי לחיצה על גבי השקופית על הסעיפים, באמצעות המשיכה בין מטענים המנוגדים כדי להקל על הדבקות של החלקים לחתוך לשקופית.
5. זהה את החלקים באמצע הבטן-ידי מדידת שטח חתך (CSA) של החלקים. האם תוכנת הדמיה באמצעות זה במחשב שמחובר למיקרוסקופ.
   הערה: תמונות בניגוד השלב נלקחות והיקף של כל השריר נמדד באמצעות פונקצית מעקב על התוכנה. זו תניב שני CSA כמו גם קוטר חמוס מינימום (מדד לגודל חתך סיבים שמתבטא במרחק הקטן ביותר בין שני משיקים מקבילים בצדדים מנוגדים של חלקיק) מדידות. הערה: כאשר מדידות CSA וקוטר חמוס מינימום מתחילות רמה, כבר הגיעה באמצע הבטן.
6. מלאי וארכיון השקופיות ב -80 ° C לצביעת עתיד.
   הערה: Oct לא צריך להסיר לפני staininנהלי g. ברגע שקופיות coverslipped, הם מוכנים להיות מוכתמים באופן מיידי.

4. מכתים

הערה: בעוד שניתן למצוא נהלי צעד-אחר-צעד מפורטים בגיליון הנתונים של המוצר וצריך להיות בעקבות הליכים מכתים, ייתכן שיהיה צורך אופטימיזציה אישי להשיג צביעה אופטימלית.

1. בגלל ההרכבה תקשורת (ראה טבלה) היא לא בליל עם מים, מייבשים שקופיות באמצעות ציונים גוברים של אלכוהול (2 דקות כל אחד ב -70%, 95%, ו 100% אתנול) ולנקות אותם עם קסילן (5 דקות) 100% על מנת להבטיח מגלשות לא להיות אטומות לאורך זמן.
2. Coverslip סעיפים ולתת להם להתייבש. תמונה עם מיקרוסקופ מצויד בתוכנת הדמיה.

תוצאות

ההגדרה לקציר והקפאת רקמות שניתן לראות באיור 1. רקמות נכרת צריכה להיות מאוחסנות בגזה טבולה בPBS להימנע (איור 1 א) ייבוש. כאשר רקמות נבחרו לשמש לניתוח היסטולוגית הם צריכים להיות טבולים בOCT ומונחים על תבנית cryo בכיוון הנכון וקרוב לאורך פיסיולוגי ככל האפשר ...

Discussion

היסטולוגיה ואימונוהיסטוכימיה שימשו ככלים מרכזיים בהבנת הביטוי וההתקדמות של פתולוגיה בהפרעות עצבית-שרירית שונות. קלסי, ביופסיות שריר היו קבועות ראשונה בפורמלין ולאחר מכן משובצות בשעוות פרפין. בעוד קיבעון פורמלדהיד שומר ארכיטקטורת רקמה ומאפשר אחסון והובלת רקמה ב RT,...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cryostat	Leica CM 1850	Leica Microsystems Inc.	Buffalo Grove, IL 60089 U.S.A., office phone 1-800-248-0123 Alternative: Richard Allen Scientific
Microscope	Nikon Eclipse 50i	Nikon Instruments Inc.	1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064 U.S.A., Phone: 1-631-547-8500 Alternative: Olympus
Image analysis software	Nikon Imaging Software Basic Research	Nikon Instruments Inc.	1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064, U.S.A., Phone: 1-631-547-8500 Alternatives: Image J, Metamorph
Isoflurane	14043-220-05	JD Medical Dist. Co., Inc.	1923 West Peoria Avenue, Phoenix, AZ 85029 U.S.A.
OCT	4583	Sakura Inc.	Torrence, CA 90501 U.S.A. Alternative source: Leica Microsystem
Freeze It	23-022524	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA, 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific
Disposable tissue mold	22-363-554	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific
Colorfrost plus slides	9991001	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific
Acetone	650501-4L	Sigma-Aldrich	3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific
Ethyl alcohol	HC-1300-1GL	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific
2-methyl butane	M 32631-SL	Sigma-Aldrich	3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific
Xylene	HC-7001GA	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific
Cytoseal 280	8311-4	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific
Hematoxylin Gill #3	CS402-1D	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific
Eosin	6766007	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific