À faire et à ne pas faire dans la préparation de Muscle cryosections pour l'analyse histologique

Résumé

Here we demonstrate the most efficient methods for freezing, embedding, cryosectioning, and staining of muscle biopsies to avoid freezing artifacts.

Résumé

Examen histologique des biopsies musculaires a servi comme un outil indispensable dans la compréhension du développement et la progression de la pathologie des troubles neuromusculaires. Toutefois, afin de le faire, des soins appropriés doivent être prises lorsque l'excision et la préservation de tissus pour obtenir une coloration optimale. Une méthode de préservation des tissus consiste à fixer les tissus en formaldéhyde, puis les incorporer à la cire de paraffine. Cette méthode préserve la morphologie bien et permet le stockage à long terme à température ambiante, mais est lourde et nécessite une manipulation de produits chimiques toxiques. En outre, des résultats formaldéhyde de fixation à l'antigène reticulation, ce qui nécessite des protocoles d'extraction d'antigène efficace pour immunocoloration. Au contraire, le sectionnement congelé ne nécessite pas de fixation et conserve ainsi biologique antigène conformation. Cette méthode fournit également un avantage distinct à son tour rapide autour du temps, ce qui rend particulièrement utile dans les situations nécessitant une évaluation histologique rapide comme intraoperative biopsies chirurgicales. Ici, nous décrivons la méthode la plus efficace de préparer des biopsies musculaires pour la visualisation avec différents colorants histologiques et immunologiques.

Introduction

L'examen de l'histologie des muscles joue un rôle critique dans la compréhension des différents types de troubles neuromusculaires ^4.1. Lorsqu'il est combiné avec d'autres techniques, il permet aux chercheurs d'obtenir une meilleure idée de la manifestation et de la progression de la pathologie et peuvent aussi être essentiel pour évaluer l'efficacité d'une intervention thérapeutique ^5-10. Toutefois, pour être précis, les tissus doivent être préservées de la manière appropriée afin de préserver immédiatement l'état physiologique avant l'excision. Cela exige un grand soin lors de l'enlèvement, de la préservation, de sectionnement et coloration.

Les tissus peuvent être préparés de deux façons différentes pour étude au microscope optique. La première méthode, fixés au formol (FFPE) paraffine sections, embarqué nécessite tissus à fixer dans les 10% de formaldéhyde tamponnée naturelle avant d'être intégré avec la cire de paraffine ^11,12. L'étape de fixation permet de préserver la morphologie mieux, mais aussi des liens croisés pr endogèneoteins nécessitant ainsi des procédures de récupération d'antigène complexe pour un marquage et d'éliminer la possibilité de coloration enzymatique sur ces articles ^12. Coupes congelées, d'autre part, ne doivent pas être pré-fixe ou traitées; par conséquent, les protéines sont capables de retenir des conformations natives ^13,14 biologiques. En outre, des coupes congelées permettent également un gain de temps, ce qui est parfois nécessaire, par exemple dans le diagnostic peropératoire de sarcomes et autres biopsies chirurgicales ^15. Toutefois, si ne pas fait correctement, cette méthode est sujette à des dommages par congélation, qui apporte des modifications à l'architecture musculaire rendant les sections impropres à l'examen histologique. Ce document décrit la méthode la plus efficace pour préparer des biopsies musculaires afin de parvenir à coloration optimale pour examen approprié.

Protocole

1. Tissue récolte et de congélation des tissus musculaires

1. Euthanasier la souris avec une dose excessive de l'isoflurane (2-chloro-2- (difluorométhoxy) -1,1,1-trifluoro-éthane). Effectuez cette étape dans une hotte et utiliser une méthode de confinement secondaire comme un dessiccateur ou une cloche de verre contenant un coton-tige imbibé d'isoflurane.
2. Confirmer la mort en serrant fermement coussinet plantaire. Utilisez une méthode secondaire de l'euthanasie telle que la dislocation cervicale.
3. Mouiller la fourrure avec 70% d'alcool pour réduire le collage des mèches de cheveux en vrac sur les muscles. Peler la peau du membre en utilisant une pince fine tels que # 5.
4. Séparez délicatement le muscle d'intérêt (jambier antérieur (TA) dans ce cas) à partir des os en dessous, à partir du tendon et à enlever.
5. Exciser le muscle, le couvrir dans l'OCT (coupe optimale du composé Température), et posez-le à plat sur un moule de congélation jetable marqué. Assurez-vous que le muscle est à son orientation physiologique normal (tête tail) sans étirement. Alternativement, geler le muscle sur des petits carrés de mousse de polystyrène et l'épingler en utilisant des épingles insectes pour assurer la bonne longueur des muscles.
6. Réfrigérer 2-méthylbutane (isopentane) dans un bêcher en acier avec de l'azote liquide. Cela prend en moyenne de 3 - 5 min. Gardez en remuant de façon intermittente jusqu'à précipités blancs commencent à se former sur le fond et les parois du bécher.
   REMARQUE: Lorsque cela se produit, l'isopentane a atteint la température de congélation optimale (-150 ° C)
7. Trempez les moules contenant muscles dans le réfrigérée 2-méthylbutane. Congeler petits muscles comme le muscle long extenseur des orteils diaphragme et (EDL) pour les 6 - 12 sec et gros muscles comme le soléaire gastrocnémien (GS) et les triceps pour 15 - 20 sec. Ne pas congeler les muscles trop longtemps car cela pourrait conduire à la fissuration.
8. Transférer les tissus congelés sur de la glace sèche et laissez évaporer isopentane (à noter que ce processus prend en moyenne environ 15 - 20 min). Envelopper les tissus dans du papier aluminium et les stocker à ultra basse température (-70 ° C à -80 ° C) jusqu'à ce que le sectionnement.

2. Intégrer les tissus dans PTOM Préparer bloc de tissu

1. tissus de transport sur la glace sèche pour cyrostat pour éviter la décongélation. tissu Transfert à cryostat chambre (mis à -20 à -24 ° C pour éviter la décongélation complète des tissus) et les laisser équilibrer pendant 30 min.
2. Tournez la baie de refroidissement Peltier sur. Si le cryostat ne possède pas ce refroidissement, utiliser un aérosol de refroidissement pour congeler rapidement les PTOM. Ne laissez pas le dégel musculaire à tout moment au cours de l'incorporation car cela peut entraîner des dommages dus au gel.
3. Ajouter une couche mince et uniforme de l'OCT sur le disque de l'échantillon et le laisser refroidir. Lorsque la plupart des PTOM est gelé sur le fond tout en liquide sur le dessus, insérez le tissu à l'orientation correcte (perpendiculaire PTOM pour les sections transversales et parallèles PTOM pour les sections longitudinales). Utilisez un aérosol de refroidissement pour congeler rapidement octobre Touchez la partie unembeded du tissu avec poste de chaleurractor et attendre 45 sec.
4. Ajoutez une autre couche mince de l'OCT autour du muscle, vaporiser avec un aérosol de refroidissement et d'extraire la chaleur comme dans l'étape précédente.
5. Continuez à ajouter des PTOM petits incréments et rapidement geler les PTOM en utilisant une combinaison d'aérosol et d'un extracteur de chaleur de refroidissement jusqu'à ce que le muscle entier est couvert.
6. Mettre l'extracteur de chaleur sur le dessus du bloc de tissu et attendre 5 min.

3. Préparer Sections et identifier les sections à partir de mi-ventre Région des Muscles

1. Placer le spécimen sur la tête de l'objet. Serrez la molette pour fixer le disque. Assurez-vous que la platine est en bon contact avec la tête de l'objet.
2. Réglez la température de la chambre à entre -21 et -24 ° C et attendre jusqu'à ce que la température de consigne est atteint.
3. Réglez les paramètres d'épaisseur (7 pm); couper le bloc en avançant ou en rétractant le bloc en utilisant les réglages grossiers et fins.
4. Recueillir les sectionspréchauffée sur des lames de microscope chargées positivement en appuyant sur la partie supérieure de la glissière sur les sections, en utilisant l'attraction entre les charges opposées pour faciliter l'adhérence des sections de coupe de la lame.
5. Identifier les sections à mi-ventre par mesure de surface en coupe transversale (CSA) des sections. Pour ce faire, le logiciel d'imagerie à l'aide de l'ordinateur qui est connecté au microscope.
   REMARQUE: des images à contraste de phase sont prises et la circonférence de l'ensemble du muscle est mesurée via une fonction de traçage sur le logiciel. Cela donnera à la fois la CSA ainsi que diamètre minimum de furet (mesure des fibres taille transversale qui est exprimé comme la plus petite distance entre deux tangentes parallèles sur les côtés opposés d'une particule) mesures. Remarque: Lors de la CSA et de diamètre de furet minimum mesures commencent à plateau, mi ventre a été atteint.
6. Inventaire et archiver les diapositives à -80 ° C pour la coloration avenir.
   REMARQUE: octobre n'a pas besoin d'être enlevé avant staininprocédures de g. Lorsque les lames sont sous une lamelle, ils sont prêts à être colorées immédiatement.

4. Coloration

REMARQUE: Bien que les procédures détaillées étape par étape peuvent être trouvés sur la feuille de données du produit et doivent être suivies pour les procédures de coloration, l'optimisation personnelle peut être nécessaire pour obtenir une coloration optimale.

1. Parce que les médias de montage (voir tableau) est non miscible à l'eau, déshydrater diapositives en augmentant les qualités d'alcool (2 min chacun à 70%, 95% et 100% d'éthanol) et les effacer avec du xylène (100% pendant 5 min) pour assurer diapositives ne deviennent pas opaque au fil du temps.
2. Lamelle sections et les laisser sécher. Image avec microscope équipé d'un logiciel d'imagerie.

Résultats

La mise en place pour la récolte et la congélation des tissus peut être vu sur la figure 1. Tissus excisés doivent être stockés sur une gaze trempée dans du PBS afin d'éviter le séchage (figure 1A). Lorsque les tissus sont sélectionnés pour être utilisé pour l'analyse histologique, ils devraient être trempés dans de l'OCT et disposés sur cryo moule dans le bon sens et que près de la longueur physiologique que possible pour assurer la morphologie précise

Discussion

Histologie et immunohistochimie ont été utilisés comme outils essentiels à la compréhension de la manifestation et l'évolution de la pathologie dans divers troubles neuromusculaires. Classiquement, les biopsies musculaires ont d'abord été fixés dans du formol puis intégrés avec de la cire de paraffine. Le formaldéhyde fixation préserve l'architecture des tissus et permet le stockage de tissus et de transport à température ambiante, il inactive également des enzymes et protéines reticulations...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cryostat	Leica CM 1850	Leica Microsystems Inc.	Buffalo Grove, IL 60089 U.S.A., office phone 1-800-248-0123 Alternative: Richard Allen Scientific
Microscope	Nikon Eclipse 50i	Nikon Instruments Inc.	1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064 U.S.A., Phone: 1-631-547-8500 Alternative: Olympus
Image analysis software	Nikon Imaging Software Basic Research	Nikon Instruments Inc.	1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064, U.S.A., Phone: 1-631-547-8500 Alternatives: Image J, Metamorph
Isoflurane	14043-220-05	JD Medical Dist. Co., Inc.	1923 West Peoria Avenue, Phoenix, AZ 85029 U.S.A.
OCT	4583	Sakura Inc.	Torrence, CA 90501 U.S.A. Alternative source: Leica Microsystem
Freeze It	23-022524	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA, 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific
Disposable tissue mold	22-363-554	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific
Colorfrost plus slides	9991001	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific
Acetone	650501-4L	Sigma-Aldrich	3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific
Ethyl alcohol	HC-1300-1GL	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific
2-methyl butane	M 32631-SL	Sigma-Aldrich	3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific
Xylene	HC-7001GA	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific
Cytoseal 280	8311-4	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific
Hematoxylin Gill #3	CS402-1D	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific
Eosin	6766007	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific