조직 학적 분석을위한 근육 저온부의 준비의 것과하지 말아야을 수행

요약

Here we demonstrate the most efficient methods for freezing, embedding, cryosectioning, and staining of muscle biopsies to avoid freezing artifacts.

초록

근육 생검의 조직 학적 평가는 신경 근육 질환의 병리의 개발 및 진행의​​ 이해에 필수적인 도구 역임했다. 그러나, 이렇게하기 위해, 적절한 치료는 절제 최적 염색을 달성하기 위해 조직을 보존 할 때 수행되어야한다. 조직 보존의 한 방법은 파라핀 왁스를 삽입 한 후 포름 알데히드의 조직을 고정하고 포함한다. 이 방법은 잘 형태를 유지하고 실온에서 장기간 보관이 가능하지만, 복잡하고 독성 화학 물질의 취급을 요구한다. 또한, 효과적인 면역 항원에 대한 검색 프로토콜을 필요 항원 가교, 포름 알데히드 고정 결과. 반대로, 동결 절편은 고정을 필요로하며, 따라서 생물 항원 형태를 유지하지 않는다. 이 방법은 intraopera 같은 빠른 조직 학적 평가를 필요로하는 상황에서이 특히 유용하고, 시간의 주위에 빠른 차례에 뚜렷한 장점을 제공합니다수술 적 생검을 포지티브,. 여기에서 우리는 다른 조직 학적 및 면역 학적 얼룩과 시각화를위한 근육 조직 검사를 준비하는 가장 효과적인 방법을 설명합니다.

서문

근육 조직 학적 검사는 신경근 장애 ^1-4의 다른 유형의 이해에 중요한 역할을한다. 다른 기술과 결합 할 때, 연구자들은 병리의 증상과 진행의 더 나은 아이디어를 얻을 수 있고 치료 적 개입 ^5-10의 효능을 평가하는 것이 필수적이 될 수 있습니다. 절단 직전의 생리 상태를 유지하도록하지만 정확한 것으로, 조직을 적절한 방식으로 유지 될 필요가있다. 이것은 제거, 보존, 절편 및 염색시 세심한주의가 필요합니다.

조직은 광학 현미경 연구를위한 두 가지 방법으로 제조 될 수있다. (FFPE) 섹션, 포함 된 첫 번째 방법, 포르말린 고정 파라핀 조직을 파라핀 왁스 ^{(11, 12)에} 포함되기 전에 10 % 자연 버퍼 포름 알데히드에 고정해야합니다. 정착 단계는 또한 크로스 링크 내인성 PR 나은 형태를 유지하는 데 도움oteins 따라서 면역 항원에 대한 복잡한 검색 절차를 필요로하며 ¹² 절에 효소 염색 가능성을 제거. 냉동 된 부분은, 다른 한편으로는, 미리 고정 된 또는 처리 될 필요가 없다; 따라서, 단백질은 고유 생물 입체 ^{(13, 14)을} 보유 할 수 있습니다. 또한, 동결 절편은 또한 때때로 육종 및 기타 외과 생검 ^(15)의 진단 수술, 예를 들어 필요한 빠른 처리 시간을 허용. 제대로 수행하지 않을 경우 그러나,이 방법은 조직 학적 검사에 대한 부분은 부적당하고 근육 구조에 대한 변경 사항을 소개 손상을 동결하는 경향이있다. 이 논문은 적절한 검사를위한 최적의 염색을 달성하기 위해 근육 조직 검사를 준비하는 가장 효과적인 방법을 개설 할 것이다.

프로토콜

1. 조직 수확 및 근육 조직의 동결

1. 이소 플루 란 (2- 클로로 -2- (다이 플루오 로메 톡시) -1,1,1- 트리 플루오로 에탄)의 과다와 마우스를 안락사. 흄 후드에서이 단계를 수행 및 건조기 또는 이소 플루 란에 적신 면봉을 포함하는 벨 항아리로 보조 봉쇄 방법을 사용합니다.
2. 단단히 발바닥을 압박하여 죽음을 확인합니다. 이러한 자궁 전위로 안락사의 보조 방법을 사용합니다.
3. 근육에 느슨한 머리카락의 부착을 감소시키기 위해 70 % 알코올로 모피 젖은. 같은 # 5로 미세 집게를 사용하여 사지 떨어져 피부 껍질.
4. 조심스럽게 아래 뼈 (이 경우에는 전 경골근 (TA)) 관심의 근육을 분리 건에서 시작하여 제거합니다.
5. 근육을 절제 10월 (최적 절단 온도 화합물)에 커버 및 라벨 일회용 동결 금형 위에 올려 놓습니다. 근육이 타이에 정상적인 생리적 방향 (머리에 있는지 확인스트레칭없이 L). 대안 적으로, 작은 스티로폼 사각형에 근육을 동결 및 근육의 정확한 길이를 보장하는 곤충 핀을 사용하여 고정.
6. 액체 질소를 사용하여 강철 비이커 중 2- 메틸 부탄 (이소 펜탄)을 진정. 5 분 -이 평균 3 일이 걸립니다. 흰색 침전물이 비커의 바닥과 벽에 형성하기 시작할 때까지 간헐적으로 교반하십시오.
   주 :이 때, 이소 펜탄 최적 동결 온도에 도달 (-150 ° C)
7. 냉장 2- 메틸 부탄에 근육을 포함하는 금형을 찍어. 20 초 - 15 비복근의 가자미근 (GS)과 삼두근을 추천 삼성 전자와 큰 근육 - 같은 다이어프램과 신근 심지 6 longus (EDL)와 같은 작은 근육을 동결. 너무 오래이 균열로 이어질 수 있기 위해 근육을 동결하지 마십시오.
8. 드라이 아이스에 냉동 조직을 전송하고 이소 펜탄 증발 (이 과정은 약 평균 15 소요 있습니다 - 20 분)을 할 수 있습니다. 알루미늄 호일에 조직을 감싸고 U에 보관ltra 저온 절편까지 (-70 ° C에서 -80 ° C).

2. 조직 블록을 준비하는 OCT에서 조직의 포함

1. 드라이 아이스에 전송 조직 해동을 방지하기 위해 cyrostat합니다. 전송 조직하고 30 분 동안 평형화하자 (조직의 완전 해동을 피하기 위해 -20 -24 ℃로 설정)를 챔버 저온 유지한다.
2. 펠티에 베이에 냉각십시오. 그라 이오 스탯이 냉각이없는 경우, 신속하게 OCT를 동결 에어로졸 냉각 스프레이를 사용합니다. 이 동결 손상을 초래할 수 있으므로 삽입시에 임의의 지점에서 근육 해동시키지 마십시오.
3. 시편 디스크에 10월의 균일 한 박막을 추가하고 식힌다. OCT의 대부분 동안 여전히 액체 상단에 바닥에 고정 될 때, (세로 섹션에 대한 10월에 횡단면과 평행을위한 10월에 수직) 올바른 방향에서 조직을 삽입합니다. 빨리 OCT를 동결 에어로졸 냉각 스프레이를 사용합니다. 열 내선과 조직의 unembeded 부분을 터치ractor 45 초 동안 기다립니다.
4. 근육 주위 OCT의 다른 얇은 층을 추가 에어로졸 냉각 스프레이 스프레이 및 이전 단계에서와 같이 열을 추출한다.
5. 근육 전체가 커버 될 때까지 분무하고 열 추출기 냉각 에어로졸의 조합을 사용하여 빠르게 동결 OCT를 조금씩 OCT를 계속 추가하고.
6. 조직 블록의 상단에 열 추출기를 넣고 5 분 동안 기다린다.

3. 섹션을 준비하고 근육의 미드 벨리 지역에서 섹션을 확인

1. 시편 머리에 시료를 탑재합니다. 디스크를 보호하기 위해 노브를 조입니다. 시편 디스크 시편 머리와 잘 접촉되어 있는지 확인합니다.
2. ° -21 내지 -24 C의 챔버 온도를 조정하고 설정 온도가 될 때까지 기다립니다.
3. 두께 설정 (7 μm의)를 조정; 전진 또는 일반 및 미세 설정을 사용하여 블록을 후퇴하여 블록을 잘라.
4. 섹션을 수집슬라이드 상에 컷 부의 부착을 용이하게하기 위해 반대 전하 간의 인력을 사용하여, 상기 슬라이드 부에의 상단을 가압하여 양전하 현미경 슬라이드를 미리 예열.
5. 섹션의 단면적 (CSA)를 측정하여 중간 배꼽 부분을 확인합니다. 현미경에 연결되어있는 컴퓨터를 사용하여이 촬상 소프트웨어를 수행.
   주 : 위상차 이미지를 촬영하고, 전체 둘레의 근육은 소프트웨어 프로그램에 대한 추적 기능을 통해 측정된다. 이것은 CSA 모두뿐만 아니라 최소 족제비 직경 측정 (입자의 양측에 두 개의 평행 한 접선 사이의 최소 거리로 표현 섬유 단면 크기의 측정)을 수득한다. 참고 : CSA 및 최소 흰 족제비 지름 측정은 고원에 시작하면, 중간 배에 도달했습니다.
6. 재고는 미래 염색 -80 ° C에서 슬라이드를 보관합니다.
   참고 : stainin하는 OCT를 전에 제거 할 필요가 없습니다G 절차. 슬라이드가 coverslipped되면, 그들은 즉시 염색 할 준비가 된 것입니다.

4. 염색

주 : 상세한 단계별 절차가 제품 데이터 시트에서 확인할 수 있고, 염색 절차 따라야하는 동안 개인의 최적화가 최적의 착색을 얻기 위해 필요할 수있다.

1. 미디어 (표 참조)를 장착하는 물과 혼화하지 않기 때문에, (70 %, 95 %, 100 % 에탄올로 2 분마다) 알코올의 증가 성적 통해 슬라이드를 탈수 및 크실렌 (5 분 동안 100 %)을 보장하기 위해 함께 그것들을 취소 슬라이드는 시간이 지남에 따라 불투명가되지 않습니다.
2. 섹션 커버 슬립하고 건조 할 수 있습니다. 현미경으로 이미지 이미징 소프트웨어를 장착.

결과

수확 및 조직의 동결을위한 셋업은 그림 1에서 볼 수 있습니다. 절제된 조직은 건조 (그림 1A)를 방지하기 위해 PBS에 적신 거즈에 저장해야합니다. 조직들은 정확한 형태 (도 1b)을 보장하기 위해 OCT에서 침지 크라이 금형에 뻗어 올바른 방향으로 가능한 생리적 길이에 가까워 야 학적 해석에 사용하기 위해 선택되는 경우. 동결 조직 적합 펜탄 슬러리는 액체 ?...

토론

조직학 및 면역 조직 화학 다양한 신경 근육 질환의 증상과 병변의 진행을 이해하기위한 주요 도구로 사용되어왔다. 클래식, 근육 생검 먼저 포름 알데히드에 고정 후 파라핀 왁스 내장했다. 포름 알데히드는 고정 조직 구조를 보존하고 RT에서 티슈 저장 및 전송을 허용하지만, 또한 정확한 면역을 달성하기 위해 추가의 단계를 필요로 가교 효소와 단백질을 비활성화한다. 이 문제는 고정 된 섹션?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cryostat	Leica CM 1850	Leica Microsystems Inc.	Buffalo Grove, IL 60089 U.S.A., office phone 1-800-248-0123 Alternative: Richard Allen Scientific
Microscope	Nikon Eclipse 50i	Nikon Instruments Inc.	1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064 U.S.A., Phone: 1-631-547-8500 Alternative: Olympus
Image analysis software	Nikon Imaging Software Basic Research	Nikon Instruments Inc.	1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064, U.S.A., Phone: 1-631-547-8500 Alternatives: Image J, Metamorph
Isoflurane	14043-220-05	JD Medical Dist. Co., Inc.	1923 West Peoria Avenue, Phoenix, AZ 85029 U.S.A.
OCT	4583	Sakura Inc.	Torrence, CA 90501 U.S.A. Alternative source: Leica Microsystem
Freeze It	23-022524	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA, 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific
Disposable tissue mold	22-363-554	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific
Colorfrost plus slides	9991001	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific
Acetone	650501-4L	Sigma-Aldrich	3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific
Ethyl alcohol	HC-1300-1GL	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific
2-methyl butane	M 32631-SL	Sigma-Aldrich	3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific
Xylene	HC-7001GA	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific
Cytoseal 280	8311-4	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific
Hematoxylin Gill #3	CS402-1D	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific
Eosin	6766007	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific