המצאה של ננוצלולוז בקטריאלי המגנטי פונקציונלי עם חלקיקים של תחמוצת ברזל

Summary

Here, we present a protocol to make a bacterial nanocellulose (BNC) magnetic for applications in damaged blood vessel reconstruction. The BNC was synthesized by G. xylinus strain. On the other hand, magnetization of the BNC was realized through in situ precipitation of Fe²⁺ and Fe³⁺ ferrous ions inside the BNC mesh.

Abstract

במחקר זה, ננוצלולוז בקטריאלי (BNC) המיוצר על ידי חיידקים xylinus Gluconacetobacter הוא מסונתז ועיבר באתרו עם חלקיקי תחמוצת ברזל (IONP) (Fe ₃ O ₄₎ להניב ננוצלולוז חיידקי מגנטי (MBNC). הסינתזה של MBNC היא תהליך מדויק שתוכנן במיוחד רבי שלבים. בקצרה, ננוצלולוז בקטריאלי (BNC) pellicles נוצרות נשמר G. xylinus זן בהתאם לדרישות של גודל ומורפולוגיה הניסוי שלנו. פתרון של ברזל (III) כלוריד hexahydrate (FeCl ₃ · 6H ₂ O) וברזל tetrahydrate כלוריד (II) (FeCl ₂ · 4H ₂ O) עם 2: יחס טוחנת 1 ערוכה מדולל במים טוהר גבוהה deoxygenated. קרומי BNC הוא הציג אז את הספינה עם המגיבים. תערובת זו היא זע מחוממת על 80 מעלות צלזיוס באמבט שמן סיליקון אמוניום הידרוקסיד (14%) הוא הוסיף אז על ידי הטלה כדי לזרז אתברזלי יונים לתוך רשת BNC. השלב אחרון זה מאפשר להרכיב חלקיקי מגנטיט באתרו (Fe ₃ O ₄₎ בתוך רשת ננוצלולוז חיידקים להעניק תכונות מגנטיות כדי קרומי BNC. Assay טוקסיקולוגית שמש כדי להעריך את ההתאמה הביולוגית של קרומי BNC-IONP. פוליאתילן גליקול (PEG) שימש לכיסוי IONPs על מנת לשפר biocompatibility שלהם. תמונות במיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) הראה כי IONP אותרו מועדף של סיבית Interlaced ל- Progressive רווחים של מטריקס BNC, אבל חלק מהם נמצאו גם לאורך סרטים BNC. מדידות מיקרוסקופ כוח מגנטיות שבוצעו על MBNC זיהו את התחומים מגנטיים הנוכחות עם שדה מגנטי בעצמה גבוהה וחלש, המאשר את הטבע המגנטי של קרומי MBNC. ערכי מודול יאנג שהושגו בעבודה זו הם גם בהסכם סביר עם אלו שדווחו במשך כמה כלי דם במחקרים קודמים.

Introduction

ננוצלולוז bacterian (BNC) מסונתז על ידי זן xylinum Acetobacter, הידוע גם בשם Gluconacetobacter xylinus, והפקידו בצורת סרטים או pellicles על ממשק-נוזלי אוויר במהלך התרבות נייח. Pellicles BNC אלה לאמץ את צורת המיכל שבו הם גדלו, ועובי שלהם תלוי במספר ימים בתרבות. א xylinus משתמשת גלוקוז בטווח הבינוני לסינתזה של מיקרופיברילות התאית באמצעות תהליך של פילמור וגיבוש שלאחר מכן. פילמור של שאריות גלוקוז מתבצע על הקרום התא החיידקים שבו שרשרות גלוקן נמתחות מנקבוביות יחידה מפוזר על פני מעטפת התא. ההתגבשות של תאית מיקרופיברילות מתרחשת במרחב התאי עם הקמתה של גיליונות שרשרת גלוקן ידי מליטה ואן דר ואלס ואחריו לערום של הסדינים על ידי H-מליטת ^1.

מַגנֵטחלקיקים ic משולב למטריצה ​​BNC ניתן להשפיע בקלות על ידי שדה מגנטי חיצוני על מנת להגדיל את הכוח הדרוש כדי לכוון ולרכז תאי שריר חלק (SMCs) המכיל חלקיקים מגנטיים, באתר פגום של דופן העורק. אסטרטגיה זו שומרת על SMCs משם מרקמות אחרות, ומחזיק את התאים במקום נגד הכוח המופעל על ידי זרימת הדם. הוכח כי SMCs ממלאים תפקיד חשוב vasoelasticity של כלי הדם, שם הם יוצרים שכבות בשפע הממוקמים ברובם באזורי Tunica התקשורת ^2.

השיטה לסינתזה של MBNC כרוך קרומית BNC שקוע ובחש בתמיסה של ברזל (III) כלוריד hexahydrate וברזל (II) כלוריד tetrahydrate על 80 מעלות צלזיוס. אמוניום הידרוקסיד מתווסף ליצור חלקיקי תחמוצת ברזל בתוך רשת BNC. התוספת של אמוניום הידרוקסיד משנה את הצבע של הפתרון מכתום לשחור. קומפקטית IONPs יחד לאורך ליפון BNCים עם חלוקה לא אחידה.

פרוטוקול זה מתמקד בעיצוב של קרומי nanoparticle ננוצלולוז-מגנטי בקטריאלי, אשר יש לנו בשם ננוצלולוז חיידקי מגנטי (MBNC), אשר נועד לשימוש כתחליף כלי דם קטן בקוטר חסר, פגום או פצוע. HS בארוד ועמיתים לעבודה פרסמו לאחרונה עבודה דומה כדי לייצר נייר מגנטי גמיש מבוסס BNC ידי ערבוב pellicles BNC בתוך פיזור מימי יציב של PEG ו ^-3 חלקיקי תחמוצת ברזל פאראמגנטי. כאן, אנו מתארים את הייצור של תאית חיידקי הספגה שלה באתרו עם חלקיקים מגנטיים. Assay cytotoxicity מבוסס על זיהוי של הפסקות גדיל בודד DNA שימש כדי לבדוק את biocompatibility של pellicles BNC ו MBNC.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. הכנת בקטריאלי ננוצלולוז (BNC)

הערה: כל השלבים מבוצעים בתנאים aseptic, אלא אם צוין אחרת.

1. כן בינוני התרבות.
   1. הכן 500 מ"ל של מדיום תרבות נוזלי על ידי שילוב של 25 גרם תמצית שמרים, 15 גרם של peptone, 125.0 גרם של מניטול, ו -500 מ"ל מים טוהר גבוהה. חיטוי את התערובת על 120 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות ולאחסן ב 4 ° C..
   2. כן 100 מיליליטר של תקשורת המוצקה למחצה על ידי הוספת 15 גרם של אגר 5.0 גרם של תמצית שמרים, 3.0 גרם של peptone, 25.0 גרם של מניטול, ו -100 מיליליטר מים טוהרים גבוהים. חיטוי את התערובת ב 120 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. לאחר autoclaved, הפקדה 5 מ"ל של תערובת בצלחת פטרי פלסטיק 90 מ"מ x 16 מ"מ. אפשר הפתרון הג'ל על 4 מעלות צלזיוס ולאחסן בטמפרטורה זה עד לשימוש נוסף.
2. רעננותם G. xylinus זן נשמר בקבוקונים מיובשים בהקפאה ידי הוספת 1 ​​מיליליטר של מדיום תרבות הנוזל pipetting למעלהלמטה, כפי שצוין על ידי בהוראות היצרן.
3. לחסן צלחות פטרי המכילות מדיה מוצקה למחצה עם טיפות קטנות של השעית חיידקים באמצעות לולאת inoculating. ודא כי הבידוד מכסה את צלחת פטרי כולו על ידי הזזת הלולאה בכיוון זיג זג מהקצה אל מרכז הצלחת.
4. דגירת צלחות פטרי ב 26 מעלות צלזיוס למשך 72 שעות באינקובטור ללא CO _2. לאחר תקופת הדגירה תושלם, מושבות לבנות קטנות גלויות. אם המושבות אינם משמשים מיד, לאחסן את צלחות פטרי ב 4 ° C על ידי איטום המכסה עם Parafilm והצבת המנות במהופך. המושבות ניתן לאחסן ככה עד 6 חודשים.
5. העברה 2 מיליליטר של מדיום התרבות הנוזלי מוכנים בשלב (1.1.1) לבאר כל צלחת בתרבית רקמה 24 גם. קח שתי מושבות עם מחט ייחסה מן צלחות פטרי המחוסנות בשלב (1.3) ולהכניס אותם לתוך הבאר הראשונה של הצלחת בתרבית הרקמה. REPEAT אותו נוהל עבור 23 הבארות הנותרות.
6. דגירת הצלחת בתרבית רקמה על 30 מעלות צלזיוס למשך 7 ימים. זו תניב סך של 24 BNC pellicles עם קוטר של 16 מ"מ בעובי של כ 2-3 מ"מ קוטר כמתואר באיור 1.
   הערה: נא לא להפריע את תרבית חיידקים בכל שלב במהלך תקופת דגירה, למשל על ידי טלטול הצלחות. במהלך תקופת הדגירה, G. xylinus extrudes מולקולות סוכר glucopyranose להקים רשת גבישי פולימריים בממשק נוזל-האוויר, אשר מאמץ את הצורה וגודל של הבקבוק בתנאי טיפוח סטטי. מטריקס פולימריים זה, המכונה ננוצלולוז בקטריאלי (BNC), בולט בסוף תקופת הדגירה.
7. אסוף את pellicles BNC מהתקשורת צמיחה לעקר אותם 200 מ"ל של תמיסת 1% NaOH עבור שעה 1 ב 50 מעלות צלזיוס, כדי להסיר כל עקבות של ג ' xylinus. לחלופין, מערבבים את הפתרון הזה ב 300 סל"ד באמצעות פס מגנטיוצלחת בחישה. מחק את פתרון NaOH ולהוסיף 200 מיליליטר של תמיסה מוכנה טרי 1% NaOH. חזור על אותו התהליך שוב או עד pellicles BNC בתמיסה רוכש מראה שקוף.
8. שוטפים את pellicles BNC עם מים שלוש פעמים ולאחסן אותם במים טוהר גבוה ב RT. ודא pellicles BNC שקוע לגמרי במים ואינם להתייבש בכל עת.
9. חיטוי pellicles BNC ב 121 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.
   הערה: מחקר תת עורית in vivo בחולדה בביצוע Märtson ועמיתים לעבודה הראה סימנים שאינם שפל של BNC לאחר השתלת 60 שבועות. ואכן, BNC הוא מתכלה בטבע על ידי אנזימים מיקרוביאליים פטרייתי, אשר נעדרים אצל יונקים. מצד שני, פריקות ביולוגית של BNC יכול להיות תוצאה של מכני, כימי, תהליכים ביולוגיים להחליש את רשת מיקרופיברילות in vivo ^4.

2. סינתזה של פולימרים מצופיםתחמוצת ברזל חלקיקי ההפקדה שלה בתוך ממברנה בקטריאלי ננוצלולוז

1. בועה 1,000 מיליליטר מים טוהרים גבוהים עם גז חנקן על מנת להסיר כל חמצן מומס במים ולהחליף אותו עם חנקן.
2. השתמש בבקבוק עגול התחתונה שלושה הצוואר להכין פתרון של 2: יחס טוחנת 1 של ברזל (III) כלוריד hexahydrate (FeCl ₃ · 6H ₂ O) וברזל (II) כלוריד tetrahydrate (FeCl ₂ · 4H ₂ O) מדולל עם מים טוהר גבוהה deoxygenated. לדוגמה, השתמש 5.4 גרם של FeCl ₃ · 6H ₂ O ו 1.98 גרם של FeCl ₂ · 4H ₂ O ב 10 מ"ל מים טוהר גבוהה deoxygenated. אם בתכשיר מסתובב במהירות נמוכה מדי צמיגה וקשה לבחוש, השתמש 0.54 גרם של FeCl ₃ · 6H ₂ O ו 0.198 גרם של FeCl ₂ · 4H ₂ O ב 20 מ"ל מים טוהר גבוהה deoxygenated.
   הערה: להפחית את זמן החשיפה של 4H FeCl ₂ · ₂ O לאוויר בשקילה ch זהמתחם emical מהר ככל האפשר. לאחר הצגתי את הבקבוק התחתי עגול שלושת צוואר, לסגור את הבקבוק תלת צוואר עגול תחתון עם פקקים מחצו עד שהיא מחוברת לאספקת גז חנקן צינור הקבל.
3. השתמש בשני צווארם ​​של הכלי לספק כניסה ופלט מתמדת של גז חנקן על ידי חיבור אספקת גז החנקן כדי מחט אגרוף פקק המחץ והקבוע אל הצוואר של כלי השיט.
4. מקום 1 קרומי BNC שהוכן קודם לכן בשלב 1.5 (15.6 מ"מ של בקוטר 2-3 מ"מ עובי) בתוך הכלי עם המגיבים. ודא המדגם הוא שקוע לחלוטין בתוך הנוזל.
5. חברו את הצוואר הנותר של כלי לצינור הקבל. בנוסף, להשתמש בצינור ייבוש מלא סידן גופרתי נטול מים על החלק העליון של צינור הקבל. למים לזרום דרך צינור הקבל.
6. חותם את כל מפרקי הזכוכית עם גריז ואקום.
7. מחממים את הפתרון באמבט שמן סיליקון עד 80 מעלות צלזיוס באמצעות ערבובפלטה חשמלית וחזק טמפרטורה זו עד שלב 2.10. השתמש בר ומערבבים מגנטי קטן לערבב המגיבים ב 350 סל"ד במשך 5 דקות. ודא BNC היא ספוגה כראוי עם פתרון ברזלי שהמגיבים נמס לגמרי. לבחוש את התערובת עד סוף הניסוי.
   הערה: לנצל מדחום כדי לאמת את טמפרטורת שמן סיליקון. זה צריך להיות יציב עד 80 מעלות צלזיוס.
8. להגדיל את מהירות בחישה עד 700 סל"ד ולהוסיף (על ידי הטלת), במרווח זמן של 5 דקות, 5 מ"ל של אמוניום הידרוקסיד (NH ₄ OH, 14%) על 10 מ"ל של תמיסת ברזל באמצעות מחט pipetting, אשר כבר גם אגרוף פקק מחץ. לאחר תוספת של אמוניום הידרוקסיד, הצבע של הפתרון משתנה מצהוב / כתום לשחור.
9. המשך ערבוב הפתרון על 80 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות אחרות. הימנע התעוררות במהירות גבוהה כדי לשמור על שלמות המדגם. במהירויות גבוהות, כלומר, גבוה יותר מ -1,000 סל"ד, יכול להרוסהדוגמה.
10. מנמיכים את הטמפרטורה של הפתרון 30 ° C באמצעות בתחתית בקרת טמפרטורה של פלטה חשמלית ערבוב ולשמור ערבוב במשך 5 דקות אחר. לאחר מכן, כבה את הכיריים. בשלב זה, IONP שולב רשת BNC.
11. מצננים את התערובת עד RT ולהפריד חלקיקים מגנטיים (MNP) ו BNC באמצעות מגנט קבוע חזק (למשל, 1 טסלה). לשם כך, ולהעביר את התערובת בבקבוק כלי ולאחר מכן, תוך שמירה על מגנט קרוב כלי, להחזיק את MNPs ואת BNC במקום בעת decanting supernatant.
    הערה: היזהר במהלך הטיפול בו מגנטים חזקים שכן הם יכולים להזיק בשימוש לא נכון. לקבלת שלבים (2.12) - (2.14) ו (2.16) להשתמש במים טוהר גבוהה deoxygenated הכין בעבר ב (2.1) כדי למנוע חלקיקים מפני התחמצנות.
12. Resuspend את MNPs ו BNC ב מ"ל מים 100. נער בעדינות את הפתרון כדי להסיר את כל MNPs שאינם משולבים חזק לתוך BNC. למזוג היםupernatant שוב על ידי לחיצה על MNPs ואת BNC במקום באמצעות מגנט.
13. שטפו את MNPs ואת פעמים BNC כמה עם מים עד supernatant מגיע pH נייטרלי (pH ~ 7), כפי שהיא נמדדת על ידי רצועת colorimetric.
14. הפרד את ננוצלולוז חיידקי המגנטי פונקציונלי BNC או מגנטי (MBNC) מן MNPs באמצעות פינצטה ולשטוף את MBNC מספר פעמים עם מים עד שהמים פועלים ברורים.
15. לעקר את MBNC ידי חשיפת MBNC O / N כדי UV (110-280 ננומטר).
16. 500 מ"ל החיטוי של מים טוהר גבוהה deoxygenated ב 120 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות ולאחסן את MBNC ב 20 מ"ל של מים זה.
17. בסביבה נקייה מחיידקים, לטבול את המדגם ב 1% של PEG ומערבבים עבור שעה 2 ב RT (37 מעלות צלזיוס). הליך זה משפר את biocompatibility ויציבות של חלקיקי תחמוצת ברזל שהופקדו BNC, אלו שנחשפו במיוחד על פני השטח ^5-7. ציפוי PEG יופץ דרך רשת 3D MBNC.
    הערה: עירום IONP הם מתחמצנים בקלות באווירבגלל הפעילות הכימית הגבוהה שלהם ^8. למרות PEG נחשב חומר שאינו מתכלה, היציבות הכימית שלה תלוי תנאים ביולוגיים מיושמים כגון תכולת מים, pH, טמפרטורה, נוכחות של אנזימים, מיני חמצן תגובתי, מיני חנקן תגובתי, ואחרים ^9.

אפיון 3. Pellicles BNC ו MBNC

1. תכונות מכאניות
   1. בצע העמסה רגילה ולבדוק פריקה nanoindentation באמצעות indenter ברקוביץ. רדיוס indenter היהלומים ברקוביץ הוא 20 ננומטר.
   2. השתמש סיליקה טונגסטן התמזגה לכייל שטח מגע כפונקציה של עומק הזחה ב RT. במהלך הבדיקה, הר הדגימות על הכניסה באמצעות דבק. Indenter ניגש הדגימות בכיוון העובי שלו.
   3. אקראי במקומות כניסה בחרו על משטחי דגימות. שמור את המרווח בין 2 כניסות בין 200-300 מ"מ.
   4. החל את העומס אלדגימות בצעדים ולהקליט את העקירה המקבילה indenter. לנתח את העלילה של עומס לעומת עומק כדי למצוא את מודול יאנג.
   5. לבצע את הבדיקה nanoindentation של דגימות בנוכחות מים ללא יונים (מים DI), ולבדוק ידי החלת שיעורי העומס בין 0.0001 MN / sec ו 0.005 MN / sec, עם עומס שיא בין 0.01 Mn ו 0.60 Mn.
   6. השתמש נוזל תא ולשמור דגימות תחת הסביבה הנוזלת. התקנה ייחודית זו לאפיון nanomechanical השקוע בסביבת נוזל אידיאלית כדי לדמות את הפונקציונליות ידם ביומכנית ביעילות של ממברנות BNC ו MBNC.
2. אפיון מבני ידי SEM
   1. לאפיין את מבנה סיבי ננוצלולוז ידי סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM).
   2. Lyophilize הדגימות למשך 24 שעות ב -80 מעלות צלזיוס. ואז לעלות על חתיכי SEM, גמגום עם סרט Au-PD במשך 10 שניות ולנתח באמצעות SEM.
   3. לוקח תמונות בהגדלה של 22,000Xו 60,000X, עם מתח אץ של 5 קילו וולט.
3. תחומים מגנטיים
   1. אפשר pellicles MBNC להתייבש לחלוטין ב RT, ולאחר מכן לחשוף למשך 5 דקות כדי מגנט קבוע (1 טסלה).
   2. מייד, לבצע את מדידות כוח המגנטיות באמצעות ביו-AFM על פי הפרוטוקול של היצרן.
   3. לכל מדידה, ללכוד הראשון תכונות הטופוגרפיה לרכוש את התחומים המגנטיים במהלך קריאה שנייה. השג שתי המדידות עם ביו-AFM במצב ללא מגע.
   4. אפיון מגנטי של החלקיקים מתנהל באמצעות מגנטומטר מדגם רוטט (VSM) במערכת מדידות קניין הפיזי (PPMS) של Quantum Design, ב RT (300 K), עם שדה מגנטי בטווח של -10,000 ל -10,000 OE.
4. Cytocompatibility
   1. זרע אנושי אבי העורקים לתאי שריר חלק (HASMC) בצלחת בתרבית רקמה 6 גם בצפיפות של 1.0x10 ^{3 תאים / ס"מ 2 ו דגירה במשך 24 שעות בנוכחות דגימות הבדיקה: pellicles BNC ו MBNC (כל אחד עם 15.6 מ"מ קוטר).}
   2. השתמש אוכלוסיות של תאים שטופלו מי שלא טופלו ומימן כפקדים שליליים וחיוביים, בהתאמה.
   3. בצע את assay השביט על פי הפרוטוקולים של היצרן ואת ההנחיות שהוצעו על ידי א Azqueta & AR קולינס ^10.
   4. השתמש זהב SYBR צבען חומצות גרעין ב assay זה כדי intercalate ו fluorescently תווית ה- DNA הכלול דגימות electrophoresed על פי פרוטוקול של היצרן.
      הערה: תאים שאינם עוברים כל ניזק לדנ"א בנוכחות דגימות BNC ו MBNC, יציג נוקלאואיד ירוק עגול ניאון, ואילו תאים פגומים DNA יהיו שביטים ארוכים - דגימות חיוביות תהיינה nucleoids (ראש השביט) ואחריו זנבות אשר מכילים חומר ה- DNA מקוטעת (אחוז DNA בזנב).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

תקופת הדגירה של G. xylinus היה סך של 9 ימים, אבל pellicles החלה להיווצר מוקדם ניכרו לאחר כ 2 ימים. המראה מקרוסקופית של BNC מוצג באיור 1, בצורה אשר מחק כי התרבות צלחת מבוגר. איור 2 מתארת ​​את התהליך להפקת pellicles BNC-IONP, אשר סיכומי השלבי?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

העובי והגודל של קרומי BNC ניתן להשפיע בקלות על ידי שינוי זמן דגירה ואת הגודל של הבקבוק שבו הוא גדל במהלך טיפוח סטטי. Microproperties של BNC, כגון נקבוביות, ניתן לשנות על ידי שינוי יחס חמצן בתרבות סטטי. ריכוזי חמצן גבוהים יותר מניבות קשים BNC ^11. א בודן ​​ועמיתים לעבודה מיוצרי...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glucoacetobacter xylinus	ATCC	700178
Agar	Sigma Aldrich	A1296-500G
D-Mannitol Bioxtra	Sigma Aldrich	M9546-250G
Yeast Extract	BD Biosciences	212750
Bacteriological Peptone	Sigma Aldrich	P0556
Sodium Hydroxide, 50% Solution In Water	Sigma Aldrich	158127-100G
Iron(III) Chloride Hexahydrate	Sigma Aldrich	236489-100G
Ammonium Hydroxide	Macron Fine Chemicals	6665-46
Poly(Ethylene Glycol), Average Mn 400	Sigma Aldrich	202398-250G
Iron (II) chloride tetrahydrate	Sigma Aldrich	44939-250G
Disposable Petri dish	Sigma Aldrich	BR452000
Disposable Inoculating Loop	Fisher Scientific	22-363-604
Anhydrous Calcium Sulfate	W.A. Hammond Drierite	13001
High vacuum grease	Sigma Aldrich	Z273554-1EA
Laboratory pipetting needle with 90° blunt ends	Sigma Aldrich	CAD7937-12EA
pH test strips	Sigma Aldrich	P4786-100EA
Round-bottom three neck angle type distilling flask	Sigma-Aldrich	CLS4965250
Silicone oil for oil baths	Sigma-Aldrich	85409-250ML
Drying Tube	Chemglass	CG-1295-01
Septum Stopper, Sleeve Type	Chemglass	CG-3022-98
Magnetic stir bar	Chemglass	CG-2001-05
Condenser	Chemglass	CG-1218-01
Temperature Controller	BriskHeat	SDC120JC-A
Stirring Hotplate	Fisher Scientific	11-100-49SH
Comet Assay Kit	Trevigen	4250-050-K
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain	Life Technologies	S-11494
bio-AFM	JPK Instruments	NanoWizard 4a BioScience AFM
Nanoindenter	Micro Materials Ltd	Multi-module mechanical tester
Scanning electron microscopy (SEM)	Hitachi High Technologies America	Hitachi S-4800