Realizzazione di un funzionalizzato magnetico batterica Nanocellulose con nanoparticelle di Ossido di Ferro

Riepilogo

Here, we present a protocol to make a bacterial nanocellulose (BNC) magnetic for applications in damaged blood vessel reconstruction. The BNC was synthesized by G. xylinus strain. On the other hand, magnetization of the BNC was realized through in situ precipitation of Fe²⁺ and Fe³⁺ ferrous ions inside the BNC mesh.

Abstract

In questo studio, nanocellulose batterica (BNC) prodotto dal batterio Gluconacetobacter xylinus è sintetizzata e impregnato in situ con nanoparticelle di ossido di ferro (IONP) (Fe ₃ O ₄₎ per ottenere un nanocellulose batterica magnetica (MBNC). La sintesi di MBNC è un processo preciso e specificamente progettato multi-step. In breve, nanocellulose batterica (BNC) pellicole sono formate da conservato G. xylinus ceppo in base alle nostre esigenze sperimentali di dimensioni e morfologia. Una soluzione di ferro (III) esaidrato (FeCl ₃ · 6H ₂ O) e ferro (II) cloruro tetraidrato (FeCl ₂ · 4H ₂ O) con un 2: rapporto molare 1 viene preparata e diluita in acqua ad elevata purezza deossigenato. Una pellicola BNC viene quindi introdotto nel recipiente con i reagenti. Questa miscela viene agitata e riscaldata a 80 ° C in un bagno di olio di silicone e idrossido di ammonio (14%) viene quindi aggiunta da cadere per precipitare ilferrosi ioni nella maglia BNC. Questo ultimo passaggio consente di formare in situ di nanoparticelle di magnetite (Fe ₃ O ₄₎ all'interno della rete nanocellulose batterica per conferire proprietà magnetiche a BNC pellicola. Un test tossicologico è stato utilizzato per valutare la biocompatibilità del pellicle BNC-IONP. Polietilenglicole (PEG) è stato utilizzato per coprire i IONPs al fine di migliorare la loro biocompatibilità. microscopia elettronica a scansione (SEM) immagini ha mostrato che la IONP si trovavano preferenzialmente nella fibrilla interlacciamento spazi della matrice BNC, ma alcuni di loro sono stati trovati anche lungo i nastri BNC. misurazioni microscopio a forza magnetiche eseguite sul MBNC rilevati i domini magnetici di presenza con il campo magnetico ad alta e debole intensità, a conferma della natura magnetica della pellicola MBNC. I valori modulo di Young ottenuti in questo lavoro sono anche in un accordo ragionevole con quelli riportati da diversi vasi sanguigni in studi precedenti.

Introduzione

Il nanocellulose batteriologica (BNC) viene sintetizzato Acetobacter xylinum ceppo, noto anche come Gluconacetobacter xylinus, e depositato sotto forma di film o pellicole sulla interfaccia aria-liquido in coltura stazionaria. Queste pellicole BNC adottano la forma del contenitore in cui vengono coltivati, ed il loro spessore dipende dal numero di giorni in coltura. A. xylinus utilizza il glucosio nel mezzo per la sintesi delle microfibrille di cellulosa attraverso un processo di polimerizzazione e successiva cristallizzazione. La polimerizzazione dei residui di glucosio viene effettuata a membrana extracellulare batterica in cui le catene glucano sono estrusi da singoli pori distribuiti su cellule envelope. La cristallizzazione delle microfibrille di cellulosa verifica nello spazio extracellulare con la formazione di strati di catena glucano da van der Waals legame seguita impilando dei fogli da H-bonding ^1.

Magnetenanoparticelle ic integrati ad una matrice BNC possono essere manipolati facilmente da un campo magnetico esterno al fine di aumentare la forza necessaria per dirigere e confinare cellule muscolari lisce (SMC) contenente nanoparticelle magnetiche, al sito danneggiato della parete arteriosa. Questa strategia mantiene il CML lontano da altri tessuti, e tiene le celle al posto contro la forza esercitata dal flusso sanguigno. E 'stato dimostrato che SMCs svolgono un ruolo importante nella vasoelasticity del vaso sanguigno, dove formano strati abbondanti situate prevalentemente nella tunica media ^2.

Il metodo utilizzato per la sintesi di MBNC comporta BNC pellicle immerso e agitata in una soluzione di ferro (III) cloruro esaidrato e ferro (II) cloruro tetraidrato a 80 ° C. idrossido di ammonio viene aggiunta per formare nanoparticelle di ossido di ferro all'interno della maglia BNC. L'aggiunta di idrossido di ammonio cambia il colore della soluzione da arancione al nero. La compatta IONPs insieme lungo la fibrilla BNCs con una distribuzione non uniforme.

Questo protocollo concentra sulla progettazione di un batterica pellicle nanoparticelle nanocellulose-magnetico, che abbiamo chiamato magnetica nanocellulose batterica (MBNC), che intende utilizzare in sostituzione di mancanti, vasi sanguigni di piccolo diametro danneggiati o feriti. HS Barud e collaboratori hanno recentemente pubblicato un lavoro simile per la produzione di una carta magnetica flessibile BNC a base mescolando pellicole BNC in una dispersione acquosa stabile di PEG e nanoparticelle di ossido di ferro superparamagnetiche ^3. Qui, descriviamo la produzione di cellulosa batterica e la sua impregnazione in situ con nanoparticelle magnetiche. Un test di citotossicità in base alla rilevazione del singolo rotture del DNA è stato utilizzato per testare la biocompatibilità delle pellicole BNC e MBNC.

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Protocollo

1. Preparazione del batterica Nanocellulose (BNC)

Nota: Tutte le operazioni vengono eseguite in condizioni asettiche, se non diversamente indicato.

1. Preparare terreno di coltura.
   1. Preparare 500 ml di terreno di coltura liquido combinando 25 g di estratto di lievito, 15 g di peptone, 125,0 g di mannitolo e 500 ml di acqua ad elevata purezza. Autoclave questa miscela a 120 ° C per 20 min e conservare a 4 ° C.
   2. Preparare 100 ml di supporti semisolidi aggiungendo 15 g di agar a 5,0 g di estratto di lievito, 3,0 g di peptone, 25,0 g di mannitolo e 100 ml di acqua ad elevata purezza. Autoclave questa miscela a 120 ° C per 20 min. Una volta autoclavato, deposito 5 ml della miscela in un x 16 mm plastica Petri 90 mm. Lasciare la soluzione di gel a 4 ° C e conservare a questa temperatura fino a nuovo uso.
2. Reidratare G. xylinus ceppo conservato in fiale liofilizzate con l'aggiunta di 1 ml di terreno di coltura liquido e pipettando su ebasso, come indicato dalle istruzioni del produttore.
3. Inoculare le piastre di Petri contenenti supporti semisolidi con piccole gocce di sospensione batterica utilizzando un ciclo inoculo. Assicurarsi che l'inoculo copre l'intera piastra Petri spostando l'anello in una direzione zag zig dalla periferia al centro del piatto.
4. Incubare le piastre di Petri a 26 ° C per 72 ore in un incubatore senza CO _2. Dopo il periodo di incubazione, piccole colonie bianche sono visibili. Se non vengono utilizzati immediatamente le colonie, memorizzare le piastre Petri a 4 ° C sigillando il coperchio con parafilm e disporre le stoviglie capovolta. Le colonie possono essere memorizzati in questo modo fino a 6 mesi.
5. Trasferimento 2 ml di mezzo di coltura liquido preparato al punto (1.1.1) in ciascun pozzetto di una piastra da 24 pozzetti di coltura tissutale. Prendere due colonie con un ago da inoculo delle piastre seminate Petri nella fase (1.3) e metterli nel primo pozzo della piastra di coltura tissutale. REPEAT la stessa procedura per le restanti 23 pozzetti.
6. Incubare la piastra di coltura tissutale a 30 ° C per 7 giorni. Ciò produrrà un totale di 24 BNC pellicole con diametro di 16 mm e uno spessore di circa 2-3 mm di diametro come illustrato in Figura 1.
   Nota: non disturbare la coltura batterica in qualsiasi momento durante il periodo di incubazione, per esempio agitando le piastre. Durante il periodo di incubazione, G. xylinus estrude molecole di zucchero glucopiranosio per formare una maglia cristallina polimerico nell'interfaccia aria-liquido, che adotta la forma e le dimensioni del pallone in condizioni di coltivazione statiche. Questa matrice polimerica, detto nanocellulose batterica (BNC), è evidente alla fine del periodo di incubazione.
7. Raccogliere le pellicole BNC dal supporto di crescita e sterilizzare in 200 ml di 1% di soluzione di NaOH per 1 ora a 50 ° C, al fine di eliminare ogni traccia di G. xylinus. Opzionalmente, mescolare questa soluzione a 300 rpm con una barra magneticae una piastra di agitazione. Scartare la soluzione di NaOH e aggiungere 200 ml di soluzione preparata 1% NaOH. Ripetere lo stesso processo ancora una volta o fino a quando le pellicole BNC in soluzione acquisisce un aspetto traslucido.
8. Lavare le pellicole BNC con acqua tre volte e conservarli in acqua ad elevata purezza a temperatura ambiente. Assicurarsi che le pellicole BNC sono completamente immersi in acqua e non sono autorizzati a essiccare in qualsiasi momento.
9. Autoclave le pellicole BNC a 121 ° C per 20 min.
   Nota: Uno studio sottocutanea in vivo nel ratto eseguita da Martson e collaboratori hanno mostrato segni non degradazione del BNC dopo 60 settimane impianto. Infatti, BNC è degradabile in natura dagli enzimi microbici e fungine, assenti nei mammiferi. D'altra parte, la biodegradabilità del BNC può essere il risultato di processi biologici che indeboliscono la rete microfibril in vivo ⁴ meccanica, chimica e.

2. Sintesi di Polymer-coatedDi ossido di ferro nanoparticelle e la sua deposizione in un batterica Nanocellulose membrana

1. Bubble 1.000 ml di acqua ad elevata purezza con gas azoto per eliminare l'ossigeno disciolto nell'acqua e sostituirla con azoto.
2. Utilizzare un tre colli pallone a fondo tondo a preparare una soluzione in un rapporto 2: 1 molare di ferro (III) cloruro esaidrato (FeCl ₃ · 6H ₂ O) e ferro (II) cloruro tetraidrato (FeCl ₂ · 4H ₂ O) diluito con l'acqua di elevata purezza deoxygenated. Ad esempio, utilizzare 5,4 g di FeCl ₃ · 6H ₂ O e 1,98 g di FeCl ₂ · 4H ₂ O in 10 ml di acqua ad elevata purezza deossigenato. Se questa preparazione diventa troppo viscoso e difficile da agitare, utilizzare 0,54 g di FeCl ₃ · 6H ₂ O e 0,198 g di FeCl ₂ · 4H ₂ O in 20 ml di acqua ad elevata purezza deossigenato.
   Nota: Ridurre il tempo di esposizione del 4H FeCl ₂ · ₂ O all'aria pesando questo chcomposto emical il più velocemente possibile. Una volta introdotto nel pallone a fondo rotondo a tre colli, chiudere il tre colli pallone a fondo tondo con tappo setto finché non è collegato all'alimentazione di gas azoto e il tubo del refrigerante.
3. Utilizzare due colli della nave per fornire un ingresso e l'uscita di azoto costante collegando l'alimentazione di gas azoto per un agugliato in un tappo setto e fissato al collo del vaso.
4. Posizionare 1 BNC pellicola che è stato preparato in precedenza al passo 1.5 (15,6 mm di diametro e 2-3 mm di spessore) nel recipiente con i reagenti. Assicurarsi che il campione è completamente sommerso nel liquido.
5. Collegare collo restante della nave verso un tubo del refrigerante. Inoltre, utilizzare un tubo di essiccazione riempito con solfato di calcio anidro in cima al tubo del refrigerante. Eseguire l'acqua attraverso il tubo del refrigerante.
6. Sigillare tutti i giunti di vetro con grasso per vuoto.
7. Riscaldare la soluzione in un bagno di olio di silicone a 80 ° C con una agitazionepiastra e mantenere questa temperatura fino al punto 2.10. Utilizzare una piccola ancoretta magnetica per miscelare i reagenti a 350 rpm per 5 min. Assicurarsi che il BNC è opportunamente impregnato con la soluzione ferrosi e dei reagenti sono completamente sciolto. Tenere agitazione la miscela fino alla fine dell'esperimento.
   Nota: Utilizzare un termometro per verificare la temperatura dell'olio di silicone. Essa deve essere stabile a 80 ° C.
8. Aumentare la velocità di agitazione a 700 rpm e aggiungere (facendo cadere), in un intervallo di tempo di 5 minuti, 5 ml di idrossido di ammonio (NH ₄ OH, 14%) al 10 ml di soluzione ferrosa utilizzando un ago pipettaggio, che è stata anche un pugno in un tappo setto. Dopo l'aggiunta di idrossido di ammonio, il colore della soluzione cambia da giallo / arancio al nero.
9. Continuare a mescolare la soluzione a 80 ° C per altri 5 minuti. Evitare fermenti ad alta velocità al fine di mantenere l'integrità del campione. Elevate velocità, cioè, superiore a 1.000 rpm, possono distruggereil campione.
10. Abbassare la temperatura della soluzione a 30 ° C utilizzando il fondo controllo della temperatura della piastra agitazione e mantenere agitazione per altri 5 minuti. Quindi, spegnere la piastra calda. A questo punto, il IONP sono stati inseriti nella rete BNC.
11. Raffreddare il composto fino a RT e separare le nanoparticelle magnetiche (MNP) e BNC con un forte magnete permanente (ad esempio, 1 Tesla). Per fare questo, trasferire la miscela in un pallone nave e quindi, mantenendo il magnete vicino alla nave, tenere il MNPs e il BNC in posizione mentre decantazione del supernatante.
    Nota: Fare attenzione nel maneggiare i magneti forti dal momento che possono essere dannosi se usati in modo errato. Per la procedura (2.12) - (2.14) e (2.16) utilizzano l'acqua deossigenato elevata purezza preparata precedentemente in (2.1) per evitare che particelle dall'ossidazione.
12. Risospendere il MNPs e BNC in 100 ml di acqua. Agitare delicatamente la soluzione per rimuovere tutte le MNPs che non sono fortemente incorporati nella BNC. Decantare il supernatant di nuovo tenendo il MNPs e il BNC in posizione con il magnete.
13. Lavare il MNPs e più volte BNC con acqua fino a quando il surnatante raggiunge pH neutro (pH ~ 7), come misurato utilizzando una striscia colorimetrico.
14. Separare il nanocellulose batterica magnetico-funzionalizzati BNC o magnetico (MBNC) dal MNPs con una pinzetta e sciacquare la MBNC più volte con acqua fino a quando l'acqua è pulita.
15. Sterilizzare il MBNC esponendo il MBNC O / N a UV (110-280 nm).
16. Autoclave 500 ml di acqua ad elevata purezza deoxygenated a 120 ° C per 20 min e memorizzare il MBNC in 20 ml di questa acqua.
17. Asetticamente, immergere il campione in 1% di PEG e mescolare per 2 ore a temperatura ambiente (37 ° C). Questo procedimento migliora la biocompatibilità e la stabilità delle nanoparticelle di ossido di ferro depositato nel BNC, specificamente quelle esposte in superficie ^5-7. Il rivestimento PEG sarà distribuita attraverso la rete MBNC 3D.
    Nota: Naked IONP sono facilmente ossidato in ariaa causa della loro elevata attività chimica ^8. Anche se PEG è considerato un materiale non biodegradabile, la sua stabilità chimica dipende dalle condizioni biologiche applicate come contenuto di acqua, pH, temperatura, presenza di enzimi, specie reattive dell'ossigeno, specie reattive, e ⁹ altri.

3. Caratterizzazione del BNC e MBNC pellicole

1. Proprietà meccaniche
   1. Eseguire carico normale e test di scarico nanoindentazione con un penetratore Berkovich. Il raggio di Berkovich diamante penetratore è di 20 nm.
   2. Utilizzare silice fusa e tungsteno calibrare area di contatto in funzione della profondità di penetrazione a RT. Durante la prova, montare i campioni nello indentazione con colla. Il penetratore avvicinato i campioni nella sua direzione di spessore.
   3. Selezionerà casualmente posizioni di indentazione su superfici campioni. Mantenere la distanza tra 2 rientri tra 200-300 mm.
   4. Applicare il carico allacampioni in passi e registrare lo spostamento corrispondente del penetratore. Analizzare la trama di carico vs profondità per trovare il modulo di Young.
   5. Eseguire il test nanoindentazione dei campioni in presenza di acqua deionizzata (DI acqua), e prova applicando tassi di carico tra 0,0001 mN / sec e 0.005 mN / sec, con carico picco tra 0,01 mN e 0,60 mN.
   6. Utilizzare una cella di liquido e mantenere i campioni in ambiente liquido. Questa configurazione unica per la caratterizzazione nanomeccaniche immerso in un ambiente fluido è ideale per simulare efficacemente la portata funzionalità biomeccanica delle membrane BNC e MBNC.
2. Caratterizzazione strutturale da SEM
   1. Caratterizzare la struttura della fibra nanocellulose microscopio elettronico a scansione (SEM).
   2. Lyophilize i campioni per 24 ore a -80 ° C. Poi montare su borchie SEM, polverizzare con il film Au-Pd per 10 secondi e analizzare mediante SEM.
   3. Prende le immagini con un ingrandimento di 22,000Xe 60,000X, con una tensione di accelerazione di 5 kV.
3. domini magnetici
   1. Lasciare le pellicole MBNC asciugare completamente a temperatura ambiente, e successivamente esporre per 5 minuti per un magnete permanente (1 Tesla).
   2. Immediatamente, effettuare le misure di forza magnetica utilizzando un bio-AFM secondo il protocollo del produttore.
   3. Per ciascuna misurazione, catturare prima le caratteristiche topografia e acquisire i domini magnetici durante un secondo passaggio. Ottenere entrambe le misure con la bio-AFM in modalità senza contatto.
   4. Caratterizzazione magnetica delle nanoparticelle è condotta utilizzando vibrante magnetometro campione (VSM) nel sistema misurazioni proprietà fisiche (PPMS) di Quantum Design, a temperatura ambiente (300 K), con un campo magnetico nell'intervallo da -10000 a 10.000 Oe.
4. citocompatibilità
   1. Seme umano aortica cellule muscolari lisce (HASMC) in una piastra di coltura tissutale 6 pozzetti ad una densità di 1.0x10 ^{3 cellule / cm 2 e incubare per 24 ore in presenza dei campioni: pellicole BNC e MBNC (ciascuna con uno schermo da 15,6 mm di diametro).}
   2. Utilizzare popolazioni di cellule non trattate e perossido trattata idrogeno come controlli negativi e positivi rispettivamente.
   3. Eseguire il test di Comet secondo protocolli del produttore e le linee guida suggerite da A. Azqueta & AR Collins ^10.
   4. Utilizzare il colorante acido nucleico SYBR oro in questo saggio di intercalare e fluorescente etichettare il DNA contenuto nei campioni elettroforesi secondo il protocollo del produttore.
      Nota: le cellule che non sono sottoposti ad alcuna danni al DNA in presenza di campioni BNC e MBNC, mostrerà una fluorescenza rotonda nucleoide verde, mentre le cellule danneggiate del DNA avranno lungo comete - campioni positivi avranno nucleoidi (la testa della cometa) seguito da code che contengono materiale DNA frammentato (percentuale di DNA nella coda).

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Risultati

Il periodo di incubazione di G. xylinus era un totale di 9 giorni, ma le pellicole cominciò a formare prima ed erano evidenti dopo circa 2 giorni. L'aspetto macroscopico del BNC è illustrato nella Figura 1, la cui forma imita quella della cultura piatto coltivate. Figura 2 descrive il procedimento per produrre pellicole BNC-IONP, che riassume le principali fasi del protocollo di cui sopra nonché la configurazione dei comp...

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Discussione

Lo spessore e la dimensione della pellicola BNC possono essere facilmente manipolati variando il tempo di incubazione e la dimensione del pallone in cui è cresciuto durante la coltivazione statica. I microproprietà del BNC, quali la porosità, possono essere modificate cambiando il rapporto di ossigeno nella cultura statica. Le concentrazioni di ossigeno maggiore resa più difficile BNC ^11. A. Bodin e collaboratori hanno prodotto tubi di BNC con una pressione di scoppio fino al 880 mm Hg modificando il rapp...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glucoacetobacter xylinus	ATCC	700178
Agar	Sigma Aldrich	A1296-500G
D-Mannitol Bioxtra	Sigma Aldrich	M9546-250G
Yeast Extract	BD Biosciences	212750
Bacteriological Peptone	Sigma Aldrich	P0556
Sodium Hydroxide, 50% Solution In Water	Sigma Aldrich	158127-100G
Iron(III) Chloride Hexahydrate	Sigma Aldrich	236489-100G
Ammonium Hydroxide	Macron Fine Chemicals	6665-46
Poly(Ethylene Glycol), Average Mn 400	Sigma Aldrich	202398-250G
Iron (II) chloride tetrahydrate	Sigma Aldrich	44939-250G
Disposable Petri dish	Sigma Aldrich	BR452000
Disposable Inoculating Loop	Fisher Scientific	22-363-604
Anhydrous Calcium Sulfate	W.A. Hammond Drierite	13001
High vacuum grease	Sigma Aldrich	Z273554-1EA
Laboratory pipetting needle with 90° blunt ends	Sigma Aldrich	CAD7937-12EA
pH test strips	Sigma Aldrich	P4786-100EA
Round-bottom three neck angle type distilling flask	Sigma-Aldrich	CLS4965250
Silicone oil for oil baths	Sigma-Aldrich	85409-250ML
Drying Tube	Chemglass	CG-1295-01
Septum Stopper, Sleeve Type	Chemglass	CG-3022-98
Magnetic stir bar	Chemglass	CG-2001-05
Condenser	Chemglass	CG-1218-01
Temperature Controller	BriskHeat	SDC120JC-A
Stirring Hotplate	Fisher Scientific	11-100-49SH
Comet Assay Kit	Trevigen	4250-050-K
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain	Life Technologies	S-11494
bio-AFM	JPK Instruments	NanoWizard 4a BioScience AFM
Nanoindenter	Micro Materials Ltd	Multi-module mechanical tester
Scanning electron microscopy (SEM)	Hitachi High Technologies America	Hitachi S-4800