酸化鉄ナノ粒子との機能を有する磁性細菌Nanocelluloseの作製

要約

Here, we present a protocol to make a bacterial nanocellulose (BNC) magnetic for applications in damaged blood vessel reconstruction. The BNC was synthesized by G. xylinus strain. On the other hand, magnetization of the BNC was realized through in situ precipitation of Fe²⁺ and Fe³⁺ ferrous ions inside the BNC mesh.

要約

この研究では、細菌によって産生される細菌nanocellulose（BNC）がグルコンxylinus磁性細菌nanocellulose（MBNC）を得鉄（Fe ₃ O _{4）（IONP）}酸化鉄ナノ粒子とin situで合成され、含浸されています。 MBNCの合成は、正確かつ特異的に設計された多段階プロセスです。簡潔には、細菌nanocellulose（BNC）ペリクルは保持G.から形成されていますサイズと形態の我々の実験要件に応じxylinus株 。塩化鉄（III）六水和物（のFeCl _{3・6H 2} O）および2鉄（II）塩化物水和物（のFeCl _{2・4H 2} O）の溶液：1のモル比で調製し、脱酸素、高純度の水で希釈されます。 BNCのペリクルは、その後、反応物と容器内に導入されます。この混合物を沈殿させるためにドロップすることにより撹拌し、次いで、添加されたシリコンオイルバス及び水酸化アンモニウム（14％）中で80℃に加熱しますBNCメッシュに第一鉄イオン。この最後のステップは、BNCのペリクルに磁気特性を付与する細菌nanocelluloseメッシュ内部のその場でのマグネタイトナノ粒子（ _ある Fe ₃ O _4） で形成することができます。毒性アッセイは、BNC-IONPペリクルの生体適合性を評価しました。ポリエチレングリコール（PEG）は、それらの生体適合性を改善するためにIONPsをカバーするために使用されました。走査型電子顕微鏡（SEM）画像はIONPがBNCマトリックスの空間をインターレース原線維に優先的に位置していたが、それらのいくつかはまた、BNCリボンに沿って発見されたことを示しました。 MBNC上で行わ磁気力顕微鏡の測定はMBNCペリクルの磁気的性質を確認し、高いと強度が弱い磁場で存在磁区を検出しました。この作業で得られたヤング率の値は、以前の研究で、いくつかの血管のために報告されたものと合理的な合意でもあります。

概要

細菌性nanocellulose（BNC）は、 アセトバクター・キシリナム菌株によって合成もグルコンxylinusとして知られており、静置培養中の空気-液体界面でのフィルムまたはペリクルの形で堆積されます。これらのBNCのペリクルは、それらが成長している容器の形態を採用し、それらの厚さは、培養中の日数に依存します。A. xylinusは、重合およびその後の結晶化の過程を経てセルロースミクロフィブリルの合成のための培地中のグルコースを使用しています。グルコース残基の重合は、グルカン鎖が細胞エンベロープに分散単一孔から押し出される細菌の外膜で行われます。セルロースミクロフィブリルの結晶化は、H結合¹枚を積層し、続いてファンデルワールス結合によりグルカン鎖状シートの形成と細胞外空間で発生します。

磁石BNCマトリックスに統合ICナノ粒子は、動脈壁の損傷部位に、磁性ナノ粒子を含む平滑筋細胞（平滑筋細胞）を指示し、閉じ込めるために必要な力を増大させるために外部磁場によって容易に操作することができます。この戦略は離れて、他の組織からのSMCを保持し、血流によって及ぼされる力に抗して所定の位置に細胞を保持します。平滑筋細胞は、それらが中膜²に主に位置する豊富な層を形成する血管のvasoelasticityにおいて重要な役割を果たすことが示されています。

MBNCの合成に使用される方法は、BNCペリクルを浸漬し、80℃の塩化鉄（III）六水和物と塩化鉄（II）四水和物の溶液中で攪拌することを含みます。水酸化アンモニウムは、BNCメッシュ内部の酸化鉄ナノ粒子を形成するために添加されます。水酸化アンモニウムの添加は黒にオレンジ色の溶液の色を変化させます。一緒にBNC線維に沿ってIONPsコンパクト不均一な分布を持つの。

このプロトコルは行方不明、破損または負傷した小径の血管の代用として使用することを意図している私たちは、磁性細菌nanocellulose（MBNC）と命名している細菌nanocellulose磁性ナノ粒子ペリクル、の設計に焦点を当てています。 HS Barudおよび共同研究者らは最近、PEGおよび超常磁性酸化鉄ナノ粒子³の安定した水性分散液中のBNCペリクルを混合することにより、BNCベースのフレキシブル磁気紙を製造するための同様の作業を公開しています。ここでは、バクテリアセルロースの生産および磁性ナノ粒子と、その場での含浸を説明します。単一のDNA鎖切断の検出に基づく細胞毒性アッセイは、BNCとMBNCペリクルの生体適合性を試験しました。

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プロトコル

細菌Nanocellulose（BNC）の作製

注：特に指定のない限り、すべての手順は、無菌条件下で行われます。

1. 培養液を準備します。
   1. 酵母エキス、ペプトン15gのマンニトール125.0 gであり、高純度の水500mlを25gを組み合わせることにより、液体培養培地500mlを調製します。 4℃で20分間、店舗120℃で、この混合物をオートクレーブ。
   2. 酵母エキス、ペプトン3.0gのマンニトール25.0 gであり、高純度の水、100mlの5.0 gの寒天を15gを添加することによって、半固体培地100mlのを準備します。 20分間120℃で、この混合物をオートクレーブ。一度、90ミリメートル×16ミリメートルのプラスチックシャーレ中の混合物の堆積物5ミリリットルをオートクレーブ処理。解決策は、さらに使用するまで、この温度で​​4℃、店でゲル化することを可能にします。
2. G.を再水和xylinus菌株培養液を1ml添加し、ピペッティングにより凍結乾燥したバイアル中で保存し製造者の指示によって示されるように、ダウン。
3. 接種ループを使用して、細菌懸濁液の小滴で半固体培地を含むペトリ皿に接種します。接種物は皿の中央に端からジグザグ方向にループを移動させることにより、全体のペトリ皿をカバーしていることを確認してください。
4. CO ₂のないインキュベーター中で72時間、26℃でペトリ皿をインキュベートします。インキュベーション期間が完了すると、小さな白いコロニーが見えます。コロニーはすぐに使用されていない場合は、パラフィルムで蓋を密閉し、逆さまに皿を置くことによって4℃でペトリ皿を格納します。コロニーは、最大6ヶ月間、そのように格納することができます。
5. トランスファー24ウェル組織培養プレートの各ウェルに、ステップ（1.1.1）で調製した液体培地2mlの。ステップでの接種ペトリ皿からの接種針（1.3）と2個のコロニーを取り、組織培養プレートの第一のウェルに入れます。 R残りの23ウェルについて同じ手順をEPEAT。
6. 7日間、30℃の組織培養プレートをインキュベート。 図1に示されるように、これは16mmの直径及び約2〜3ミリメートルの直径の厚さ24 BNCペリクルの合計が得られます。
   注意：プレートを振盪することにより、例えば、インキュベーション期間中の任意の時点で細菌培養を邪魔しないでください。インキュベーション期間、G.中xylinus、静的培養条件の下でフラスコの形状と大きさを採用する気液界面でのポリマーの結晶性メッシュを形成するグルコピラノース糖分子を押し出します。細菌nanocellulose（BNC）として知られるこのポリマーマトリックスは、インキュベーション期間の終了時に顕著です。
7. 増殖培地からBNCのペリクルを収集し、Gの全ての痕跡を除去するために、50℃で1時間1％のNaOH溶液200mlにそれらを滅菌xylinus。必要に応じて、磁気バーを用いて300rpmでこの溶液を攪拌そして撹拌プレート。 NaOH溶液を捨て、新たに調製した1％のNaOH溶液の200ミリリットルを追加します。もう一度同じ手順を繰り返しあるいは溶液中のBNCペリクルは、半透明の外観を取得するまで。
8. 水で3回のBNCペリクルをすすぎ、室温で高純度水に格納します。 BNCペリクルが完全に水に沈められ、任意の時間で乾燥させていないことを確認します。
9. 20分間121℃でBNCのペリクルをオートクレーブ。
   注：Märtsonと共同研究者により行われたラットにおけるin vivo皮下研究では、60週間の移植後BNCの非劣化兆候を示しました。確かに、BNCは、哺乳動物には存在しない微生物および真菌の酵素による自然の中で分解可能です。一方、BNCの生分解性は、 インビボ ⁴ でミクロフィブリルネットワークを弱める、機械的、化学的、および生物学的プロセスの結果であり得ます。

2.合成ポリマー被覆酸化鉄ナノ粒子と細菌Nanocellulose膜におけるその沈着

1. バブル水に任意の溶存酸素を除去し、窒素でそれを置き換えるために、窒素ガスで高純度水1000ml。
2. 2の溶液を調製するための三首丸底フラスコを使用：塩化鉄（III）六水和物（のFeCl _{3・6H 2} O）と鉄（II）塩化物水和物の1モル比（のFeCl _{2・4H 2} O）で希釈脱酸素化、高純度の水で。例えば、FeCl ₃を5.4gの・を使用6H ₂ Oおよび脱酸素し、高純度水10ml中のFeCl _{2・4H 2} Oの1.98グラム。この準備が攪拌するにはあまりにも粘性が困難になった場合、脱酸素化、高純度の水20ml中のFeCl ₃の0.54グラム・のFeCl ₂の6H ₂ O及び0.198グラム・4H ₂ Oを使用します。
   注：このCHを計量することにより、空気に4H ₂ O・のFeCl ₂の露光時間を削減できるだけ速くemical化合物。いったん三つ口丸底フラスコに導入して、窒素ガスの供給と冷却管に接続されるまで、セプタム栓で三首丸底フラスコを閉じ。
3. セプタム栓で打ち抜き、容器の首に固定された針に窒素ガス供給を接続することにより、窒素ガスの一定の入口と出力を提供するために、容器の2首を使用してください。
4. 反応物と容器にステップ1.5で、以前に調製した1 BNC用ペリクル（直径の15.6ミリメートル、厚さ2-3 mm）を配置します。サンプルが完全に液体に沈めていることを確認します。
5. 冷却管に容器の残りの首を接続します。さらに、冷却管の上部に無水硫酸カルシウムを充填した乾燥管を使用します。冷却管を通して水を実行します。
6. 真空グリースでガラスジョイントのすべてを封印。
7. 攪拌を用いて80℃にシリコーン油浴中で溶液を加熱しますホットプレートとステップ2.10までこの温度を保持します。 5分間、350rpmで反応物を混合する小さな磁気撹拌棒を使用してください。確認するBNC適切鉄溶液を含浸させ、反応物を完全に溶解されます。実験終了まで混合物を攪拌してください。
   注：シリコーンオイルの温度を確認するために温度計を利用します。これは、80°Cまで安定であるべきです。
8. ピペット針を用いて鉄溶液10mlに700回転に攪拌速度を増加させ、（ドロップして）追加、5分の時間間隔で、水酸化アンモニウム5mlの（NH ₄ OH、14％）となっていましたまた、セプタム栓でパンチ。水酸化アンモニウムの添加後、溶液の色は黒に黄色/オレンジ色の変化します。
9. 別の5分間80℃で溶液を攪拌し続けます。サンプルの完全性を維持するために、高速の動揺を回避します。ハイスピードは、 すなわち 、より高い1,000回転、破壊することができますサンプル。
10. 攪拌ホットプレートの温度制御底を使用して、30℃に溶液の温度を下げ、さらに5分間攪拌し続けます。その後、ホットプレートをオフにします。この時点で、IONPはBNCメッシュに組み込まれています。
11. RTまで混合物を冷却し、強力な永久磁石（ 例えば 、1テスラ）を用いて、磁性ナノ粒子（MNP）とBNCを分離します。上清をデカントしながら、これを行うには、その後、容器フラスコに混合物を転送し、血管の近くに磁石を保持したまま、所定の位置にのMNPとBNCを保持します。
    注意：誤って使用した場合、彼らは有害なことができるので、強力な磁石を取り扱う際は注意してください。手順（2.12）の場合 - （2.14）と（2.16）は、酸化からの粒子を防ぐために、（2.1）で予め調製脱酸素化、高純度の水を使用しています。
12. 100ミリリットルの水でのMNPとBNCを再懸濁します。優しく強くBNCに組み込まれていないすべてのMNPを除去するためのソリューションを振ります。秒をデカント磁石を用いて所定の位置にのMNPとBNCを保持することによって再びupernatant。
13. 上清を中性pH（pH約7）に達するまで、比色ストリップを用いて測定し、水のMNPとBNCを数回洗浄します。
14. ピンセットを使用してのMNPから磁気官能BNCまたは磁気細菌nanocellulose（MBNC）を分離し、水が透明に実行されるまで水でMBNC数回すすいでください。
15. UV（110から280ナノメートル）にMBNC O / Nを露出することによってMBNCを滅菌します。
16. 20分間、120℃で脱酸素化し、高純度水のオートクレーブ500ミリリットルと、この水20mlでMBNCを格納します。
17. 無菌的には、PEGの1％にサンプルを浸漬し、室温（37℃）で2時間撹拌しました。この手順は、BNCに堆積酸化鉄ナノ粒子、面^5-7に露出特にそれらの生体適合性及び安定性を向上させます。 PEGコーティングはMBNC 3Dネットワークを介して配布されます。
    注：裸IONPは空気中で容易に酸化されますそれらの高い化学的活性⁸の理由。 PEGは、非生分解性材料と見なされても、その化学的安定性は、水の含有量、pH、温度、酵素の存在下で、反応性酸素種は、反応性窒素種、その他⁹として適用の生物学的条件に依存します。

BNCとMBNCペリクルの3キャラクタリゼーション

1. 機械的性質
   1. 通常のロードを実行し、ベルコビッチ圧子を用いたナノインデンテーション試験をアンロードします。バーコビッチダイヤモンド圧子の半径は20nmです。
   2. RTで押し込み深さの関数として接触面積を校正するために、溶融シリカやタングステンを使用してください。試験中は、接着剤を使用してインデントにサンプルをマウントします。圧子は、その厚さ方向に試料に接近しました。
   3. ランダムにサンプル表面上のインデント位置を選択します。 200〜300ミリメートルの間の2インデント間の間隔をおいてください。
   4. に負荷を適用しますステップでサンプルと圧子の対応する変位を記録。ヤング率を見つけるために、深さ対負荷のプロットを分析します。
   5. 0.01 MNと0.60 mNとの間にピーク負荷で、0.0001 MN /秒、0.005 MN /秒の間の負荷率を適用することにより、脱イオン水（DI水）、およびテストの存在下での試料のナノインデンテーション試験を行います。
   6. 液晶セルを使用し、液体環境下でサンプルを維持します。液体環境中に浸漬ナノ機械特性評価のためのこのユニークなセットアップが効果的にBNCとMBNC膜のリーチ生体力学的機能をシミュレートすることが理想的です。
2. SEMによる構造解析
   1. 走査型電子顕微鏡（SEM）によりnanocellulose繊維構造を特徴付けます。
   2. -80℃で24時間、サンプルを凍結乾燥。その後、SEMスタッドにマウント10秒間のAu-Pd膜でスパッタし、SEMを用いて分析します。
   3. 22,000Xの倍率で画像をとりますそして、60,000X、5キロボルトの加速電圧を持ちます。
3. 磁区
   1. MBNCのペリクルは、室温で完全に乾燥することができ、その後、永久磁石（1テスラ）に5分間さらします。
   2. すぐに、製造業者のプロトコルに従ってバイオAFMを用いた磁気力の測定を行います。
   3. 各測定のために、第一の地形特徴をキャプチャし、第二のパスの間に磁区を取得します。非接触モードでのバイオAFMを用いて両方の測定値を得ます。
   4. ナノ粒子の磁気特性評価は、-10000〜10000エルステッドの範囲の磁場で、室温（300K）で、 量子デザインの物性測定システム（PPMS）で振動試料型磁力計（VSM）を用いて行われます。
4. 細胞適合性
   1. 1.0×10の密度で6ウェル組織培養プレート中にシードヒト大動脈平滑筋細胞（HASMC） ^{3細胞/ cm 2と試験サンプルの存在下で24時間インキュベート：BNCとMBNCペリクル（直径15.6 mmのそれぞれ）。}
   2. それぞれ、陰性および陽性対照として、細胞を処理した未処理および過酸化水素の使用集団。
   3. 製造業者のプロトコルおよびA. Azqueta＆ARコリンズ¹⁰によって示唆ガイドラインに従って、コメットアッセイを実行します。
   4. インターカレーと蛍光製造業者のプロトコルに従って電気泳動した試料に含まれるDNAを標識するために、このアッセイでは核酸色素SYBRゴールドを使用してください。
      注：DNA損傷を受けた細胞は、長い彗星を持つことになり、一方、BNCとMBNCサンプルの存在下で、任意のDNA損傷を受けない細胞は、蛍光丸い緑の核様体が表示されます - 陽性サンプルは、核様体（彗星の頭部）が続いてあります（尾部におけるDNAの割合）断片化DNAの材料を含む尾。

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結果

G.の潜伏期間xylinusは、9日間の合計であったが、ペリクルは、以前形成し始め、約2日後に明らかでした。 BNCの肉眼的外観を図1、その模倣皿成長文化のそれの形で表示されている。 図 2は、同様に上記のプロトコルに関係する主なステップをサマリーをBNC-IONPのペリクルを製造する方法について説明し要部構成。

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ディスカッション

BNCペリクルの厚さや大きさを容易にインキュベーション時間、それは静的培養中に成長しているフラスコの大きさを変えることによって操作することができます。 BNCのmicropropertiesは、多孔性として、静的培養中の酸素比率を変えることによって変更することができます。高い酸素濃度が厳しいBNC ^11を得^ました 。 A.ボーダンと共同研究者はG.の発酵プロセスの間に100％?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glucoacetobacter xylinus	ATCC	700178
Agar	Sigma Aldrich	A1296-500G
D-Mannitol Bioxtra	Sigma Aldrich	M9546-250G
Yeast Extract	BD Biosciences	212750
Bacteriological Peptone	Sigma Aldrich	P0556
Sodium Hydroxide, 50% Solution In Water	Sigma Aldrich	158127-100G
Iron(III) Chloride Hexahydrate	Sigma Aldrich	236489-100G
Ammonium Hydroxide	Macron Fine Chemicals	6665-46
Poly(Ethylene Glycol), Average Mn 400	Sigma Aldrich	202398-250G
Iron (II) chloride tetrahydrate	Sigma Aldrich	44939-250G
Disposable Petri dish	Sigma Aldrich	BR452000
Disposable Inoculating Loop	Fisher Scientific	22-363-604
Anhydrous Calcium Sulfate	W.A. Hammond Drierite	13001
High vacuum grease	Sigma Aldrich	Z273554-1EA
Laboratory pipetting needle with 90° blunt ends	Sigma Aldrich	CAD7937-12EA
pH test strips	Sigma Aldrich	P4786-100EA
Round-bottom three neck angle type distilling flask	Sigma-Aldrich	CLS4965250
Silicone oil for oil baths	Sigma-Aldrich	85409-250ML
Drying Tube	Chemglass	CG-1295-01
Septum Stopper, Sleeve Type	Chemglass	CG-3022-98
Magnetic stir bar	Chemglass	CG-2001-05
Condenser	Chemglass	CG-1218-01
Temperature Controller	BriskHeat	SDC120JC-A
Stirring Hotplate	Fisher Scientific	11-100-49SH
Comet Assay Kit	Trevigen	4250-050-K
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain	Life Technologies	S-11494
bio-AFM	JPK Instruments	NanoWizard 4a BioScience AFM
Nanoindenter	Micro Materials Ltd	Multi-module mechanical tester
Scanning electron microscopy (SEM)	Hitachi High Technologies America	Hitachi S-4800