Demir Oksit Nanopartiküller ile Fonksiyonlu Manyetik Bakteriyel Nanocellulose Fabrikasyon

Özet

Here, we present a protocol to make a bacterial nanocellulose (BNC) magnetic for applications in damaged blood vessel reconstruction. The BNC was synthesized by G. xylinus strain. On the other hand, magnetization of the BNC was realized through in situ precipitation of Fe²⁺ and Fe³⁺ ferrous ions inside the BNC mesh.

Özet

Bu çalışmada, bakteri Gluconacetobacter xylinus tarafından üretilen bakteriyel nanocellulose (BNC) sentezlenir ve manyetik bakteriyel nanocellulose (MBNC) elde etmek için demir oksit nanopartiküllerinin (IONP) ₍₄ Fe ₃ O) ile in situ olarak emprenye. MBNC sentezi hassas ve özel olarak tasarlanmış, çok-aşamalı bir işlemdir. Özet olarak, bakteri nanocellulose (BNC) ince zarlar korunmuş G. oluşturulmaktadır büyüklüğü ve morfolojisi deneysel ihtiyaçlarına göre xylinus süzün. Demir (III) klorür heksahidrat _(FeCl3 · 6H ₂ O) ve 2 demir (II) klorür tetrahidrat (FeCl ₂ · 4H ₂ O) ihtiva eden bir çözelti, 1 mol oranında hazırlanmış ve oksijenden arındırılmış yüksek saflıkta su ile seyreltilir. BNC zar daha sonra reaksiyona giren maddeler ile bir kap içinde sokulur. Bu karışım çökeltilmesi için bırakarak karıştırılmış ve daha sonra ilave edilir, bir silikon yağı banyosu ve amonyum hidroksit (% 14), 80 ° C'de ısıtılırDemir BNC düzenek içine iyonlarının. Bu son adım BNC tabakasına manyetik özellikleri kazandırmak için bakteri nanocellulose örgü içinde in situ manyetit nanopartiküller (O ₄ Fe ₃₎ şekillendirme sağlar. Toksikolojik deney BNC IONP ince tabakanın biyouyumluluk değerlendirmek için kullanıldı. Polietilen glikol (PEG) kendi biyouyumluluk geliştirmek için IONPs kapsayacak şekilde kullanılmıştır. Taramalı elektron mikroskobu (SEM) görüntüleri IONP BNC matrisi boşluk interlacing fibril tercihli bulunduğu, ama bazıları da BNC şeritler boyunca bulundu olduğunu göstermiştir. MBNC üzerinde yapılan manyetik kuvvet mikroskobu ölçümleri MBNC ince tabakanın manyetik doğasını teyit yüksek ve zayıf yoğunluklu manyetik alan ile varlığı manyetik etki tespit edildi. Bu çalışmada elde edilen Young modülü değerleri önceki çalışmalarda birçok kan damarları için bildirilenler ile makul uyum içindedir.

Giriş

Bacteria nanocellulose (BNC), aynı zamanda Gluconacetobacter xylinus şekilde bilinmektedir Acetobacter xylinum soyu, sentezlenebilir ve sabit kültür sırasında hava-sıvı arayüzünde filmler veya ince zarlar şeklinde tatbik edilir. Bunlar BNC zarlarına yetiştirildiği kabın şeklini benimsemek ve onların kalınlığı kültüründe gün sayısına bağlıdır. A. xylinus Polimerizasyon ve takip eden kristalleştirme süreciyle selüloz mikro-iplikçiklerinin sentezi için ortam içinde glükoz kullanılır. glukoz çökeltilerinin polimerizasyonu glukan zincirleri hücre zarfı dağılmış tek gözeneklerin ekstrüde bakteriyel hücre dışı membran gerçekleştirilir. Selüloz mikro-iplikçiklerinin kristalizasyon H-bağı ¹ tabakaların istif ardından van der Waals bağı ile glukan zincirli tabakaların oluşumu ile hücre dışı alanı oluşur.

MıknatısBNC matrisine entegre IC nanopartiküller arter duvarının hasar yerinde manyetik nanopartikülleri içeren doğrudan ve düz kas hücrelerinin sınırlandırmak için gerekli kuvveti (SMC'lere) arttırmak için harici bir manyetik alan tarafından kolayca manipüle edilebilir. Bu strateji SMC'lere uzak diğer dokulardan tutar ve kan akışı tarafından uygulanan kuvvete karşı hücrelerin sabitlenmesi. SMC'lere da tunika medya ² esas olarak merkezi bir bol tabakaları oluşturmak damar, bir vasoelasticity önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir.

MBNC sentezi için kullanılan yöntem BNC pelikül daldırılmış ve 80 ° C 'de, demir (III) klorür heksahidrat ve demir (II) klorid tetrahidrat çözeltisi içinde karıştırılmıştır içerir. Amonyum hidroksit BNC örgü içindeki demir oksit nano-tanecikleri meydana getirmek üzere ilave edilir. amonyum hidroksit eklenmesi siyah turuncu çözelti rengini değiştirir. Birlikte BNC fibril boyunca IONPs kompaktüniform olmayan bir dağılımı ile s.

Bu protokol eksik, bozuk veya yaralı küçük çaplı kan damarları için bir yedek olarak kullanmak üzere tasarlanmıştır manyetik bakteriyel nanocellulose (MBNC) adında var bakteriyel nanocellulose-manyetik nanoparçacık ince tabakanın, tasarım üzerinde duruluyor. HS Barud ve arkadaşları, en son PEG ve süperparamanyetik demir oksit nanopartiküllerinin ³ stabil bir sulu dispersiyon içinde BNC zarlarına karıştırılarak BNC tabanlı esnek manyetik kağıt üretmek için benzer bir çalışma yayınlamışlardır. Burada, bakteriyel selüloz üretimi ve manyetik nanopartiküller ile yerinde olan emprenye açıklar. tek bir DNA şeridi kınklan tespitine dayanan bir sitotoksisite tahlili BNC ve MBNC ince zarlar biyouyumluluk test etmek için kullanıldı.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Bakteriyel Nanocellulose 1. Hazırlama (BNC)

Not: Aksi belirtilmedikçe aşamaların tümü, aseptik koşullar altında gerçekleştirilir.

1. kültür ortamı hazırlayın.
   1. maya ekstresi, 25 g pepton 15 g, manitol 125.0 g, yüksek saflıkta su 500 mi birleştirerek sıvı kültür ortamında 500 ml hazırlayın. 4 ° C'de 20 dakika ve mağaza 120 ° C'de bu karışım otoklava.
   2. maya ekstresi, 5.0 g, pepton 3.0 g, manitol 25.0 g, ve yüksek saflıkta, 100 ml su için agar 15 g eklenerek yarı katı ortam 100 ml hazırlayın. 20 dakika boyunca 120 ° C 'de bu karışımı otoklava. Bir kez 90 mm x 16 mm plastik Petri tabağı içine yatırma karışımı 5 ml otoklava. sonraki kullanıma kadar bu sıcaklıkta 4 ° C'de jel çözeltisi ve mağaza izin verin.
2. G. rehydrate xylinus soyu sıvı kültür ortamında 1 ml ekleme ve pipetleme dondurularak kurutuldu şişelerde korunmuşaşağı olarak üreticinin talimatlarına göre belirtti.
3. Bir aşılama döngü kullanarak bakteriyel süspansiyon küçük damlacıklar ile yarı katı ortam içeren Petri kapları aşılamak. inokulum çanağı kenarından merkezine Zig zag yönünde döngü hareket ettirerek tüm Petri kabı kapsar emin olun.
4. _CO2 olmayan bir kuluçka 72 saat boyunca 26 ° C 'de Petri kapları inkübe edin. Kuluçka süresi tamamlandıktan sonra, küçük, beyaz koloniler görebilir. koloniler hemen kullanılmazsa, Parafilm ile kapağı sızdırmazlık ve baş aşağı yemekleri koyarak 4 ° C'de Petri kapları saklayın. koloniler 6 aya kadar bu şekilde saklanabilir.
5. Transfer 24 oyuklu doku kültür plakasının her bir oyuğuna aşama (1.1.1) 'de hazırlanan sıvı kültür ortamı 2 mi. Aşama aşılandı Petri kapları bir inokülasyon iğne (1.3) ile iki koloni alın ve doku kültür plakasının birinci oyuk içine yerleştirin. RGeri kalan 23 Kuyular için aynı prosedürü EPEAT.
6. 7 gün boyunca 30 ° C'de doku kültürü plakası inkübe edin. Şekil 1 'de gösterildiği gibi bu 16 mm çapında ve yaklaşık 2-3 mm çapında, kalınlığı 24 BNC ince zarlar toplam verecektir.
   Not: plakaları sallayarak, örneğin kuluçka dönemi sırasında herhangi bir noktada bakteri kültürü rahatsız etmeyin. Kuluçka süresinin, G. boyunca xylinus statik kültür koşulları altında şeklini ve şişe büyüklüğü kabul hava-sıvı arayüzü, bir polimerik kristalin örgü oluşturulması için glukopiranoz şeker molekülleri ekstrüde. Bakteriyel nanocellulose (BNC) olarak bilinen bu polimerik matris, kuluçka döneminin sonunda dikkat çekici olduğunu.
7. Büyüme ortamından BNC zarlarına toplayın ve G tüm izlerini ortadan kaldırmak için, 50 ° C 'de 1 saat süre ile,% 1 NaOH çözeltisi, 200 ml sterilize xylinus. İsteğe bağlı olarak, manyetik bir çubuk kullanarak 300 rpm'de bu çözüm karışmayave karıştırıcı plaka. NaOH çözeltisi atılır ve taze hazırlanmış% 1 NaOH çözeltisi, 200 ml ekle. bir kez daha aynı işlemi tekrarlayın veya çözelti içinde BNC ince zarlar kadar saydam bir görünüm kazanır.
8. su ile üç kez BNC zarlarına durulayın ve oda sıcaklığında, yüksek saflıkta su saklayın. BNC zarlarına tamamen suya batmış ve herhangi bir zamanda kurumasına izin olmadığından emin olun.
9. 20 dakika boyunca 121 ° C'de BNC zarlarına otoklav.
   Not: Märtson ve çalışma arkadaşları tarafından yapılan farede bir in vivo deri altı çalışma 60 hafta implantasyondan sonra BNC olmayan bozunma belirtileri gösterdi. Gerçekten de, BNC memelilerde mevcut olan mikrop ve mantar enzimleri, doğada olarak parçalanabilir. Öte yandan, BNC maddesinin biyolojik, mekanik, kimyasal ve in vivo ⁴ mikrofibril ağını zayıflatan biyolojik işlemlerin bir sonucu olabilir.

2. Sentezi Polimer kaplamalıDemir Oksit Nanopartiküller ve Bakteriyel Nanocellulose Membran Onun Biriktirme

1. Kabarcık su içinde çözünmüş oksijenin ayrılması ve azot ile değiştirmek için azot gazı ile yüksek saflıkta su 1000 mi.
2. 2 bir çözelti hazırlamak için, bir üç boyunlu yuvarlak tabanlı bir şişeye kullanın: demir (III) klorür heksahidrat _(FeCl3 · 6H ₂ O) ve demir (II) klorid tetrahidrat 1 mol oranında (FeCI ₂ · 4H ₂ O) ile seyreltilmiş deoxygenated yüksek saflıkta su ile. Örneğin, _FeCl3 5.4 g · kullanımı 6H ₂ O ve oksijenden arındırılmış yüksek saflıkta 10 ml su içinde FeCl ₂ · 4H ₂ O 1.98 g. Bu hazırlık karışmaya çok viskoz ve zor dönerse, oksijenden arındırılmış yüksek saflıkta su, 20 ml _FeCl3 0.54 g · FeCl ₂ 6H ₂ O ve 0.198 g · 4H ₂ O kullanın.
   Not: Bu ch tartarak ₂ O havaya FeCl ₂ · 4H pozlama süresini azaltınMümkün olduğunca hızlı emical bileşik. azot gaz temini ve yoğunlaştırıcı borusuna bağlı kadar sonra, üç boyunlu yuvarlak tabanlı bir şişe içine, septum stoper üç boyunlu yuvarlak dipli bir şişeye kapatın.
3. Geminin boyunlarına bir septum tıpa yumruk ve sabit bir iğneye azot gazı kaynağı bağlayarak sabit giriş ve azot gazı çıkış sağlamak için geminin iki boyunlarını kullanın.
4. reaksiyona giren maddeler ile bir kap içinde, daha önce adım 1.5 (çapı 15.6 mm ve kalınlığı 2-3 mm) elde edilmiştir 1 BNC film tabakası yerleştirin. Numune tamamen sıvıya olduğundan emin olun.
5. Bir kondansatör tüp geminin kalan boyun bağlayın. Buna ek olarak, kondansatör tüpünün üzerine, susuz kalsiyum sülfat ile doldurulmuş bir kurutma tüpü kullanın. kondansatör tüp aracılığıyla su çalıştırın.
6. vakum gres ile cam eklemlerin tüm Seal.
7. Bir karıştırma ile 80 ° C'ye kadar bir silikon yağı banyosu içinde çözelti Isıocak gözü ve adım 2.10 kadar bu sıcaklığı tutun. 5 dakika için 350 rpm'de reaktantları karıştırmak için küçük bir manyetik karıştırıcı çubuğu kullanın. emin olun BNC uygun demir solüsyonu ile emprenye edilir ve reaktifler tamamen eritilir. deneyin sonuna kadar karıştırıldıktan tutun.
   Not: silikon yağı sıcaklığını kontrol etmek için bir termometre yararlanın. 80 ° C'ye kadar kararlı olmalıdır.
8. Olan bir pipetleme iğne kullanılarak demir solüsyonu, 10 ml, 5 dakika, amonyum hidroksit, 5 ml bir zaman aralığı _(NH4OH,% 14), 700 rpm karıştırma işlemi hızını arttırmak ve (bırakarak) ekleyin Ayrıca septum stoper delikli. amonyum hidroksit ilave edildikten sonra, solüsyonun rengi siyaha, sarı / turuncu değişir.
9. 5 dakika daha 80 ° C'da, çözelti karıştırmaya devam edin. numunenin bütünlüğünü korumak için yüksek hızlı kıpırtılar kaçının. Yüksek hızlar, yani daha yüksek 1,000 rpm, yok edebilirörnek.
10. karıştırıldıktan ocak sıcaklık kontrolü alt kullanarak 30 ° C'ye kadar çözeltinin sıcaklığını düşürmek ve 5 dakika boyunca karıştırmaya devam edin. Sonra, sıcak plaka kapatın. Bu noktada, IONP BNC düzenek içine dahil edilmiştir.
11. RT aşağı Karışımı soğutun ve güçlü bir kalıcı mıknatıs (örneğin, 1 Tesla) kullanılarak manyetik nanopartiküller (MNP) ve BNC ayırın. Bunu yapmak için, bir gemi şişeye karışımı aktarın ve kaba mıknatıs yakın tutarak süpernatan ayrıldı Daha sonra, bir yer MNPS ve BNC tutun.
    Not: Yanlış kullanıldığında zararlı olabilir çünkü güçlü mıknatıslar tutarken dikkatli olun. adımlar (2.12) için - (2.14) ve (2.16) oksidasyon partikülleri önlemek için (2.1) 'de daha önce hazırlanmış deoksijenlenmedeki yüksek saflıkta su kullanın.
12. 100 mL su içinde MNPS ve BNC süspanse edin. Yavaşça güçlü BNC dahil olmayan tüm MNPS kaldırmak için çözüm sallayın. s Durusumıknatıs kullanılarak yerinde MNPS ve BNC tutarak tekrar upernatant.
13. Süpernatan nötral pH'a (pH-7) ulaşana kadar kolorimetrik şeridi kullanılarak ölçülen, su ile MNPS ve BNC birkaç kez yıkayın.
14. cımbız kullanarak MNPS gelen BNC fonksiyonalize-manyetik ya da manyetik bakteri nanocellulose (MBNC) ayırın ve su berrak bitene kadar su ile MBNC birkaç kez durulayın.
15. UV (110-280 nm) MBNC O / N teşhir ederek MBNC sterilize edin.
16. 20 dakika boyunca 120 ° C de deoksijene yüksek saflıktaki su Otoklav 500 mi ve 20 ml su içinde MBNC saklayın.
17. Aseptik, PEG% 1 örnek daldırın ve oda sıcaklığında 2 saat (37 ° C) karıştırılmıştır. Bu prosedür BNC yatırılır demir oksit nano yüzey ^5-7 maruz özellikle olanların biyouyumluluk ve kararlılığını geliştirir. PEG kaplama MBNC 3D ağ üzerinden dağıtılacak.
    Not: Çıplak IONP kolayca havada oksitleniryüksek kimyasal aktivitesi ⁸ çünkü. PEG, bir biyolojik olarak çözülemez bir malzeme olarak kabul edilir olsa da, kimyasal stabilite, su içeriği, pH, sıcaklık, enzimler varlığında reaktif oksijen türleri, reaktif nitrojen ve diğerleri ⁹ olarak uygulanan biyolojik koşullarına bağlıdır.

BNC ve MBNC ince zarlar 3. karakterizasyonu

1. Mekanik özellikler
   1. Normal yükleme ve Berkovich dişinin kullanarak boşaltma nanoindentation testi yapın. Berkovich elmas indenter yarıçapı 20 nm.
   2. Oda sıcaklığında, kertme derinliğinin bir fonksiyonu olarak temas alanını kalibre etmek için, erimiş silis ve tungsten kullanın. Test sırasında, tutkal kullanarak girinti örnekleri monte edin. batıcı kalınlığı yönünde örnekleri yaklaştı.
   3. Numuneler yüzeylerde rasgele seçme girinti yerleri. 200-300 mm arasında 2 girintiler arasındaki boşluğu tutun.
   4. Yükü uygulaadımda örnekler ve indenter karşılık gelen yer değiştirme kaydedin. Young modülü bulmak için derinlik vs yükün arsa analiz edin.
   5. 0.01 mN ve 0.60 mN arasında pik yük, 0.0001 mN / sn ve 0.005 mN / sn arasında yük oranları uygulanarak deiyonize su (DI su), ve test varlığında örneklerinin nanoindentation testi yapınız.
   6. bir sıvı hücre kullanın ve sıvı ortamında örnekleri tutmak. bir sıvı ortamda dalmış nanomechanical karakterizasyonu için bu benzersiz kurulum etkin bir BNC ve MBNC membranların ulaşmak biyomekanik işlevlerini taklit etmek idealdir.
2. SEM ile yapısal karakterizasyonu
   1. elektron mikroskobu (SEM) tarayarak nanocellulose lif yapısını karakterize eder.
   2. -80 ° C'de 24 saat süre ile örneklerin liyofilize edin. Sonra, SEM saplamalar üzerine monte 10 saniye boyunca Au-Pd film ile çıtırtı ve SEM ile analiz edin.
   3. 22,000X büyütmede görüntüleri alırve 60,000X, 5 kV bir hızlandırma voltajı ile.
3. manyetik alanlar
   1. Oda sıcaklığında kuruması için MBNC zarlarına izin verin ve daha sonra sürekli mıknatıs (1 Tesla) 5 dakika boyunca maruz kalmaktadır.
   2. Hemen sonra, üreticinin protokolüne uygun olarak bir biyo-AFM kullanılarak manyetik kuvvet ölçümleri yapın.
   3. Her ölçüm için, öncelikle topografya özellikleri yakalamak ve bir ikinci geçişte manyetik etki kazanır. Temassız modunda biyo-AFM ile hem ölçümleri alın.
   4. Nanopartiküllerin manyetik karakterizasyonu -10,000 10,000 Oe aralığında bir manyetik alan ile oda sıcaklığında (300 ° K), fiziksel özellik ölçümleri sistemi Kuantum Design (PPMS) titreşen Örnek manyetometre (VSM) kullanılarak yapılır.
4. hücre proliferasyonu
   1. 1.0x10 yoğunluğunda 6 oyuklu doku kültürü plakası Tohum, insan aortik düz kas hücreleri (HASMC) ^{3 hücre / cm2 ve test numuneleri mevcudiyetinde 24 saat süreyle inkübe edilir: BNC ve MBNC ince zarlar (çapı 15.6 mm) ekstrakte edildi.}
   2. sırasıyla negatif ve pozitif kontroller olarak, işlemden geçirilmemiş ve hidrojen peroksit ile muamele edilmiş hücreler popülasyonunu kullanın.
   3. Üreticinin protokolleri ve A. Azqueta & AR Collins ¹⁰ tarafından önerilen kılavuzlara göre Comet tahlil gerçekleştirin.
   4. birleştirmek için bu deneyde nükleik asit boya SYBR altın kullanmak ve floresan üreticinin protokolüne göre elektroforeze numunelerde bulunan DNA etiketleyin.
      Not: BNC ve MBNC örneklerinin varlığında herhangi bir DNA hasarını uğramayan Hücreler DNA hasarlı hücreler uzun kuyruklu olacak, oysa, bir floresan yuvarlak yeşil Nükleoitte gösterecektir - pozitif örnekler nükleotidler (kuyruklu başkanı) sahip olacak ve ardından (kuyruk DNA yüzdesi) parçalanmış DNA malzeme içeren kuyrukları.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

G. kuluçka dönemi xylinus 9 günlük bir toplam, ama ince zarlar daha önce oluşmaya başladı ve yaklaşık 2 gün sonra belirgindi. BNC makroskopik görünümü, Şekil 1 'de gösterilir, bu bulaşık yetiştirilen kültürün taklit eden şekli. Şekil 2 ve yukarıdaki protokole dahil ana aşamaları özetlemektedir olan BNC IONP zarlarına üretilmesi için işlemi tarif ana bileşenlerin konfigürasyonu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

BNC ince tabakanın kalınlığı ve büyüklüğü kolayca inkübasyon süresi ve statik yetiştirilmesi sırasında yetiştirilen olduğu şişe boyutunu değiştirerek kontrol edilebilir. BNC microproperties, porozite gibi statik bir kültür oksijen oranı değiştirilerek değiştirilebilir. Yüksek oksijen konsantrasyonu BNC ¹¹ sert verim. A. Bodin ve arkadaşları G. fermantasyon işlemi sırasında% 100 oksijene atmosferik oksijen oksijen oranını değiştirerek 880 mm Hg kadar bir patlama b...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glucoacetobacter xylinus	ATCC	700178
Agar	Sigma Aldrich	A1296-500G
D-Mannitol Bioxtra	Sigma Aldrich	M9546-250G
Yeast Extract	BD Biosciences	212750
Bacteriological Peptone	Sigma Aldrich	P0556
Sodium Hydroxide, 50% Solution In Water	Sigma Aldrich	158127-100G
Iron(III) Chloride Hexahydrate	Sigma Aldrich	236489-100G
Ammonium Hydroxide	Macron Fine Chemicals	6665-46
Poly(Ethylene Glycol), Average Mn 400	Sigma Aldrich	202398-250G
Iron (II) chloride tetrahydrate	Sigma Aldrich	44939-250G
Disposable Petri dish	Sigma Aldrich	BR452000
Disposable Inoculating Loop	Fisher Scientific	22-363-604
Anhydrous Calcium Sulfate	W.A. Hammond Drierite	13001
High vacuum grease	Sigma Aldrich	Z273554-1EA
Laboratory pipetting needle with 90° blunt ends	Sigma Aldrich	CAD7937-12EA
pH test strips	Sigma Aldrich	P4786-100EA
Round-bottom three neck angle type distilling flask	Sigma-Aldrich	CLS4965250
Silicone oil for oil baths	Sigma-Aldrich	85409-250ML
Drying Tube	Chemglass	CG-1295-01
Septum Stopper, Sleeve Type	Chemglass	CG-3022-98
Magnetic stir bar	Chemglass	CG-2001-05
Condenser	Chemglass	CG-1218-01
Temperature Controller	BriskHeat	SDC120JC-A
Stirring Hotplate	Fisher Scientific	11-100-49SH
Comet Assay Kit	Trevigen	4250-050-K
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain	Life Technologies	S-11494
bio-AFM	JPK Instruments	NanoWizard 4a BioScience AFM
Nanoindenter	Micro Materials Ltd	Multi-module mechanical tester
Scanning electron microscopy (SEM)	Hitachi High Technologies America	Hitachi S-4800