JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Thromboembolic stroke models are vital tools for optimizing the recanalization therapy. Here we report a murine thrombotic stroke model based on transient cerebral hypoxic-ischemic (tHI) insult, which triggers thrombosis and infarction, and responds favorably to tissue plasminogen activator (tPA)-mediated fibrinolysis in a therapeutic window similar to those in stroke patients.

Abstract

מחקר שבץ סבל עיכובים רבים בתרגום טיפולי נוירו לתוך פרקטיקה קלינית. לעומת זאת, הטיפול בעולם האמיתי (thrombolysis tPA) לעתים רחוקות מייצר יתרונות בדגמים ניסיוניים המבוסס על חסימה מכאני, אשר שולטים מחקר פרה-קליני שבץ. פיצול זה בין הספסל והמיטה מרמז על הצורך להעסיק דגמי tPA מגיבים במחקר פרה-קליני שבץ. לשם כך, מודל שבץ טרומבוטיים פשוט וtPA-reactive הוא המציא ושתואר כאן. מודל זה מורכב מחסימה הזמנית של עורק תרדמה המשותף חד-צדדי ואספקה ​​של חמצן 7.5% באמצעות מסכת פנים בעכברים בוגרים למשך 30 דקות, תוך שמירה על הטמפרטורה רקטלית של בעלי החיים ב37.5 ± 0.5 מעלות צלזיוס. למרות קשירה הפיכה של עורק תרדמה חד-צדדי או היפוקסיה כל מודחקת זרימת דם במוח רק זמני, השילוב של שניהם העלבונות שנגרם נמשך גירעונות reperfusion, הפיברין ותצהיר של טסיות דם, וinfar הגדולct בשטח המסופק עורק המוח האמצעי. חשוב לציין, הזרקה של רקומביננטי tPA ברמה של 0.5, 1, או 4 שעות שלאחר תי (10 מ"ג / קילוגרם) וריד זנב סיפק הפחתה של גודל שיעור תמותה ואוטם תלוי זמן. מודל השבץ חדש זו הוא פשוט ויכול להיות טופל בכל מעבדות להשוות את תוצאות ניסוי. יתר על כן, זה גורם פקקת ללא craniectomy או החדרת תסחיפים מראש יצר. בהתחשב ביתרונות הייחודיים אלה, מודל תי הוא תוספת שימושית לרפרטואר של מחקר פרה-קליני שבץ.

Introduction

Thrombolysis וrecanalization הוא הטיפול היעיל ביותר של שבץ איסכמי חריף בפרקטיקה קלינית 1. ובכל זאת, רוב המחקר פרה-קליני neuroprotection בוצע במודל חולף מכונאי חסימה (חסימת intraluminal תפר האמצע מוחית עורק) שמייצר התאוששות מהירה של זרימת דם במוח על הסרת החסימה של כלי הדם ומראה לא מעט על מנת יתרונות על ידי thrombolysis tPA. זה כבר הציע כי הבחירה המפוקפקת של דגמי שבץ תרמה, לפחות בהחלק, לקושי בתרגום טיפול נוירו לחולי 2,3. לפיכך, יש שיחת הגדלת להעסקת דגמי שבץ תרומבואמבוליים tPA מגיבים במחקר פרה-קליני, אך מודלים כאלה צריכים גם בעיות טכניות (ראה דיון) 4-7. כאן אנו מתארים מודל שבץ טרומבוטיים חדש המבוסס על עלבון חד צדדי חולף חוסר חמצן-איסכמי (תי) והתגובות שלה לטיפול tPA לוריד 8.

מודל שבץ תי פותח על בסיס הליך לוין (קשירת קבע של עורק תרדמה משותפת חד-צדדי ואחרי חשיפה להיפוקסיה החולפת בתא) שהומצא לניסויים בחולדות מבוגרות בשנת 1960 9. הליך לוין המקורי דהוי לתוך החושך כי זה רק מיוצר נזק מוחי משתנה, אבל באותו העלבון שנגרם נוירופתולוגיה עקבית בגורי מכרסמים כאשר הוא מחדש הוצג על ידי רוברט ואנוצ'י ועמיתיו כמודל של אנצפלופתיה חוסר חמצן-איסכמי בילוד (hie) בשינה 1981 10. בשנים האחרונות, כמה חוקרים מחדש מותאמים מודל לוין-אנוצ'י לעכברים בוגרים על ידי התאמת הטמפרטורה בתא חוסר חמצן 11. זה מתקבל על הדעת שהנגעים במוח עולים בקנה אחד בהליך לוין המקורי יכולים לנבוע מתנודות טמפרטורות גוף של מכרסמים מבוגרים בחדר חוסר חמצן. כדי לבדוק השערה זו, שינינו את הליך לוין ידי מתן גז חוסר חמצןדרך facemask, תוך שמירה על טמפרטורת הליבה של מכרסמים על 37 מעלות צלזיוס על השולחן כירורגית 12. כצפוי, בקרת טמפרטורת גוף מחמיר גדלה מאוד את שחזור של פתולוגיה המוח הנגרם על-HI. עלבון HI גם מפעיל קרישה, autophagy, ואפורה ולבן-עניין פציעה 13. גם חוקרים אחרים השתמשו במודל HI לחקור תגובות דלקתיות פעימות הודעה 14.

תכונה ייחודית של מודל שבץ HI היא שזה כדלקמן השלישייה של Virchow של היווצרות קריש דם, כוללים הקיפאון של זרימת דם, פגיעת אנדותל (למשל עקב סטרס חמצוני המושרה HI), וhypercoagulability (הפעלת טסיות דם הנגרם על-HI) (בשיתוף פעולה הדוק איור 1 א) 15. ככזה, מודל HI יכול ללכוד כמה מנגנוני pathophysiological רלוונטיים לשבץ איסכמי בעולם האמיתי. עם הרעיון הזה בראש, אנחנו נוספים מעודנים מודל HI עם קשירה הפיכה של האו"םעורק תרדמה משותף ilateral (ולכן כדי ליצור עלבון HI חולף), ונבדק תגובותיה לthrombolysis tPA עם או בלי Edaravone. Edaravone היא נבלות רדיקלים חופשיות שכבר אושרו ביפן לטיפול בשבץ איסכמי בתוך 24 שעות מהופעת 9. הניסויים שלנו הראו כי HI כקצר כ30 דקות חולפות מפעיל אוטם טרומבוטיים, וכי טיפול tPA-Edaravone שילוב מקנה 8 יתרונות סינרגטיים. כאן אנו מתארים ניתוחים מפורטים ושיקולים מתודולוגיים של מודל תי, אשר ניתן להשתמש בי כדי לייעל טיפולי reperfusion של שבץ איסכמי חריף.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

פרוטוקול זה אושר על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) מאוניברסיטת אמורי ועוקב המכונים הלאומי לבריאות קו מנחה לטיפול ושימוש בחי מעבדה.

1. התקנה

  1. הכן את המיטה כירורגית על כרית החימום מחוברת עם משאבת חום על 37 מעלות צלזיוס במשך לפחות 15 דקות לפני הניתוח. מניחים גליל צוואר באמצעות החבית של 3 מיליליטר מזרק על מיטת הניתוחים. הכן את גז ההרדמה עם isoflurane 2% באוויר רפואי.
  2. הכן מלקחיים autoclaved, מספריים, מחזיקי מחט מיקרו, hemostat, צמר גפן ותפרים. הכן דבק רקמות ומשחת עיניים.
  3. להגדיר את מערכת היפוקסיה ובקרי טמפרטורה עם מנורת חימום ובדיקה רקטלית. הכן גז היפוקסיה עם isoflurane 2% ב- 7.5% O 2 מאוזנת 92.5% N 2.
  4. שעה אחת לפני הניתוח, עכברים analgesized על ידי הזרקה תת עורית של שחרור איטי Meloxicam (4.0 מ"ג / קילוגרם).
2. חלוף מוחין היפוקסיה-איסכמיה (איור 1)

  1. הרדימי C57BL זכר 10-13 שבוע ישן / 6 עכברים במשקל 22 עד 30 גר 'בחדר האינדוקציה ההרדמה עם 3% isoflurane עד שהחיה אינה מגיבה ללחיצת רגל, ולאחר מכן להסיר את השיער על צוואר נכון באמצעות מכונת גילוח חשמלית.
  2. מניחים עכברים על המיטה כירורגית מחוברת עם 2% isoflurane באוויר רפואי בקצב זרימה של 2 ליטר / דקה. forelimbs המאובטח נמתח לאורך גליל צוואר בצדדים באמצעות קלטת רפואית.
  3. נקה את האתר כירורגית לחתך בבטאדין ואחריו אלכוהול ולאחר מכן צמר גפן.
  4. תחת מיקרוסקופ לנתח, לעשות חתך 0.5 סנטימטר ימני של צוואר הרחם באמצעות מלקחיים ישרים ומספרי מיקרו כ -0.2 סנטימטר לרוחב מעור קו האמצע.
  5. השתמש זוג מלקחיים משוננים בסדר לפרק fascia ורקמה לחשוף את עורק התרדמה המשותף הימני (RCCA). להפריד את RCCA זהירות מעצב מחנק באמצעות זוג מלקחיים חלקים בסדר.
  6. חי לקשור את שני חתוך 5-0 תפר משי (releasable) על RCCA, ולאחר מכן לתפור את העור באמצעות תפר 4-0 ניילון monofilament (איור 1 ג).
  7. החל משחה עין על שני העיניים כדי למנוע יובש.
  8. במהירות להעביר את העכברים למערכת היפוקסיה ולשים האף ופה במסכת פנים עם 2% isoflurane ב7.5% O 2 בקצב זרימה של 0.5-1 ליטר / דקה למשך 30 דקות.
    1. במהלך היפוקסיה, להשתמש בקרי טמפרטורה עם מנורות חימום לשלוט על הטמפרטורה רקטלית ב37.5 ± 0.5 מעלות צלזיוס. צג קצב הנשימה ב80-120 נשימות / דקה. התחזוקה של טמפרטורת הגוף מעל 37 מעלות צלזיוס במהלך היפוקסיה חשובה ליצור אוטם מוחי עולה בקנה אחד. קצב נשימה נמוך בדרך כלל קורה אחרי היפוקסיה 20 דקות. הסר את מסכת הפנים ולאפשר אספקת אוויר נורמלית אם קצב הנשימה יורד מתחת לגיל 40. זה לוקח 1-2 דקות ולא נחשב לזמן היפוקסיה 30 דקות.
  9. לאחר היפוקסיה, להעבירעכברים למיטת ניתוח ולשחרר את שני תפרים מRCCA. לסגור את הפצע באמצעות דבק רקמות, ולאחר מכן להחזיר עכברים לכלוב. תכלול בעלי החיים אם שניהם שני קשרים חיים משתחררים באופן בלתי צפוי לאחר היפוקסיה.
  10. צג העכברים למשך 5-10 דקות להתאושש מהיפוקסיה והרדמה. הנח את המזון הרטוב בכלוב ולהחזיר אותו למתקן טיפול בבעלי חיים.
    הערה: בעלי חיים מראים מתון עד חמורה התנהגות מלקחיים ב 24 שעות לאחר תי מתואמים עם עבירת המוח. רוב בעלי החיים עם תסמיני התקף למות לפני נקודת הזמן 24 שעות לאחר תי.

הדמיה ניגודיות 3. לייזר רבב

הערה: למרות שזה לא הליך חיוני של מודל תי, מערכת הדמיה ניגוד דו ממדי רבב לייזר 16 יכולה לשמש כדי לאפיין את השינויים בזרימת דם במוח (CBF) במהלך או לאחר היפוקסיה-איסכמיה החולפת. לתעד את השינויים של CBF תחת תי, שיא מייד לאחר stEP 2.6. לחלופין, כדי להשוות התאוששות CBF אחרי עלבון תי, ניתן לבצע הליכים אלה הבאים הצעד 2.10.

  1. הנח עכבר הרדים במצב שכיבה ולבצע חתך קו האמצע 1 ס"מ ארוך על הקרקפת עם הגולגולת החשופה אבל לא נפתחה.
  2. צג CBF בשני אונות המוח תחת תרמי זרימת דם על פי הפרוטוקול של היצרן ולהתחיל להקליט את זרימת דם במוח באופן מיידי לאחר ניתוח CCAO (שלב 2.6). המשך במשך 50 דקות.
  3. הצג תמונת CBF עם יחידות שרירותיות בלוח 16 צבעים ולנתח בזמן אמת האזורים הנבחרים באמצעות תוכנת MoorFLPI הבאה הוראות היצרן (איור 2).
  4. לאחר הקלטת תמונת CBF, לסגור את הקרקפת עם דבק רקמות ולהחזיר את בעלי החיים לכלוב.

מנהל 4. tPA

  1. להזריק בעלי חיים בוריד הזנב עם הממס או 10 מ"ג / קילוגרם רקומביננטי tPA (220-300 ו# 956; L של 1 מ"ג / מ 'tPA) ברמה של 0.5, 1, או 4 שעות לאחר tCCAo תוספת היפוקסיה (איור 4).

איתור נזק 5. מוח עם מספר אפשרויות שונות

הערה: כדי לאסוף דגימות מוח, להרדים את העכברים בבית 1, 4 או 24 שעות לאחר תי.

  1. שיטה לבצע כימות של נפח אוטם על ידי in vivo כלוריד 2,3,5-Triphenyltetrazolium (TTC) בשעה 24 שעות לאחר עלבון תי כמתואר קודם. 17
    1. Intraperitoneally להזריק חיות עם 1.4 M פתרון מניטול (~ משקל גוף 0.1 מיליליטר / g) 30 דקות לפני זלוף transcardial. עכברי Perfuse Transcardial עם PBS ואחריו 10 מיליליטר של TTC 2%.
    2. הסר את המוח של בעלי חיים עם מכשירי ניתוח לאחר 10 דקות ומניח לparaformaldehyde 4% לקיבעון הלילה וסעיף לעובי 1 מ"מ עם vibratome.
    3. הצמד סדרה של ארבע שקופיות מוח מחולקות על ידי מיקרוסקופ וקוואנט הדיגיטלייםify נפח האוטם כיחס בין שטח אוטם השריר (אזור לבן בצד ימין) לאזור של חצי הכדור ניזוק, הנגדי באמצעות תוכנת ImageJ.
  2. לחלופין, לבצע היווצרות פקקת ידי immunofluorescence בשעה 1 לאחר עלבון תי.
    1. להקפיא את המוח הקבוע במתחם OCT וסעיף המוח בגיל 12 מיקרומטר עובי באמצעות cryostat.
    2. דגירה שקופיות המוח עם נוגדן ארנב נגד פיברינוגן (1: 100) הבא על ידי הצבע עז נגד הארנב Alexa Fluro 488 (1: 200) כדי לבחון את הקרינה במיקרוסקופ פלואורסצנטי.
  3. לחלופין, לבצע חסימת כלי על ידי הזרקה לוריד זנב של 100 μl 2% צבע הכחול אוונס ב 4 שעות לאחר עלבון תי.
    1. להרדים את העכברים ובמהירות לחתוך את הראש כדי להסיר את המוח לתוך 4 paraformaldehyde% לאחר הזרקה הכחולה אוונס. הערה: זה לוקח 5-10 דקות למחזור כחול אוונס עם צבע כחול של שני קדמיים ואחורי גפיים.
    2. Sectiעל מוח הקבוע ב 100 עובי מיקרומטר באמצעות microtome הזזה ולבחון את הקרינה באמצעות מסנן פליטה 680 ננומטר במיקרוסקופ פלואורסצנטי.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

הדמיה ניגוד רבב לייזר דו-ממדית (LSCI) 16 שימשה כדי להשוות את השינויים בזרימת דם במוח (CBF) על ידי חסימת 30 דקות חולפות תרדמה חד-צדדית (tCCAO), חשיפת 30 דקות להיפוקסיה (חמצן 7.5%), ו -30 דקות חד-צדדית תרדמה קשירה תחת היפוקסיה (תי). ניסוי זה גילה כי tCCAO תחת normoxia דיכא את CBF על חצי הכדור ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

שבץ הוא בעיה בריאותית משמעותית של גידול משמעות לכל חברה עם אוכלוסייה מזדקנת. בעולם, שבץ הוא הגורם מוביל השני של מוות עם 5.9 מיליון אירועים משוערים קטלניים בשנת 2010, שווה ערך ל 11.1% מכל מקרי המוות 18. שבץ הוא גם הגורם מוביל השלישי של שנות חיים מותאמות לנכות (DALYs) איבד בר?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

None.

Acknowledgements

This study was supported by the NIH grant NS074559 (to C. K.). We thank all collaborators who contributed to our research articles that the present methodology report is based upon.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
adult male miceCharles RiverC57BL/6 10-13 weeks old (22-30 g)
Mobile Laboratory Animal Anesthesia SystemVetEquip901807anesthesia
Medical air (Compressed) air tankAirgasUN1002anesthesia
IsofluranePiramal HealthcareNDC 66794-013-25anesthesia
Multi-Station Lab Animal AnesthesiaSystemSurgivetV703501hypoxia system
7.5% O2 balanced by 92.5% N2 tankAirgasUN1956hypoxia system
Temperature Controller with heating lamp Cole Parmer EW-89000-10temperature controllers
Rectal probeCole Parmer NCI-00141PGtemperature controllers
Dissecting microscope Olympus SZ40surgical setup
Heat pump with warming padGaymar TP700surgical setup
Fine curved forceps (serrated)FST11370-31surgical instrument
Fine curved forceps (smooth)FST11373-12surgical instrument
micro scissorsFST15000-03surgical instrument
micro needle holdersFST12060-01surgical instrument
Halsted-Mosquito hemostatsFST13008-12surgical instrument
5-0 silk suture Harvard Apparatus624143surgical supplies
4-0 Nylon monofilament sutureLOOK766Bsurgical supplies
Tissue glueAbbott LaboratoriesNC9855218surgical supplies
Puralube Vet ointmentFisherNC0138063 eye dryness prevention 
MoorFLPI-2 blood flow imagerMoor780-nm laser sourceLaser Speckle Contrast Imaging
MannitolSigmaM4125in vivo TTC
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) SigmaT8877in vivo TTC
VibratomeStoelting51425brain section for in vivo TTC 
Digital microscopeDino-LiteAM2111whole-brain imaging
O.C.T compoundSakura Finetek4583
goat anti-rabbit Alexa Fluro 488InvitrogenA11008Immunohistochemistry
CryostatVibratomeultrapro 5000brain section for IHC
Evans blueSigmaE2129Detecting vascular perfusion
MicrotomeElectron Microscopy Sciences5000brain section for histology
Avertin (2, 2, 2-Tribromoethanol)SigmaT48402euthanasia
Fluorescent microscopeOlympusDP73
Meloxicam SRZooPharmNSAID analgesia

References

  1. Broderick, J. P., Hacke, W. Treatment of acute ischemic stroke: Part I: recanalization strategies. Circulation. 106 (12), 1563-1569 (2002).
  2. Hossmann, K. A. Pathophysiological basis of translational stroke research. Folia Neuropathol. 47 (3), 213-227 (2009).
  3. Hossmann, K. A. The two pathophysiologies of focal brain ischemia: implications for translational stroke research. J. Cereb. Blood Flow Metab. 32 (7), 1310-1316 (2012).
  4. Macrae, I. M. Preclinical stroke research--advantages and disadvantages of the most common rodent models of focal ischaemia. Br. J. Pharmacol. 164 (4), 1062-1078 (2011).
  5. Niessen, F., Hilger, T., Hoehn, M., Hossmann, K. A. Differences in clot preparation determine outcome of recombinant tissue plasminogen activator treatment in experimental thromboembolic stroke. Stroke. 34 (8), 2019-2024 (2003).
  6. Orset, C., et al. Mouse model of in situ thromboembolic stroke and reperfusion. Stroke. 38 (10), 2771-2778 (2007).
  7. Watson, B. D., Dietrich, W. D., Prado, R., Ginsberg, M. D. Argon laser-induced arterial photothrombosis. Characterization and possible application to therapy of arteriovenous malformations. J. Neurosurgery. 66 (5), 748-754 (1987).
  8. Sun, Y. Y., et al. Synergy of combined tPA-edaravone therapy in experimental thrombotic stroke. PLoS One. 9, e98807(2014).
  9. Levine, S. Anoxic-ischemic encephalopathy in rats. Am. J. Pathol. 36, 1-17 (1960).
  10. Rice, J. E. 3rd, Vannucci, R. C., Brierley, J. B. The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat. Annals Neurol. 9 (2), 131-141 (1981).
  11. Vannucci, S. J., et al. Experimental stroke in the female diabetic, db/db, mouse. J. Cereb. Blood Flow Metab. 21 (2), 52-60 (2001).
  12. Adhami, F., et al. Cerebral ischemia-hypoxia induces intravascular coagulation and autophagy. Am. J. Pathol. 169 (2), 566-583 (2006).
  13. Shereen, A., et al. Ex vivo diffusion tensor imaging and neuropathological correlation in a murine model of hypoxia-ischemia-induced thrombotic stroke. J. Cereb. Blood Flow Metab. 31 (4), 1155-1169 (2011).
  14. Michaud, J. P., Pimentel-Coelho, P. M., Tremblay, Y., Rivest, S. The impact of Ly6C low monocytes after cerebral hypoxia-ischemia in adult mice. J. Cereb. Blood Flow Metab. 34 (7), e1-e9 (2014).
  15. Zoppo, G. J. Virchow's triad: the vascular basis of cerebral injury. Rev. Neurol. Dis. 5, 12-21 (2008).
  16. Dunn, A. K. Laser speckle contrast imaging of cerebral blood flow. Annals Biomed. Eng. 40 (2), 367-377 (2012).
  17. Sun, Y. Y., Yang, D., Kuan, C. Y. Mannitol-facilitated perfusion staining with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) for detection of experimental cerebral infarction and biochemical analysis. J. Neurosci. Methods. 203 (1), 122-129 (2012).
  18. Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2010).
  19. Murray, C. J., et al. Disability-adjusted life years (DALYs) for 291 diseases and injuries in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet. 380 (9859), 2197-2223 (2012).
  20. Dirnagl, U., Macleod, M. R. Stroke research at a road block: the streets from adversity should be paved with meta-analysis and good laboratory practice. Br. J. Pharm. 157 (7), 1154-1156 (2009).
  21. Dirnagl, U., et al. A concerted appeal for international cooperation in preclinical stroke research. Stroke. 44 (6), 1754-1760 (2013).
  22. Khatri, P., et al. Revascularization end points in stroke interventional trials: recanalization versus reperfusion in IMS-I. Stroke. 36 (11), 2400-2403 (2005).
  23. Rosenberg, R. D., Aird, W. C. Vascular-bed--specific hemostasis and hypercoagulable states. New Eng. J. Med. 340 (20), 1555-1564 (1999).
  24. Majid, A., et al. Differences in vulnerability to permanent focal cerebral ischemia among 3 common mouse strains. Stroke. 31 (11), 2707-2714 (2000).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

102activator plasminogen tPAVirchowEdaravonereperfusion

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved