Um Modelo de acidente vascular cerebral trombótico Baseado em Transient isquemia-hipoxia cerebral

Resumo

Thromboembolic stroke models are vital tools for optimizing the recanalization therapy. Here we report a murine thrombotic stroke model based on transient cerebral hypoxic-ischemic (tHI) insult, which triggers thrombosis and infarction, and responds favorably to tissue plasminogen activator (tPA)-mediated fibrinolysis in a therapeutic window similar to those in stroke patients.

Resumo

Pesquisa derrame tem sofrido muitos contratempos em traduzir terapias neuroprotetoras para a prática clínica. Em contraste, a terapia do mundo real (tPA trombólise) raramente produz benefícios em modelos experimentais à base de oclusão mecânica, os quais dominam a investigação pré-clínica acidente vascular cerebral. Esta divisão entre o banco e cabeceira sugere a necessidade de empregar modelos tPA-responsivos em pesquisa pré-clínica acidente vascular cerebral. Para este fim, um modelo de acidente vascular cerebral trombótico simples e de tPA-reactivo é inventado e descrito aqui. Este modelo consiste de oclusão transiente da artéria carótida comum unilateral e entrega de 7,5% de oxigénio através de uma máscara facial em ratos adultos, durante 30 min, enquanto se mantinha a temperatura rectal dos animais a 37,5 ± 0,5 ° C. A ligadura reversível da artéria carótida unilateral ou hipóxia cada suprimido o fluxo sanguíneo cerebral apenas transitoriamente, a combinação de ambos os insultos causada duradoura défices de reperfusão, a fibrina e a deposição de plaquetas, e grande INFARCT no território fornecido pelo artéria cerebral média. Importante, a injecção de tPA recombinante a 0,5, 1, ou 4 h pós-THI (10 mg / kg) da veia da cauda proporcionou uma redução tempo-dependente do tamanho do enfarte e mortalidade. Este novo modelo de acidente vascular cerebral é simples e pode ser padronizado em laboratórios para comparar os resultados experimentais. Além disso, induz a trombose sem craniectomia ou a introdução de êmbolos pré-formadas. Tendo em conta estes méritos exclusivos, o modelo Thi é uma adição útil para o repertório de pesquisa do curso pré-clínico.

Introdução

Trombólise e recanalização é a terapia mais eficaz de AVC isquêmico agudo na prática clínica ^1. No entanto, a maioria da investigação pré-clínica foi realizada a neuroprotecção num modelo transiente mecânico obstrução (oclusão da artéria cerebral média sutura intraluminal) que produz uma recuperação rápida de fluxo sanguíneo cerebral após a remoção da oclusão vascular e mostra pouca ou nenhuma benefícios por tPA trombólise. Tem sido sugerido que a escolha duvidosa de modelos de acidente vascular cerebral contribui, pelo menos em parte, da dificuldade em traduzir terapia neuroprotectora para pacientes ^2,3. Assim, há um crescente apelo para o emprego de modelos de AVC tromboembólica tPA-responsivos em pesquisa pré-clínica, mas tais modelos também têm problemas técnicos (ver Discussão) ^4-7. Aqui nós descrevemos um novo modelo de acidente vascular cerebral trombótico com base em (ITU) insulto hipóxico-isquêmica transitória unilateral e suas respostas à terapia tPA intravenosa ^8.

O modelo de acidente vascular cerebral Thi foi desenvolvido com base no procedimento de Levine (ligadura permanente da artéria carótida comum unilateral seguida por exposição a hipoxia transitória numa câmara) que foi inventado para experiências com ratos adultos em 1960 ^9. O procedimento Levine inicial desapareceu na obscuridade porque ele só produziu danos cerebrais variável, mas o mesmo insulto causado neuropatologia consistente em filhotes de roedores quando foi re-introduzido por Robert Vannucci e seus colegas como um modelo de neonatal encefalopatia hipóxico-isquêmica (HIE) em 1981 ^10. Nos últimos anos, alguns investigadores re-adaptado ao modelo Levine-Vannucci para ratinhos adultos por ajustamento da temperatura na câmara hipóxica ^11. É plausível que as lesões cerebrais inconsistentes no procedimento Levine original pode surgir a partir de temperaturas flutuantes do corpo de roedores adultos na câmara hipóxica. Para testar esta hipótese, nós modificamos o procedimento Levine pela administração de gás hipóxicoatravés de uma máscara facial, enquanto se mantinha a temperatura interna a 37 ° roedor C na mesa cirúrgica ^12. Como esperado, o controlo rigoroso da temperatura corporal aumentou significativamente a reprodutibilidade da patologia cerebral induzida por HI. O insulto HI também provoca a coagulação, a autofagia, e grisalhos e branco-matéria lesão ^13. Outros pesquisadores também usaram o modelo HI para investigar pós-AVC respostas inflamatórias ^14.

Uma característica única do modelo de acidente vascular cerebral HI é que ele segue de perto tríade de Virchow de formação de trombos, incluindo a estase do fluxo de sangue, lesão endotelial (por exemplo, devido ao estresse oxidativo induzido por HI), e hipercoagulabilidade (ativação plaquetária induzida pelo HI) ( Figura 1A) ^15. Como tal, o modelo HI pode capturar alguns mecanismos fisiopatológicos relevantes para AVC isquêmico no mundo real. Com esta ideia em mente, nós refinou ainda mais o modelo HI com ligadura reversível da ONUartéria carótida comum ilateral (portanto, para criar um insulto HI transitória), e testou suas respostas ao tPA trombólise com ou sem edaravona. Edaravona é um captador de radicais livres já aprovado no Japão para tratar AVC isquêmico dentro de 24 horas do início ^9. As nossas experiências mostraram que tão breve quanto 30 min transiente HI desencadeia enfarte trombótico, e que o tratamento com tPA-edaravona combinada confere benefícios sinérgicos ^8. Aqui nós descrevemos os procedimentos cirúrgicos detalhadas e considerações metodológicas do modelo Thi, que podem ser utilizados para otimizar tratamentos reperfusão de AVC isquêmico agudo.

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Protocolo

Este protocolo é aprovado pelo cuidado e uso Comitê Institucional Animal (IACUC) da Universidade de Emory e segue os Institutos Nacionais de Saúde Guia para Cuidados e Uso de Animais de Laboratório.

1. Setup

1. Prepare o leito cirúrgico na almofada de aquecimento ligado com bomba de calor a 37 ° C durante pelo menos 15 minutos antes da cirurgia. Coloque um rolo de pescoço usando o barril de 3 ml seringa no leito cirúrgico. Prepara-se o gás a anestesia com isoflurano a 2% em ar medicinal.
2. Prepare fórceps autoclavada, tesouras, porta-agulhas, micro pinça hemostática, cotonetes e suturas. Prepare a cola de tecido e pomada.
3. Configure o sistema de hipóxia e controladores de temperatura com lâmpada de aquecimento e sonda retal. Prepare gás hipoxia com 2% de isoflurano em 7,5% _{de O2} em relação 92,5% de _N2.
4. Uma hora antes da cirurgia, os ratos são analgesized por injecção subcutânea de uma de libertação lenta O meloxicam (4,0 mg / kg).

2. Transient-hipoxia cerebral isquemia (Figura 1B)

1. Anestesiar 10-13 semanas de idade C57BL masculino / 6 ratos pesando 22 a 30 g na câmara de indução anestésica com 3% de isoflurano até que o animal está respondendo a uma compressão de pé, e depois remover o cabelo no pescoço direita usando um barbeador eletrônico.
2. Coloque ratinhos no leito cirúrgico conectado com isoflurano a 2% em ar medicinal a um caudal de 2 L / min. Forelimbs seguros estendeu ao longo do rolo pescoço em lados usando fita adesiva médica.
3. Limpe o local da cirurgia para a incisão com betadine seguido de álcool e, em seguida, cotonetes.
4. Sob microscópio de dissecação, fazer uma incisão 0,5 centímetros direita-cervical utilizando uma pinça reta e uma tesoura micro cerca de 0,2 cm lateral da pele na linha média.
5. Utilizar um par de fórceps finos serrilhada para separar a fáscia e tecido para expor a artéria carótida comum direita (RCCA). Cuidadosamente separar a RCCA do nervo vagal, usando um par de fórceps finos lisas.
6. Vivo nó dois pré-cortada 5-0 sutura de seda (destacável) na RCCA, e depois costurar a pele usando 4-0 sutura de monofilamento de nylon (Figura 1C).
7. Aplicar pomada olho em ambos os olhos para prevenir o ressecamento.
8. Transferir rapidamente os ratos a hipoxia sistema e colocá nariz e boca na máscara facial com 2% de isoflurano em 7,5% de O ₂ a uma taxa de fluxo de 0,5-1 L / min durante 30 min.
   1. Durante a hipóxia, utilizar controladores de temperatura com lâmpadas de aquecimento para controlar a temperatura rectal em 37,5 ± 0,5 ° C. Monitorar a freqüência respiratória em 80-120 ciclos / min. A manutenção da temperatura corporal acima de 37 ° C durante a hipóxia é importante para criar enfarte cerebral consistente. Frequência respiratória baixa geralmente acontece depois de 20 min hipóxia. Remova a máscara e permitir que o suprimento de ar normal se a freqüência respiratória cair abaixo de 40. Isso leva 1-2 min e não conta para a duração hipóxia 30 min.
9. Depois de hipoxia, transferircamundongos para um leito cirúrgico e liberar as duas suturas de RCCA. Fechar a ferida usando cola de tecido e, em seguida, retornar os ratos para a jaula. Excluir os animais se ambos dois nós ao vivo são inesperadamente libertado depois hipoxia.
10. Monitorar os ratos para 5-10 min para se recuperar de hipóxia e anestesia. Coloque o alimento molhado na gaiola e devolvê-lo à facilidade de cuidado animal.
    Nota: Os animais que apresentem leve a grave comportamento circular às 24 h após Thi estão correlacionados com infração cérebro. A maioria dos animais com sintomas de apreensão morrer antes do ponto de tempo de 24 horas depois de Thi.

3. Laser Speckle Contrast Imaging

Nota: Embora isso não é um processo essencial do modelo Thi, um salpico de laser sistema de imagiologia de contraste bidimensional ¹⁶ pode ser utilizado para caracterizar as alterações do fluxo sanguíneo cerebral (CBF) durante ou após a hipóxia-isquémia transiente. Para documentar as alterações da CBF sob Thi, ficha imediatamente após a step 2.6. Alternativamente, para comparar a recuperação CBF após insulto Thi, estes procedimentos podem ser realizados seguindo o passo 2.10.

1. Inserir um rato anestesiado em decúbito ventral e executar a 1 cm de comprimento incisão na linha média no couro cabeludo com o crânio exposto, mas sem abrir.
2. Monitorar CBF em ambos os hemisférios cerebrais sob um imager fluxo de sangue de acordo com o protocolo do fabricante e começar a gravar o fluxo sanguíneo cerebral imediatamente após a cirurgia CCAO (passo 2.6). Continue por 50 min.
3. Mostrar imagem CBF com unidades arbitrárias em uma paleta de 16 cores e analisar em tempo real as regiões selecionadas usando o software MoorFLPI seguindo as instruções do fabricante (Figura 2).
4. Depois de gravar a imagem CBF, feche o couro cabeludo com cola de tecido e devolver o animal para a jaula.

Administração 4. tPA

1. Injectar animais na veia da cauda com o solvente ou 10 mg / kg de tPA recombinante (220-300 &# 956; ul de 1 mg / m tPA) a 0,5, 1, 4 ou mais horas após tCCAo hipoxia (Figura 4).

5. Dano Cerebral Detecção com vários diferentes opções

Nota: Para a coleta de amostras de cérebro, eutanásia os ratos de 1, 4 ou 24 horas após Thi.

1. Execute quantificação do volume de enfarte in vivo por cloreto de 2,3,5-Trifeniltetrazólio método (TTC) em 24 horas após Thi insulto como descrito anterior. ¹⁷
   1. Injectar animais por via intraperitoneal com solução de manitol 1,4 M (~ 0,1 ml / g de peso corporal) 30 min antes da perfusão transcardial. Ratinhos perfundir transcardial com PBS, seguido por 10 ml de 2% de TTC.
   2. Remover o cérebro de animais com instrumentos cirúrgicos, depois de 10 minutos e colocar em paraformaldeído a 4% para a fixação durante a noite e em secção de 1 mm de espessura com um vibratome.
   3. Tire uma série de quatro lâminas do cérebro segmentado por microscópio digital e quantify o volume de enfarte como a razão da área de enfarte (área branca do lado direito) para a área do hemisfério não danificado, contralateral utilizando o software ImageJ.
2. Como alternativa, realizar a formação de trombose por imunofluorescência em 1 hora após Thi insulto.
   1. Congelar o cérebro fixado em composto outubro e os cérebros na seção 12 mm de espessura utilizando um criostato.
   2. Incubar as lâminas do cérebro com anticorpo de coelho anti-f ibrinogénio (1: 100) seguido de anticorpo de cabra anti-coelho Alexa Fluro 488 corante (1: 200) para observar a fluorescência num microscópio fluorescente.
3. Como alternativa, executar obstrução do vaso por injecção na veia da cauda de 100 ul 2% corante azul de Evans às 4 horas após Thi insulto.
   1. Euthanize os ratos e rapidamente cortar a cabeça para remover cérebros em paraformaldeído a 4% após injeção de azul de Evans. Nota: Demora 5-10 min para Evans azul circulação com cor azul de ambos previsão e pélvicos.
   2. Sectiem cérebros fixados a espessura de 100 um utilizando um micrótomo deslizante e observar a fluorescência usando um filtro de emissão de 680 nm num microscópio fluorescente.

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Resultados

Bidimensional imagiologia de contraste salpico do laser (LSCI) ¹⁶ foi utilizado para comparar as alterações do fluxo sanguíneo cerebral (CBF) por oclusão da carótida 30 minutos transiente unilateral (tCCAO), 30 min de exposição a hipoxia (7,5% de oxigénio), e 30 min unilateral carótida ligadura sob hipóxia (ITU). Esta experiência revelou que tCCAO sob normoxia suprimiu a CBF no hemisfério carótida ligado a ~ 50% do valor da linha de base, o qual se recuperou rapidamente para acima de 85% após a ...

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Discussão

O AVC é um importante problema de saúde de crescente importância para qualquer sociedade com o envelhecimento da população. Globalmente, o AVC é a segunda principal causa de morte com um número estimado de 5,9 milhões de eventos fatais em 2010, o equivalente a 11,1% de todas as mortes ^18. O AVC é também a terceira maior causa de anos de vida ajustados por incapacidade (DALYs) perdidos globalmente em 2010, elevando-se a partir da quinta posição em 1990 ^19. Esses dados epidemiológicos ap...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
adult male mice	Charles River	C57BL/6	10-13 weeks old (22-30 g)
Mobile Laboratory Animal Anesthesia System	VetEquip	901807	anesthesia
Medical air (Compressed) air tank	Airgas	UN1002	anesthesia
Isoflurane	Piramal Healthcare	NDC 66794-013-25	anesthesia
Multi-Station Lab Animal AnesthesiaSystem	Surgivet	V703501	hypoxia system
7.5% O2 balanced by 92.5% N2 tank	Airgas	UN1956	hypoxia system
Temperature Controller with heating lamp	Cole Parmer	EW-89000-10	temperature controllers
Rectal probe	Cole Parmer	NCI-00141PG	temperature controllers
Dissecting microscope	Olympus	SZ40	surgical setup
Heat pump with warming pad	Gaymar	TP700	surgical setup
Fine curved forceps (serrated)	FST	11370-31	surgical instrument
Fine curved forceps (smooth)	FST	11373-12	surgical instrument
micro scissors	FST	15000-03	surgical instrument
micro needle holders	FST	12060-01	surgical instrument
Halsted-Mosquito hemostats	FST	13008-12	surgical instrument
5-0 silk suture	Harvard Apparatus	624143	surgical supplies
4-0 Nylon monofilament suture	LOOK	766B	surgical supplies
Tissue glue	Abbott Laboratories	NC9855218	surgical supplies
Puralube Vet ointment	Fisher	NC0138063	eye dryness prevention
MoorFLPI-2 blood flow imager	Moor	780-nm laser source	Laser Speckle Contrast Imaging
Mannitol	Sigma	M4125	in vivo TTC
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC)	Sigma	T8877	in vivo TTC
Vibratome	Stoelting	51425	brain section for in vivo TTC
Digital microscope	Dino-Lite	AM2111	whole-brain imaging
O.C.T compound	Sakura Finetek	4583
goat anti-rabbit Alexa Fluro 488	Invitrogen	A11008	Immunohistochemistry
Cryostat	Vibratome	ultrapro 5000	brain section for IHC
Evans blue	Sigma	E2129	Detecting vascular perfusion
Microtome	Electron Microscopy Sciences	5000	brain section for histology
Avertin (2, 2, 2-Tribromoethanol)	Sigma	T48402	euthanasia
Fluorescent microscope	Olympus	DP73
Meloxicam SR	ZooPharm		NSAID analgesia