Geçici Serebral Hipoksi-iskemi Dayalı Bir Trombotik İnme Modeli

Özet

Thromboembolic stroke models are vital tools for optimizing the recanalization therapy. Here we report a murine thrombotic stroke model based on transient cerebral hypoxic-ischemic (tHI) insult, which triggers thrombosis and infarction, and responds favorably to tissue plasminogen activator (tPA)-mediated fibrinolysis in a therapeutic window similar to those in stroke patients.

Özet

İnme araştırması klinik uygulamaya nöroprotektif tedavilerin tercüme birçok aksiliklere dayandı. Buna karşılık, gerçek dünya tedavisi (tPA trombolitik) nadiren preklinik inme araştırma hakim mekanik tıkanıklığı tabanlı deneysel modellerde faydaları üretir. Tezgah ve Yatağımın arasındaki bu bölünme klinik öncesi inme araştırma tPA-duyarlı modeller istihdam ihtiyacını göstermektedir. Bu amaçla, basit ve tPA-reaktif trombotik inme modeli icat burada tarif edilmektedir. 37.5 ± 0.5 ° C 'de, hayvan, rektal sıcaklık muhafaza edilirken bu model, 30 dakika boyunca, yetişkin farelerde bir yüz maskesi vasıtasıyla tek taraflı karotis ve% 7.5 oksijen teslimat geçici oklüzyonu meydana gelir. Tek taraflı karotis arter veya hipoksi geri dönüşümlü ligasyonu her biri sadece geçici serebral kan akımı bastırılmış olsa da, her iki hakaret kombinasyonu reperfüzyon açıkları, fibrin ve trombosit birikimi ve büyük infar kalıcı nedenorta serebral arter tarafından sağlanan bölgede ct. Önemli olarak, kuyruk ven 0.5, 1, ya da 4 saat sonra-Thi (10 mg / kg) yeniden birleştirici tPA enjeksiyonunu bir ölüm oranı ve enfarkt boyutunun zamana bağımlı bir azalma sağladı. Bu yeni model, inme basit ve deney sonuçlarını karşılaştırmak için laboratuvarlar arasında standardize edilebilir. Bundan başka, bu kraniektomi ya da önceden-oluşturulmuş emboli yol açmadan tromboz indükler. Bu eşsiz yararları göz önüne alındığında, THI modeli klinik öncesi inme araştırma repertuvarına bir kullanışlı bir ektir.

Giriş

Tromboliz ve rekanalizasyonun klinik pratikte ¹ akut iskemik inme en etkili tedavidir. Oysa, klinik öncesi araştırma nöro çoğunluğu damar tıkanıklığı çıkarılması üzerine serebral kan akımının hızlı iyileşme üreten ve tPA lizisle hiçbir fayda az gösteren bir geçici mekanik tıkanıklık modeli (lümen dikiş orta serebral arter tıkanıklığı) uygulandı. Inme modelini şüpheli seçimi hastanın ^2,3 için nöro-koruyucu tedavisi çeviri zorluk, en azından kısmen, katkıda bulunduğu öne sürülmüştür. Bu nedenle, klinik öncesi araştırma tPA duyarlı tromboembolik inme modelleri istihdam için artan bir çağrı var, ama bu tür modelleri de teknik sorunlar (Tartışma) ^4-7 var. Burada tek taraflı geçici hipoksik-iskemik (ti) hakaret ve intravenöz tPA tedavisine ⁸ yanıtları dayalı yeni bir trombotik inme modeli açıklar.

Thi inme modeli 1960 ⁹ yetişkin sıçan deneyleri için icat edilmiştir Levine prosedürü (bir odasında geçici hipoksi maruz kalma ve ardından tek taraflı karotis arter kalıcı ligasyonu) dayalı olarak geliştirilmiştir. Orijinal Levine prosedürü karanlığa gömüldüğü, çünkü sadece değişken beyin hasarı üretti, fakat 1981 ¹⁰ neonatal hipoksik-iskemik ensefalopati (HİE) bir model olarak Robert Vannucci ve arkadaşları tarafından yeniden tanıtıldı aynı hakaret kemirgen yavrular tutarlı nevropatolojisi neden oldu. Son yıllarda, bazı Araştırmacılar hipoksik odasına ¹¹ sıcaklığı ayarlayarak yetişkin farelere Levine-Vannucci modeli adapte yeniden. Orijinal Levine prosedüründe tutarsız beyin lezyonları hipoksik odasında yetişkin kemirgenler vücut sıcaklıklarını dalgalanan doğabilecek düşünülebilir. Bu hipotezi test etmek için, hipoksik gaz verilerek Levine prosedürünü modifiyeBir yüz maskesi vasıtasıyla, ameliyat masasına ^12, 37 ° C'de, kemirgen temel sıcaklık muhafaza edilirken. Beklendiği gibi, katı vücut ısısı kontrolü büyük ölçüde HI-kaynaklı beyin patolojisi tekrarlanabilirliği artmıştır. HI hakaret de pıhtılaşmayı, Otofaji ve gri-beyaz-madde hasarı ¹³ tetikler. Diğer araştırmacılar da inme sonrası inflamatuar yanıtlar ¹⁴ araştırmak için HI modeli kullandık.

HI inme modelinin benzersiz bir özelliği de yakından kan akımı, endotel hasarı (örn nedeniyle HI-kaynaklı oksidatif strese) ve hiperkoagübilite (HI-indüklenen platelet aktivasyonu) staz dahil trombüs oluşumu Virchow'un üçlü, (aşağıda olduğunu Şekil 1A) ^15. Bu nedenle, HI modeli gerçek dünya iskemik inme ile ilgili bazı patofizyolojik mekanizmaları yakalayabilir. Bu düşünceyle, biz daha un tersine çevrilebilir ligasyonu ile HI modeli rafineilateral karotis arter (dolayısıyla geçici HI hakaret oluşturmak için), ve ya Edaravone olmadan tPA trombolitik onun yanıtları test edilmiştir. Edaravone zaten başlangıç ^​​9 24 saat içinde iskemik inme tedavisinde Japonya'da onaylanmış serbest radikal temizleyicisidir. Bizim deneyler kadar kısa 30 dakika kadar geçici HI trombotik enfarktüs tetikler gösterdi ve bu kombine tPA-Edaravone tedavi sinerjik faydalar ⁸ bahşeder. Burada detaylı cerrahi girişimler ve akut iskemik inme reperfüzyon tedavileri optimize etmek için kullanılabilecek Thi modelinin metodolojik hususlar, açıklar.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Bu protokol Emory Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış ve Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Sağlık Talimatı'nın Ulusal Enstitüleri izler.

1. Kur

1. Ameliyat öncesi en az 15 dakika süreyle 37 ° C'de ısı pompası ile bağlantılı ısınma pad cerrahi yatak hazırlayın. Cerrahi yatakta 3 ml şırınga varil kullanarak boyun rulo yerleştirin. Tıbbi havada% 2 izofluran ile anestezi gazı hazırlayın.
2. Otoklavlanmış forseps, makas, iğne mikro sahipleri, hemostat, pamuklu ve sütür hazırlayın. Doku yapıştırıcısı ve göz merhemi hazırlayın.
3. Isıtma lambası ve rektal prob ile hipoksi sistemi ve sıcaklık kontrol ayarlayın. % 92.5 N ₂ göre dengeli 7.5% O _2% 2 izofluran ile hipoksi gazı hazırlayın.
4. Bir saat ameliyattan önce, fareler yavaş salınım Meloksikam (4.0 mg / kg) deri altından enjeksiyonu ile analgesized edilir.

2. Geçici Serebral Hipoksi-iskemi (Şekil 1B)

1. 10-13 haftalık erkek C57BL anestezisi / hayvan ayak sıkmak yanıt vermeyen ve daha sonra bir elektronik tıraş makinesi kullanarak doğru boyun saç kaldırmak kadar% 3 izofluran ile anestezi indüksiyon odasında 22 ila 30 g ağırlığındaki 6 fareleri.
2. 2 litre / dakika akış hızında, tıbbi hava içinde% 2 izofluran ile bağlantılı cerrahi yatak fareler yerleştirin. Güvenli ön ayakları tıbbi bant kullanarak yanlarda boyun rulo boyunca uzanmış.
3. Alkol ve daha sonra pamuklu tarafından takip betadin kesi cerrahi siteyi temizleyin.
4. Diseksiyon mikroskop altında düz bir forseps ve yaklaşık 0.2 cm orta hat cilt yanal mikro makas kullanarak 0.5 cm sağ servikal kesi yapmak.
5. Sağ karotis arter (RCCA) maruz fasya ve doku dışında çekin ince dişli forseps bir çift kullanın. Dikkatle ince yumuşak forseps bir çift kullanarak vagus sinirden RCCA ayrı.
6. Canlı RCCA üzerinde (serbestleştirilebilen) iki precut 5-0 ipek sütür düğüm, sonra 4-0 Naylon monofilament sütür (Şekil 1C) kullanarak cilt dikmek.
7. Kuruluğunu önlemek için her iki göze göz merhemi sürün.
8. Hızla hipoksi sistemine fareler aktarmak ve 30 dakika boyunca / 0.5-1 L akış hızında% 7.5% 2 izofluran ile yüz maskesi olarak min O ₂ burun ve ağız koydu.
   1. Hipoksi sırasında, 37.5 ± 0.5 ° C'de rektal sıcaklığı kontrol etmek için ısıtma lambalı sıcaklık kontrolörleri kullanın. / Dk 80-120 nefesler solunum hızını izleyin. hipoksi sırasında 37 ° C'nin üzerinde vücut ısısı bakım tutarlı beyin enfarktüsü oluşturmak için önemlidir. Düşük solunum hızı genellikle 20 dakika hipoksi sonra olur. Yüz maskesi çıkarın ve solunum hızı Bu 1-2 dakika sürer ve 30 dakika hipoksi süresi içine sayılmaz 40'a altına düşerse, normal hava girişini sağlar.
9. Hipoksi sonra, aktarmakcerrahi yatağa fareler ve RCCA iki sütür serbest bırakın. Kafesine fareler dönün doku yapıştırıcı kullanarak yara kapatın ve. İki canlı knot hem beklenmedik hipoksi sonra yayımlanan ise hayvanların dışla.
10. Hipoksi ve anestezi kurtarmak için 5-10 dakika boyunca fareler izleyin. Kafeste ıslanan yiyecek koyun ve hayvan bakım tesisi iade.
    Not: Thi 24 saat sonra şiddetli çizerek davranışı hafif gösteren hayvanlar beyin kural ihlali ile ilişkilidir. Nöbet semptomları olan çoğu hayvanlar THI sonra 24 saat timepoint gelmeden ölmektedir.

3. Lazer Benek Kontrast Görüntüleme

Not: Bu thi modelin önemli bir işlem değildir, ancak, iki boyutlu bir lazer benek kontrast görüntüleme sistemi ¹⁶ içinde ya da geçici hipoksi-iskemi sonrası beyin kan akışının (CBF) değişiklikleri karakterize etmek için kullanılabilir. St hemen sonra, THI altında rekor CBF değişiklikler belgelemek içinep 2.6. Alternatif olarak, bu işlemler adım 2.10 Aşağıdaki yapılabilir, THI hakaret sonra CBF kurtarma karşılaştırmak.

1. Yüzüstü pozisyonda bir anestezi fare yerleştirin ve maruz ancak açılmamış kafatası ile saçlı deride 1 cm uzunluğunda orta hat kesi yapmak.
2. Üreticinin protokolüne göre bir kan akışı görüntüleyici altında hem serebral hemisferde CBF Monitör ve CCAO cerrahisi (adım 2.6) hemen sonra serebral kan akımını kaydetmeye başlayın. 50 dakika devam edin.
3. 16 renk paleti keyfi birimleri ile CBF görüntüyü göstermek ve gerçek zamanlı olarak analiz üreticinin talimatlarına (Şekil 2) Aşağıdaki MoorFLPI yazılımını kullanarak seçilen bölgeler.
4. CBF görüntüyü kaydettikten sonra, doku yapıştırıcısı ile kafa derisi kapatın ve kafesine hayvan dönün.

4. tPA İdaresi

1. (220-300 ve kg yeniden birleştirici tPA / çözücü ya da 10 mg kuyruk damarından hayvanların enjekte956. 1 mg / m tPA) l, 0.5, 1 ya da tCCAo artı hipoksi sonra 4 saat sonra (Şekil 4).

Birkaç Farklı Seçenekleri ile 5. Brain Damage Algılama

Beyin örnekleri toplamak için Thi sonra 1, 4 veya 24 saatte fareler euthanize: Not.

1. Açıklanan önceki olarak Thi hakaret sonra 24 saat in vivo 2,3,5-Triphenyltetrazolium klorür enfarktüs hacminin ölçümü yapın (TTC) yöntemi. ¹⁷
   1. İntraperitoneal 1.4 M mannitol çözeltisi (~ 0.1 ml / g vücut ağırlığı) transcardial perfüzyon 30 dakika önce hayvanlara enjekte edilir. PBS ile perfüze Transcardial farenin% 2 TTC 10 ml eklenmiştir.
   2. 10 dakika sonra, cerrahi aletler ile hayvanların beyin çıkarın ve bir vibratome 1 mm kalınlığında içine gece boyunca tespit ve bölüm için% 4 paraformaldehid içine koyun.
   3. Dijital mikroskop ve kuvantı dört kesitli beyin slaytlar bir dizi çekinImageJ yazılımı kullanarak hasarsız, kontralateral yarımkürenin alanına enfarkte alana (sağ tarafta beyaz alan) oranı olarak enfarktüs hacmini ify.
2. Alternatif olarak, THI hakaret sonra 1 saat sonra immünofloresans ile tromboz oluşumunu gerçekleştirin.
   1. Ekim bileşik ve bölüm bir Kriyostat kullanılarak 12 mikron kalınlığında beyinleri sabit beyin dondurun.
   2. Bir floresan mikroskop üzerinde floresan gözlemlemek için: keçi anti-tavşan Alexa Floro 488 boya (200 1) ile: (1: 100), aşağıdaki tavşan anti-fibrinojen antikor ile beyin slayt inkübe edin.
3. Alternatif olarak, thi akıntıdan sonra 4 saat sonra, 100 ul% 2 Evans mavi boya kuyruk damarı enjeksiyonu ile damar tıkanıklığı gerçekleştirin.
   1. Evans mavisi enjeksiyondan sonra% 4 paraformaldehid içine beyinleri kaldırmak için başını kesip hızla fareler Euthanize ve. Not: Hem fotoğrafların ön mavi renk ile Evans mavisi dolaşım için 5-10 dakika sürer ve bacaklarda gerisinde kalınmıştır.
   2. Secti100 mikron kalınlığında sabit beyinleri üzerinde kayan bir mikrotom kullanılarak ve bir floresan mikroskop üzerinde 680 nm emisyon filtre kullanarak floresan gözlemleyin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

İki boyutlu lazer benek kontrast görüntüleme (LSCI) ¹⁶ 30 dk geçici tek taraflı karotis tıkanıklığı (tCCAO), hipoksi 30 dakika maruz kalma (% 7.5 oksijen) ve 30 dakika tek taraflı serebral kan akımı (CBF) ve değişiklikleri karşılaştırmak için kullanıldı hipoksi (ti) altında ligasyonu karotis. Bu deney tCCAO normoxia altında karotis bağlandı yarımkürede CBF bastırılmış ortaya için ~ hızla karotis tıkanıklığı (Şekil 2A R) yayımlandıktan sonra 85 üzeri...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

İnme bir yaşlanma nüfusa sahip herhangi bir toplum için önemi giderek artan önemli bir sağlık sorunudur. Küresel olarak, inme, tüm ölümlerin ^18% 11,1 eşdeğer 2010 yılında tahmini 5,9 milyon ölümcül olaylar ile ikinci ölüm önde gelen nedenidir. İnme da sakatlığa ayarlanmış yaşam yıllık üçüncü önde gelen nedenidir (DALY) ^{1990, 19} beşinci pozisyona yükselen, 2010 yılında küresel kaybetti. Bu epidemiyolojik veriler akut (iskemik) inme daha etkili tedavilerin ihti...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
adult male mice	Charles River	C57BL/6	10-13 weeks old (22-30 g)
Mobile Laboratory Animal Anesthesia System	VetEquip	901807	anesthesia
Medical air (Compressed) air tank	Airgas	UN1002	anesthesia
Isoflurane	Piramal Healthcare	NDC 66794-013-25	anesthesia
Multi-Station Lab Animal AnesthesiaSystem	Surgivet	V703501	hypoxia system
7.5% O2 balanced by 92.5% N2 tank	Airgas	UN1956	hypoxia system
Temperature Controller with heating lamp	Cole Parmer	EW-89000-10	temperature controllers
Rectal probe	Cole Parmer	NCI-00141PG	temperature controllers
Dissecting microscope	Olympus	SZ40	surgical setup
Heat pump with warming pad	Gaymar	TP700	surgical setup
Fine curved forceps (serrated)	FST	11370-31	surgical instrument
Fine curved forceps (smooth)	FST	11373-12	surgical instrument
micro scissors	FST	15000-03	surgical instrument
micro needle holders	FST	12060-01	surgical instrument
Halsted-Mosquito hemostats	FST	13008-12	surgical instrument
5-0 silk suture	Harvard Apparatus	624143	surgical supplies
4-0 Nylon monofilament suture	LOOK	766B	surgical supplies
Tissue glue	Abbott Laboratories	NC9855218	surgical supplies
Puralube Vet ointment	Fisher	NC0138063	eye dryness prevention
MoorFLPI-2 blood flow imager	Moor	780-nm laser source	Laser Speckle Contrast Imaging
Mannitol	Sigma	M4125	in vivo TTC
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC)	Sigma	T8877	in vivo TTC
Vibratome	Stoelting	51425	brain section for in vivo TTC
Digital microscope	Dino-Lite	AM2111	whole-brain imaging
O.C.T compound	Sakura Finetek	4583
goat anti-rabbit Alexa Fluro 488	Invitrogen	A11008	Immunohistochemistry
Cryostat	Vibratome	ultrapro 5000	brain section for IHC
Evans blue	Sigma	E2129	Detecting vascular perfusion
Microtome	Electron Microscopy Sciences	5000	brain section for histology
Avertin (2, 2, 2-Tribromoethanol)	Sigma	T48402	euthanasia
Fluorescent microscope	Olympus	DP73
Meloxicam SR	ZooPharm		NSAID analgesia