Un modèle de course thrombotique Basé sur cérébrale transitoire hypoxie-ischémie

Résumé

Thromboembolic stroke models are vital tools for optimizing the recanalization therapy. Here we report a murine thrombotic stroke model based on transient cerebral hypoxic-ischemic (tHI) insult, which triggers thrombosis and infarction, and responds favorably to tissue plasminogen activator (tPA)-mediated fibrinolysis in a therapeutic window similar to those in stroke patients.

Résumé

la recherche de l'AVC a subi de nombreux revers dans la traduction de thérapies neuroprotectrices dans la pratique clinique. En revanche, la thérapie du monde réel (tPA thrombolyse) produit rarement des avantages dans des modèles expérimentaux basés mécaniques occlusion, qui dominent la recherche préclinique de course. Cette scission entre le banc et chevet suggère la nécessité d'employer des modèles tPA-sensibles dans la recherche préclinique de course. À cette fin, un modèle d'accident thrombotique simple et tPA-réactive est inventé et décrit ici. Ce modèle consiste en une occlusion transitoire de l'artère carotide commune unilatérale et la livraison de 7,5% d'oxygène à travers un masque de visage chez la souris adulte pour 30 min, tout en maintenant la température rectale des animaux à 37,5 ± 0,5 ° C. Bien que la ligature réversible de l'artère carotide ou une hypoxie unilatéral supprimée chaque débit sanguin cérébral seulement de manière transitoire, la combinaison des deux injurieux provoqué une durée déficits de reperfusion, de la fibrine et le dépôt de plaquettes et une grande Infarct sur le territoire de l'artère cérébrale moyenne fournie. Surtout, la queue veineuse injection de tPA recombinant à 0,5, 1 ou 4 heures post-Thi (10 mg / kg) a fourni la réduction du temps-dépendante du taux de mortalité et la taille de l'infarctus. Ce nouveau modèle de course est simple et peut être normalisée dans les laboratoires de comparer les résultats expérimentaux. De plus, il induit la thrombose ou sans introduction d'emboles craniectomy préformés. Compte tenu de ces avantages uniques, le modèle Thi est un complément utile au répertoire de recherche sur l'AVC préclinique.

Introduction

Thrombolyse et recanalisation est la thérapie la plus efficace de l'AVC ischémique aigu dans la pratique clinique ^1. Cependant, la majorité des recherches de neuroprotection préclinique a été effectuée dans un modèle transitoire mécanique d'obstruction (intraluminal suture d'occlusion de l'artère cérébrale moyenne) qui produit une récupération rapide de la circulation sanguine cérébrale après le retrait de l'occlusion vasculaire et montre peu ou pas d'avantages par tPA thrombolyse. Il a été suggéré que le choix douteux de modèles d'AVC a contribué, au moins en partie, à la difficulté de traduire la thérapie neuroprotectrice aux patients ^2,3. Par conséquent, il est une demande croissante pour l'emploi de modèles d'AVC thromboembolique tPA-sensibles dans la recherche préclinique, mais ces modèles ont aussi des problèmes techniques (voir Discussion) ^4-7. Nous décrivons ici un nouveau modèle d'accident thrombotique fondée sur hypoxique-ischémique (THI) insulte transitoire unilatérale et ses réponses à la thérapie intraveineuse tPA ^8.

Le modèle de course Thi a été développé sur la base de la procédure Levine (de ligature permanente de l'artère carotide commune unilatérale suivie d'une exposition à l'hypoxie transitoire dans une chambre) qui a été inventé pour des expériences avec des rats adultes en 1960 ^9. La procédure Levine originale tombe dans l'oubli parce il ne produit des dommages au cerveau variables, mais la même insulte causée neuropathologie cohérente chez les petits rongeurs quand il a été ré-introduit par Robert Vannucci et ses collègues comme un modèle de néonatale encéphalopathie hypoxique-ischémique (HIE) en 1981 ^10. Au cours des dernières années, certains enquêteurs ré-adapter le modèle Levine-Vannucci à des souris adultes en ajustant la température dans la chambre ¹¹ hypoxique. Il est plausible que les lésions cérébrales incompatibles dans la procédure Levine origine peuvent résulter de fluctuations de température du corps des rongeurs adultes dans la chambre hypoxique. Pour tester cette hypothèse, nous avons modifié la procédure Levine en administrant gaz hypoxiqueà travers un masque, tout en maintenant la température à coeur de rongeur à 37 ° C sur la table chirurgicale ^12. Comme on s'y attendait, le contrôle de la température du corps rigoureux considérablement augmenté la reproductibilité de la pathologie induite par HI-cérébrale. L'insulte HI déclenche également la coagulation, l'autophagie et de gris et de blessures ¹³ matière blanche. D'autres chercheurs ont également utilisé le modèle de HI pour enquêter post-AVC réponses inflammatoires ^14.

Une caractéristique unique du modèle de course de HI est qu'il suit de près la triade de l'Virchow de la formation de thrombus, y compris la stase du flux sanguin, lésions endothéliales (par exemple à cause du stress oxydatif HI-induite), et hypercoagulabilité (activation plaquettaire HI-induite) ( Figure 1A) ^15. En tant que tel, le modèle de HI peut capturer des mécanismes physiopathologiques pertinents pour AVC ischémique dans le monde réel. Avec cette idée en tête, nous avons affiné le modèle HI avec ligature réversible de l'ONUilateral artère carotide commune (donc de créer une insulte HI transitoire), et testé ses réponses aux tPA thrombolyse avec ou sans edaravone. Edaravone est un piégeur de radicaux libres déjà approuvé au Japon pour traiter l'AVC ischémique dans les 24 heures de l'apparition ^9. Nos expériences ont montré que aussi brève que 30 minutes transitoire HI déclenche myocarde thrombotique, et que le traitement combiné tPA-edaravone confère des avantages synergiques ^8. Nous décrivons ici les procédures chirurgicales détaillés et des considérations méthodologiques du modèle Thi, qui peuvent être utilisés pour optimiser les traitements de reperfusion de l'AVC ischémique aigu.

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Protocole

Ce protocole est approuvé par le Comité institutionnel de protection des animaux et l'utilisation (IACUC) de l'Université Emory et suit les Instituts nationaux de la directrice de Santé pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire.

1. Configuration

1. Préparer le lit chirurgicale sur coussin chauffant relié avec pompe à chaleur à 37 ° C pendant au moins 15 min avant la chirurgie. Placez un rouleau de cou à l'aide du canon de seringue de 3 ml sur le lit chirurgical. Préparer le gaz d'anesthésie avec 2% d'isoflurane dans l'air médical.
2. Préparer pince autoclaves, des ciseaux, porte-aiguilles, micro hémostatique, des cotons-tiges et des sutures. Préparer colle tissulaire et pommade ophtalmique.
3. Mettre en place le système de l'hypoxie et régulateurs de température avec une lampe de chauffage et sonde rectale. Préparer gaz de l'hypoxie avec 2% d'isoflurane dans 7,5% O ₂ pondérées par 92,5% de N _2.
4. Une heure avant la chirurgie, les souris sont analgesized par injection sous-cutanée d'une libération lente Meloxicam (4,0 mg / kg).

2. Cérébrale transitoire hypoxie ischémie (figure 1B)

1. Anesthésier vieille 10-13 semaines C57BL mâle / 6 souris pesant 22 à 30 g dans la chambre de l'induction de l'anesthésie avec 3% d'isoflurane avant que l'animal ne répond pas aux pieds squeeze, puis enlever les poils sur le cou droite en utilisant un rasoir électronique.
2. Placez la souris sur le lit chirurgicale reliée à 2% d'isoflurane dans l'air médical au taux de 2 L / min. Forelimbs sécurisés tendus le long rouleau de cou à l'aide de ruban adhésif médical côtés.
3. Nettoyez le site chirurgical pour incision avec de la bétadine suivie par l'alcool et puis des cotons-tiges.
4. Sous microscope à dissection, faire une incision de 0,5 cm à droite du col à l'aide d'une pince droite et un micro ciseaux environ 0,2 cm latérales de la peau de la ligne médiane.
5. Utilisez une paire de pince fine dentelées à séparer le fascia et le tissu pour exposer le droit artère carotide commune (CRAC). Soigneusement séparer le CRAC du nerf vagal en utilisant une paire de pince fine lisses.
6. Direct knot deux prédécoupé 5-0 suture de soie (amovible) sur le CRAC, puis recoudre la peau en utilisant 4-0 Nylon suture monofilament (figure 1C).
7. Appliquer une pommade oculaire des deux yeux pour prévenir la sécheresse.
8. Transférer rapidement les souris au système de l'hypoxie et de mettre le nez et la bouche en face-masque avec 2% d'isoflurane dans 7,5% d'O ₂ au taux de 0,5-1 L / min pendant 30 min.
   1. Au cours de l'hypoxie, utiliser des régulateurs de température avec des lampes de chauffage pour contrôler la température rectale à 37,5 ± 0,5 ° C. Surveiller la fréquence respiratoire à 80-120 respirations / min. Le maintien de la température du corps au-dessus de 37 ° C au cours de l'hypoxie est important de créer cohérent infarctus cérébral. Fréquence respiratoire basse arrive généralement après 20 min hypoxie. Retirez le masque de protection et de permettre l'alimentation en air normal si la fréquence respiratoire chute en dessous de 40. Cela prend 1-2 min et ne compte pas dans la durée de l'hypoxie 30 min.
9. Après l'hypoxie, transférersouris à un lit chirurgical et libérer les deux sutures du CRAC. Fermer la plaie avec de la colle de tissu, puis retourner la souris à la cage. Exclure les animaux si les deux des deux noeuds en direct sont de façon inattendue libérés après l'hypoxie.
10. Surveiller les souris pour 5-10 minutes pour se remettre de l'hypoxie et l'anesthésie. Placez les aliments mouillés dans la cage et le retourner au centre de soins aux animaux.
    Remarque: Les animaux présentant légère à sévère comportement d'approche indirecte à 24 h après Thi sont corrélés avec le cerveau infraction. La plupart des animaux présentant des symptômes épileptiques meurent avant l'timepoint 24 heures après Thi.

3. laser speckle imagerie de contraste

Note: Bien que ce soit pas une procédure essentielle du modèle Thi, une granularité laser système d'imagerie de contraste en deux dimensions ¹⁶ peut être utilisé pour caractériser les changements de débit sanguin cérébral (CBF) pendant ou après l'hypoxie-ischémie transitoire. Pour documenter les modifications de CBF sous Thi, fiche immédiatement après la stEP 2.6. Alternativement, comparer le rétablissement CBF après Thi insulte, ces procédures peuvent être effectuées après l'étape 2.10.

1. Passer une souris anesthésiée en position couchée et effectuer un 1 cm de long incision médiane sur le cuir chevelu avec le crâne impressionnés, mais non ouvert.
2. Surveiller CBF dans les deux hémisphères cérébraux sous un imageur d'écoulement du sang selon le protocole du fabricant et commencer l'enregistrement du débit sanguin cérébral immédiatement après la chirurgie de la CCAO (étape 2.6). Continuer pendant 50 min.
3. Voir l'image CBF avec des unités arbitraires dans une palette de 16 couleurs et d'analyser en temps réel les régions sélectionnées en utilisant le logiciel MoorFLPI suivant les instructions du fabricant (figure 2).
4. Après l'enregistrement de l'image CBF, fermer le cuir chevelu avec de la colle tissulaire et le réexpédier vers la cage.

4. administration du tPA

1. Injecter animaux à la veine de la queue avec le solvant ou 10 mg / kg tPA recombinant (220-300 &# 956; l de 1 mg / m tPA) à raison de 0,5, 1 ou 4 heures après, plus tCCAo hypoxie (Figure 4).

5. Brain Damage détection avec plusieurs options

Remarque: Pour recueillir des échantillons de cerveau, euthanasier les souris à 1, 4 ou 24 heures après Thi.

1. Effectuer méthode de quantification du volume de l'infarctus par in vivo chlorure de 2,3,5-triphényltétrazolium (TTC) à 24 heures après Thi insulte comme décrit précédente. ¹⁷
   1. Intrapéritonéale injecter animaux avec une solution 1,4 M de mannitol (~ 0,1 ml / g de poids corporel) 30 minutes avant la perfusion transcardial. Souris perfuser Transcardial avec PBS suivis par 10 ml de 2% TTC.
   2. Retirer le cerveau des animaux avec des instruments chirurgicaux après 10 min et la placer dans du paraformaldéhyde 4% pour la fixation pendant la nuit et dans la section 1 mm d'épaisseur avec un vibratome.
   3. Prenez une série de quatre lames de cerveau est segmenté par microscope numérique et quantitatififier le volume de l'infarctus par le rapport de la zone infarcie (zone blanche sur le côté droit) de la surface de la, hémisphère controlatéral intact à l'aide du logiciel ImageJ.
2. Sinon, effectuer la formation de thrombose par immunofluorescence à 1 h après Thi insulte.
   1. Congeler le cerveau fixe dans le composé PTOM et les cerveaux à l'article 12 um d'épaisseur à l'aide d'un cryostat.
   2. Incuber la lame de cerveau de lapin anti-anticorps de fibrinogène (1: 100) à la suite de chèvre anti-lapin Alexa 488 fluo colorant (1: 200) pour observer la fluorescence sur un microscope fluorescent.
3. Sinon, effectuez une obstruction des vaisseaux par injection dans la veine de la queue de 100 pi 2% colorant bleu Evans à 4 h après Thi insulte.
   1. Euthanasier les souris et rapidement couper la tête pour enlever le cerveau dans du paraformaldéhyde 4% après Evans injection bleu. Remarque: Il faut 5-10 min pour Evans circulation bleu avec la couleur bleue à la fois antérieurs et hind membres.
   2. Sectile cerveau fixé à 100 um d'épaisseur en utilisant un microtome à glissière et d'observer la fluorescence en utilisant un filtre d'émission de 680 nm sur un microscope fluorescent.

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Résultats

Deux dimensions contraste de granularité laser imagerie (LSCI) ¹⁶ a été utilisé pour comparer les altérations du débit sanguin cérébral (CBF) de 30 min occlusion transitoire carotide unilatérale (tCCAO), exposition de 30 min à l'hypoxie (7,5% d'oxygène), et 30 min unilatérale ligature de la carotide sous hypoxie (THI). Cette expérience a révélé que tCCAO sous la normoxie supprimée CBF sur la carotide hémisphère ligaturé à ~ 50% de la valeur de référence, qui récupère rapidemen...

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Discussion

L'AVC est un problème majeur de santé d'une importance croissante pour toute société avec un vieillissement de la population. Globalement, l'AVC est la deuxième principale cause de décès avec un taux d'environ 5,9 millions d'événements mortels en 2010, ce qui équivaut à 11,1% de tous les décès ^18. L'AVC est également la troisième cause d'années de vie ajustées sur l'incapacité (DALY) perdues dans le monde en 2010, passant de la cinquième position en 1990

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
adult male mice	Charles River	C57BL/6	10-13 weeks old (22-30 g)
Mobile Laboratory Animal Anesthesia System	VetEquip	901807	anesthesia
Medical air (Compressed) air tank	Airgas	UN1002	anesthesia
Isoflurane	Piramal Healthcare	NDC 66794-013-25	anesthesia
Multi-Station Lab Animal AnesthesiaSystem	Surgivet	V703501	hypoxia system
7.5% O2 balanced by 92.5% N2 tank	Airgas	UN1956	hypoxia system
Temperature Controller with heating lamp	Cole Parmer	EW-89000-10	temperature controllers
Rectal probe	Cole Parmer	NCI-00141PG	temperature controllers
Dissecting microscope	Olympus	SZ40	surgical setup
Heat pump with warming pad	Gaymar	TP700	surgical setup
Fine curved forceps (serrated)	FST	11370-31	surgical instrument
Fine curved forceps (smooth)	FST	11373-12	surgical instrument
micro scissors	FST	15000-03	surgical instrument
micro needle holders	FST	12060-01	surgical instrument
Halsted-Mosquito hemostats	FST	13008-12	surgical instrument
5-0 silk suture	Harvard Apparatus	624143	surgical supplies
4-0 Nylon monofilament suture	LOOK	766B	surgical supplies
Tissue glue	Abbott Laboratories	NC9855218	surgical supplies
Puralube Vet ointment	Fisher	NC0138063	eye dryness prevention
MoorFLPI-2 blood flow imager	Moor	780-nm laser source	Laser Speckle Contrast Imaging
Mannitol	Sigma	M4125	in vivo TTC
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC)	Sigma	T8877	in vivo TTC
Vibratome	Stoelting	51425	brain section for in vivo TTC
Digital microscope	Dino-Lite	AM2111	whole-brain imaging
O.C.T compound	Sakura Finetek	4583
goat anti-rabbit Alexa Fluro 488	Invitrogen	A11008	Immunohistochemistry
Cryostat	Vibratome	ultrapro 5000	brain section for IHC
Evans blue	Sigma	E2129	Detecting vascular perfusion
Microtome	Electron Microscopy Sciences	5000	brain section for histology
Avertin (2, 2, 2-Tribromoethanol)	Sigma	T48402	euthanasia
Fluorescent microscope	Olympus	DP73
Meloxicam SR	ZooPharm		NSAID analgesia