JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

גירוי עצב התועה (VNS) התפתח ככלי כדי לגרום לפלסטיות הסינפטית ממוקדת במוח הקדמי לשנות מגוון של התנהגויות. פרוטוקול זה מתאר כיצד ליישם VNS כדי להקל על האיחוד של זיכרון הכחדת פחד.

Abstract

Extinction describes the process of attenuating behavioral responses to neutral stimuli when they no longer provide the reinforcement that has been maintaining the behavior. There is close correspondence between fear and human anxiety, and therefore studies of extinction learning might provide insight into the biological nature of anxiety-related disorders such as post-traumatic stress disorder, and they might help to develop strategies to treat them. Preclinical research aims to aid extinction learning and to induce targeted plasticity in extinction circuits to consolidate the newly formed memory. Vagus nerve stimulation (VNS) is a powerful approach that provides tight temporal and circuit-specific release of neurotransmitters, resulting in modulation of neuronal networks engaged in an ongoing task. VNS enhances memory consolidation in both rats and humans, and pairing VNS with exposure to conditioned cues enhances the consolidation of extinction learning in rats. Here, we provide a detailed protocol for the preparation of custom-made parts and the surgical procedures required for VNS in rats. Using this protocol we show how VNS can facilitate the extinction of conditioned fear responses in an auditory fear conditioning task. In addition, we provide evidence that VNS modulates synaptic plasticity in the pathway between the infralimbic (IL) medial prefrontal cortex and the basolateral complex of the amygdala (BLA), which is involved in the expression and modulation of extinction memory.

Introduction

פחד התניה קלסית מספקת מודל חיה בשימוש נרחב כדי ללמוד את הבסיס הביולוגי של הפרעות חרדה. במהלך מיזוג פחד, גירוי מרתיע (הגירוי הבלתי מותנה, ארה"ב, למשל, footshock) מוצג בשיתוף עם גירוי ניטראלי, כגון טון ו / או הקשר (הגירוי המותנה; CS). במהלך מיזוג פחד, קשר בין CS וארה"ב יצר. בסופו של המצגת של CS לבד מעוררת תגובת פחד (התגובה המותנה; CR). בהכחדת פחד, CS מוצג שוב ושוב בהעדר ארה"ב, גורם לCR לצמצם 1 בהדרגה. כך, הכחדה של פחד מותנה היא תהליך פעיל שבו תגובות התנהגותיות לגירויים ניטראליים פחד הם נחלשו כאשר הם כבר לא לחזות תוצאות מרתיעה. הכחדה של תגובות מותנות דורשת איחוד של זכרונות חדשים שיתחרו עם עמותות למדו. סימן היכר של הפרעות חרדה הוא בחוסר סבלנותהכחדת ired 2-4. כך, הכחדה של פחד מותנה במודלים של בעלי חיים משמשת כפרדיגמה חשובה ללמידה מעכבת וכמודל של טיפול התנהגותי בהפרעות חרדה אנושית 5,6.

כי יש לסגור התכתבות בין הפחד וחרדה אנושית, הוא חשב כי מחקרים אלה יכולים לספק תובנה הטבע הביולוגי של הפרעות הקשורות לחרדה כגון הפרעת דחק פוסט-טראומטית ויעזרו לפתח אסטרטגיות לטיפולם. מטרה חשובה של מחקר פרה-קליני היא לסייע למידה הכחדה ולגרום לפלסטיות ממוקדת במעגלי הכחדה לאחד למידת הכחדה. גירוי עצב התועה (VNS) הוא גישה neuroprosthetic פולשנית שעשויים לשמש כדי לספק אפנון זמני ומעגל ספציפי הדוק של אזורים במוח וסינפסות עוסקת במשימה מתמשכת. סדרה של מחקרים שנעשה לאחרונה מהקבוצה של מייקל Kilgard באוניברסיטת טקסס בדאלאס יש ליהראה שהשיוך VNS עם גירויים חושיים או מוטוריים בדידים (למשל, צליל או למשוך מנוף) הוא יעיל מאוד בקידום פלסטיות בקליפת המוח לטיפול בטינטון 7, או להתגבר על גירעונות מנוע הבאים שבץ 8-10. בנוסף, שאינו מותנה VNS המתרחש בתוך זמן קצר לאחר שנודע חלון דומה מקדם פלסטיות בקליפת המוח ומשפר את גיבוש זיכרון בחולדות ובבני האדם 11-13.

בהתחשב בתפקיד של העצב התועה במסלול הפאראסימפתטית, אין זה מפתיע שזה יכול להשתתף בויסות זכרונות ופלסטיות הסינפטית. מאוד אירועים רגשיים נוטים לייצר זכרונות חזקים יותר מזכרונות הלא-רגשיים. זה כנראה עקב ההשפעה של הורמוני לחץ על גיבוש זיכרון. ממשל Posttraining של אדרנלין הורמון לחץ משפר גיבוש זיכרון בבעלי חיים אנושיים ולא אנושיים, אבל האדרנלין אינו חוצה את הדם-המוח-המחסום 14, 15 . לכן, שחרור אדרנלין מתח מושרה חייב להשפיע על המוח באופן עקיף כדי לשפר את גיבוש זיכרון. ראיות חזקות מצביעות על כך שהעצב התועה עשוי להיות הקשר בין אדרנלין במחזור והמוח. מיאשיטה ווויליאמס 16 מצאו שממשל מערכתי של אדרנלין מוגבר ירי עצב מחנק, והרמות גבוהות של נוראפינפרין באמיגדלה 17. ממשל מערכתי של אדרנלין לא לשפר את גיבוש זיכרון כאשר קולטנים β-adrenergic חסומים באמיגדלה 18 מצביעה על כך שהעצב התועה משחק תפקיד במסלול שהופך את חוויות רגשית מעוררות לזכרונות לטווח ארוך.

לפיכך, זיווג VNS עם הכשרה יש את הפוטנציאל לשפר את השינויים במוח התומכים בגיבוש זיכרון וחשיפה לרמזים מותנים בהיעדר החיזוק משפר את האיחוד של למידת הכחדה בחולדות 19,20. כאן אנו מתארים את השימוש של VNSכלי sa לקדם פלסטיות בקליפת המוח ולהקל הכחדה של תגובת פחד מותנית.

Protocol

כל ההליכים המתוארים בפרוטוקול זה מתבצעים בהתאם למדריך NIH לטיפול והשימוש בחי מעבדה, והם אושרו על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים של אוניברסיטת טקסס בדאלאס.

1. בנייה של חפתים VNS

  1. צור כלי קידוח על ידי ניסור את הקצה החד של מחט 22 G ½.
  2. הפעל את הסוף עכשיו הבוטה של ​​22 ½ מחט G על קובץ מתכת כמה פעמים כדי לשטח אותו. החזק את המחט בזווית של 45 מעלות לקובץ ולהפעיל אותו כמה פעמים את הקובץ תוך סיבובו. זה יגרום המתכת להיות רזה ולגולל פנימה. זהירות: הכנס את הקצה של האזמל לסוף החתך של המחט ולסובב עם כמה כוח כלפי מטה לפרוש המתכת.
  3. השתמש משקפת מגדלת לשלבים הנותרים בסעיף 1.
  4. באמצעות אזמל (10 או 15 להב) לחתוך 4 מגזרי מ"מ של צינורות.
  5. הנח קטע 4 מ"מ אחד מעלקצת קטן תרגיל או כלי בצורה דומה אחר. זה להחזיק את צינורות במקום בזמן שהוא מניפולציות.
  6. לקדוח 4 חורים לתוך צינורות (איור 1 א). חורים צריכים לעשות ארבע נקודות של 2 מ"מ על ידי 2 מ"מ מרובע וצריכים להיות נקי ללא קצוות מחוספס.
    הערה: כלי הקידוח צריכה להיות התחדדה מחדש (שלב 1.2) כל 2 או 3 חורים. קושי עם הצעד הזה הוא כמעט בודאות בשל כלי קידוח שאינו חד מספיק.
  7. עם צינורות עדיין במקדח, להשתמש אזמל כדי לחתוך את הצינור לאורכו בין החורים, כך ששני חורים בסופו של משני צדי החתך (איור 1).
  8. באמצעות מחט תפירה וחוט תפירה, עובר תפר דרך החורים ליצור מפרשים למיקום הסופי של השרוול סביב העצב התועה. התחל עם המחט בתוך השרוול ולהעביר אותו דרך אחד החורים, ואז לחזור דרך החור הסמוך מבחוץ (איור 1 ג). לקשור את threaד ביחד ~ 2 סנטימטר מהפלסטיק כך שהצינורות וחוטים להפוך משולש. לאפשר ~ 8 סנטימטר של חוט אחרי הקשר ולקצץ. חזור על התהליך עבור החורים בצד השני של החתך. צינורות מוכנים לקווי החברה.
  9. הכן חוטים לאזיקים.
    1. חותך חוט אירידיום פלטינה למגזרי 70 מ"מ.
    2. שימוש בטיפ הטוב ביותר עבור לפיד התכשיטים, ליצור להבה חדה עם מרכז הכחול שהיא מעודן ככל האפשר ולהשתמש בו כדי לשלול ~ 1 סנטימטר של ציפוי הפלסטיק מהתיל. החל המרכז הכחול של הלהבה לסוף הפשיט של החוט כדי ליצור כדור קטן. החל המרכז הכחול של הלהבה לכמה נקודות של החלק הפשיט הפתיל שבעה הגדילים יחד. החוט בכתמים אלו יופיע לשריטה.
    3. בקצה השני של החוט, להחיל את המרכז הכחול של הלהבה עד הסוף כדי ליצור כדור קטן. למזער הפשטת הפלסטיק בסופו של דבר זה.
  10. חוט השרוול (1D איור).
    הערה: Steנ.ב. בסעיף 1.10 חייבים להיעשות תחת משקפת מגדלת.
    1. הדבק את השרוול למטה באמצעות האשכולות כך שהוא בכיוון עם החתך אופקי לפעול. משוך את האשכולות הדוקים כל כך שהשרוול פתח ולאחר מכן קלטת את האשכולות.
    2. אחוז בסוף קפצה מהצד הופשט מהתיל מוכן עם 5 מלקחיים # ולדחוף דרך החור הימני התחתון. משוך את המלקחיים מתוך החור, עוזב את הקצה של החוט באמצע של השרוול.
    3. מחדש לתפוס את הקצה של החוט קפצה הפשיט (עכשיו באמצע של השרוול) ולדחוף אותו דרך החור הימני העליון. משוך את המלקחיים מתוך החור, עוזב את החוט עבר לחלוטין באמצעות השרוול ורופפים בצד העליון של השרוול.
    4. מחדש לתפוס את הקצה של החוט קפצה הפשיט (עכשיו מחוץ לשרוול בצד העליון) ולדחוף אותו בחזרה דרך החור הימני העליון מבפנים. תמשיך לעשות זאת עד החוט הוא מאובטח במקום: בדיקה על ידי מושך בקצה השני של החוט.
      הערה:במהלך תהליך זה הוא קריטי כדי להבדיל את החלקים החשוף / מבודדים של החוט. החוט שממוקם בסופו של דבר "השוקת" של השרוול חייב להיות חשוף, אבל כל מה שמתחת לחורים התחתון (מחוץ לשרוול בקצה התחתון) חייב להיות מבודד. זה מבטיח אספקה ​​שוטפת רק לעצב התועה.
    5. אחוז בסוף קפצה מהצד המבודד ולדחוף אותו דרך החור הימני התחתון מהחלק הפנימי של השרוול, לולאה סביבו פעם אחת.
    6. חזור על השלבים 1.10.2 - 1.10.5 בצד השמאל של השרוול, כדי ששני חוטים בסופו של קבוע לצינורות, אחד בצד ימין ואחד בצד השמאל.
    7. מניחים סיכת זהב לזרוע של עוזרת יד עם החור פונה כלפי מעלה. למלא את החור עם שטף.
    8. הלחמה הסוף מבודד של החוט (כיום מחובר לשרוול) לפינים.
    9. לאפשר ההלחמה להתקרר, ולאחר מכן להמס אותו שוב. זה מבטיח חיבור טוב בין הקצה של החוט ואניnside של הסיכה. החל יותר הלחמה במידת צורך. חזור לחוט שני.
    10. עם המוביל פועל לימין, לסמן את החלק העליון של השרוול עם סמן קבע. גם לסמן את סיכת הזהב מחוברת ליתרון השיא.

2. בניית Headcap לאתר קלט VNS

  1. לחתוך 30 קטעי מ"מ של 26 חוטי נחושת AWG. להפשיט חלק קטן בכל צד.
  2. חותך את הקצה הצר את סיכות זהב רופפות ולרתך הסוף הפשיט של החוט לסוף החתך של סיכת הזהב. ליצור שתי תרכובות חוט / סיכה לכל אתר קלט רצוי. הנח מחבר לידי עוזר ולרתך את קצה החוט של מתחם חוט / סיכה לכל אחד משתי שיני fluxed של המחבר (איור 2G).
  3. מארק אחד החוטים עם לנוכל. במהלך הניתוח, למקם את השתל עם החוט מקורי הבולט לחוט לא מסומן.

3. ניתוח VNS

  1. ליצור כלים זכוכית מותאמת אישית לטיפול בvaguעצב של במהלך ניתוח.
    1. השתמש זכוכית בורוסיליקט למשוך micropipette כך שיש לו טיפ ארוך מחודד. אם אין חולץ פיפטה זמין, לשבור את הזכוכית כדי ליצור יתרון כבר.
    2. החזק את הסוף הלא המחודד של פיפטה עם בד עבה (כדי למנוע כוויות) ולחץ על הסוף המחודד / נפרץ משטח חסין אש חלק תוך יישום להבת כחולה מלפיד התכשיטים לסוף המחודד. הזכוכית לכופף כפי שהוא נלחץ אל פני השטח. החל להבה עד וו או צורות צורת J.
  2. ניתוחי VNS
    1. לאסוף ולעקר את כל הכלים. הכן אזור סניטרי, מחומם כירורגית.
    2. להרדים חיה עם קטמין / xylazine (85 מ"ג / קילוגרם, 5mg / קילוגרם, IP). להעריך את העומק של מטוס ההרדמה על ידי ניטור הקולות של בעלי החיים ונסיגה-רפלקסים בתגובה לבוהן ו / או צביטת זנב.
    3. לגלח את הראש והצד השמאלי של הצוואר של בעל החיים. להגן על העיניים של בעלי החיים עם כורהשמן או משחה אל עין. החל פתרון יוד טיהור עם גזה ולאחר מכן אלכוהול עם גזה לאזורים המגולחים. חזור פעם אחת.
    4. להזריק 0.05 מיליליטר marcaine תת עורי בחלק העליון של ראש ולאפשר בולוס לפזר תוך שימת בעל החיים לתוך מכשיר stereotaxic.
    5. השתמש אזמל לעשות חתך בעור על הגולגולת לחשוף שתי מבדה וגבחת. הכן דרך לשרוול באמצעות מלקחיים בוטים לתת עורי מנהרה מאתר החתך באגף השמאלי מול האוזן לצד השמאלי של הצוואר.
    6. משוך את אתר החתך פתוח עם hemostats. שימוש בצמר גפן, להחיל מי חמצן לגולגולת החשופה כדי להסיר את כל רקמה שנותרה.
    7. באמצעות אזמל, לקדוח שני חורי המתנע רדודים בגולגולת למקום ברגי עוגן. הם צריכים להיות ממוקמים רחוקים מספיק זה מזה כדי לאפשר מקום לשתל, אבל לא קרוב מדי לרקמות שמסביב. הימנע הצבת ברגים ישירות על קו האמצע.
      1. עם כוחנ.ב. ומברג, לנהוג בבורג עצם לתוך שני החורים. הברגים צריכים להיות הדוקים בחורים, עם הכובעים 2 - 3 מ"מ מעל פני השטח של הגולגולת כדי לאפשר מקום לאקריליק למלא בתחת ומסביב לברגים.
    8. למלא את החלל מתחת, מסביב, ובין הברגים עם כמות קטנה של אקריליק, הימנעות הרקמה הסובבת. לאחר מכן למקם כמות גדולה יותר של אקריליק באמצע הגולגולת בין שני הברגים.
    9. תפוס את השתל כך החוט המסומן מכוון מקורי לחוט לא מסומן ומניח במהירות את השתל באקריליק, נזהר שלא לקבל אקריליק לפינים הזהב, אזור האבזם, או אתר הקלט על גבי. ממוקם ברגע שמאפשר להגדיר ~ 5 דקות עד יבש. זה יכול להיעשות גם באמצעות הזרוע של stereotaxic לתמיכה. למלא את כל סדקים או פערים בין השתל והגולגולת עם תערובת צמיגות נמוכה של אקריליק. לאפשר לו להתייבש.
    10. השתמש משקפת מגדלת לשלבים הנותרים בסעיף 3.2.
    11. הסר הבעלי חיים דואר ממכשיר stereotaxic. מניחים את החיה בצדו הימני, מסובב אותו מעט לכיוון עמדת הגחון.
    12. לעשות חתך קטן מעל כ וריד הצוואר השמאלי. עצם הלסת ועצם הבריח צריך להיות בערך במרחק שווה לאתר החתך. להרחיב את החתך באמצעות נתיחה בוטה עד שתגיע לשכבת השריר. שרירי sternomastoid, sternohyoid, וomohyoid צריכים להיות גלויים. השתמש מפשקי שרירים כדי לשמור על האתר פתוח.
    13. תמשיך לנתח בוטה לאורך התלמים הטבעיים בין השרירים. חפש הפועם של עורק התרדמה. כותרת דרך השריר כלפי הפועם תחשוף את העורק הראשי. משוך את שרירי גב עם מפשק השרירים. הנדן המכיל את העורק הראשי מכיל גם את העצב התועה. זהירות להקהות לנתח את הנדן עם המספריים.
    14. זהה את העצב התועה. זה העצב הגדול בנדן הצוואר והוא בדרך כלל לצד השמאל של החיה של העורקניתן למצוא אך בכל צד. לעבור לכלי זכוכית המותאם אישית ולהפריד את העצב התועה מהעורק הראשי. העצב צריך להיות נקי מכל רקמה אחרת לפחות 5 מ"מ.
    15. מהחתך בראש, שימוש באשכולות בצד של השרוול מול מוביל, למשוך את השרוול דרך המנהרה תת-עורי נעשתה בעבר עם מלקחיים או hemostats הקטן. לדחוף אותו דרך הרקמה לאתר החתך בצוואר.
    16. רם בעדינות את העצב של הדבר באמצעות הכלים הזכוכית ולדחוף את האשכולות בצד של השרוול מול המוביל בעצב. משוך את האשכולות לאורך כל הדרך, נזהר שלא להתחכך בעצב. השרוול צריך להיות מייד בסמוך לעצב.
    17. ודא השרוול מכוון עם הצד המסומן 'העליון' מעולה. זרוק את העצב למרכז של השרוול. העצב צריך עכשיו לשכב על שני החוטים בשוקת של השרוול (איור 2). לקשור את החוטים יחד כדי לסגור את השרוול.
    18. על headcap, לחבר את הסיכות צמודות לשרוול לפינים הזהב באתר קלט גירוי. חבר את הפין המסומן לסיכת הזהב הצמודה לשן הקדמית ביותר באתר קלט סימולציה.
    19. כדי לוודא שהשרוול מגרה את העצב התועה כראוי, לבצע הפסקת נשימת בדיקה על ידי, חיבור ממריץ לאתר קלט הגירוי בheadcap והפעלת גירוי (0.2 מילי-אמפר, 60 הרץ, עד 10 שניות). נשימה צריכה לעצור לרגע וקצב לב צריך לרדת, אימות פונקצית שרוול.
    20. אבטח את הסיכות באתר קלט הגירוי עם אקריליק. מכסה את חוטי החשמל ולוודא שסיכות וחוטים חשופים לא יובילו למעגלים קצרים. השתמש אקריליק להחליק על כל בליטות או למלא כל פערים. לאפשר לו להתייבש.
    21. תפר נסגר שני אתרי החתך. להזריק 0.05 מיליליטר marcaine מתחת לעור ליד אתר החתך בצוואר. החל משחה אנטיביוטית לחתך אתרים. לחלופין, לעזוב מחבר זכר במקום באתר קלט גירוי ללמנוע נזק או שיבוש בתהליך הריפוי.
    22. פנק עם אנטיביוטיקה ומעקב לאחר ניתוח טיפול סטנדרטי כולל שיכוך כאבים מתאימים. חזור בעלי חיים למתקן דיור בעלי חיים לאחר שהן חוזרים לניידות. הרשה 5 ימים להתאוששות. כדי להבטיח אריכות ימים מקסימליים ותפקוד של headcap, חיות בית ביחידות לשארית של הניסוי.
      הערה: חולדות שאם-VNS לעבור את אותו ניתוח, אולם המעגל נועד קצר ברמה של headcap (כלומר, headcap מושתל והעצב התועה מופרד מהעורק הראשי, אבל לא שרוול אלקטרודה ממוקם סביב עצב).

4. שמיעתי פחד אוויר

הערה: פרוטוקול אוויר הפחד הזה הוא אינטנסיבי יותר מרוב 21 משום שהמטרה של ניסויים אלה היא לשפר את ההכחדה. עם אוויר פחד קל שכיבה בקלות, השפעת רצפה יכולה לטשטש שיפור זה.

  1. בעלי חיים בבית שעות אור 12 / מחזור כהה גישה כרצונך מודעת מזון ומים עם. ידית בעלי חיים מדי יום במהלך החלמה מניתוח.
  2. להגדיר את מנגנון אוויר ובדיקות, הכולל תיבה אופרנטית שוכנו בתא-נחלש קול (איור 2 ג). יש תיבה אופרנטית קירות פלסטיק שקופים, 20 x 20 x 20 סנטימטר, ויש לו רצפת רשת פלדת אל-חלד אשר מחוברת לגנרטור הלם רגל. השתמש בית-אור לבן כדי להאיר את החדר להקלטת וידאו. השתמש kHz 9, 85 טון dB SPL כגירוי המותנה.
  3. שיא התנהגות באמצעות מצלמה דיגיטלית הממוקמת בתוך החדר, מעל לתיבה אופרנטית. לראות ולעקוב אחר הפגישה במחשב נמצא מחוץ לחדר ההתנהגות. שמור את הסרטונים לניתוח מאוחר יותר.
  4. נגב תאים עם 70% אתנול לפני ואחרי כל פגישה לחסל רמזי חוש הריח.
  5. פחד-להתנות את החולדות 2 ימים (איור 3 א). ודא שהחולדות אינן בהמזל מפחד מהטון על ידי הצגת 5 גוונים (9 kHz, 85 db, 30 שניות) ביום הראשון. ודא שרמות ההקפאה הן זניחות.
    1. בצע את מצגות טון הראשוניות עם 8 טון-footshock (1 שניות, 0.5 מילי-אמפר) זיווגים על כל אחד 2 ימים רצופים. חזור על הזיווגים הטון-footshock שוב ביום השני. להשתנות-הגירוי-המרווח בין (ISI) בין 2 ל 4 דקות, ממוצע של 3 דקות לכל משפט. באקראי הנקודה שבה ההלם מתרחש במהלך הטון.
  6. ביום השלישי, לבדוק את כוחו של איגוד טון / הלם. לשחק 4 גוונים עם ISI של 3, 4, או 5 דקות (ממוצעת דקות 4) בהעדר footshocks ולהקליט התנהגות ההקפאה של בעלי החיים במהלך מצגות הטון ובמהלך גירוי-היתר, כאמצעי המרווחים של תגובת הפחד המותנה (CFR).
  7. ביום 4, להתחיל אימון הכחדה עם VNS או שאם VNS.
    1. חבר את החולדות לממריץ ידי החדרת המחברים הזכר מstimulator לאתר קלט גירוי. בעלי חיים מקום לתוך התא (איור 2 א, 2 ג). הגדר את ממריץ ל -0.4 מילי-אמפר, רוחב פולס 500 מייקרו-שני ליום 30 בהרץ. גירוי מוגדר משך זמן כולל של 30.15 שניות, מתחיל 150 אלפיות שני לפני תחילת הטון. שחק בעלי חיים 4 גוונים (כמו בשלב 4.6) ולהתאים את כל מצגת טון עם VNS או שאם VNS.
  8. מעת לעת לבדוק את התקינות החשמלית של אתר שרוול וקלט באמצעות אוסצילוסקופ.
    1. חבר את בעלי החיים ברגילים וכלפצל את הפלט מהממריץ לאוסצילוסקופ.
    2. הגדר את הטווח על אוסצילוסקופ כ-20 V ל+20 V ולהפעיל גירוי. צורת הגל של גירוי 30 הרץ צריכה להיות גלויה על אוסצילוסקופ. גירויים עולה על 10 V בגודל מצביעים עכבה גבוהה ושרוול בצורה לא נכונה בתפקוד או בחיבור באתר קלט גירוי.
  9. כדי לבדוק את ההשפעה של VNS באימון הכחדה להפעיל מבחן CFR שני (כמו בשלב 4.6)ביום 5. שיא המשך זמן הקפאה במהלך מצגות טון ולהשוות להקפאת בסיס שנרשמה במבחן הראשון CFR (שלב 4.6).
  10. לנתח את קטעי הווידאו באמצעות משקיף עצמאי שהוא עיוור לתנאי הטיפול. למדוד את משך זמן ההקפאה במהלך מצגות טון באמצעות שעון עצר. ההקפאה מוגדרת כחוסר תנועה מוחלטת, שבמהלכו החולדה מציגה נשימה מהירה, ראשו מושפל, ולהפיץ כפות 22. ניתוח של התנהגות הקפאה ניתן לפצל לשני שלבים: במהלך מצגת טון ובמרווח בין הגירוי.

5. בVivo הקלטות של פוטנציאלים שדה עורר

הערה: שלב זה הוא אופציונאלי. פוטנציאלים עוררו שדה (EFPs) נרשמים 24 שעות לאחר בדיקות של כינון (יום 5) בחולדות מורדמת-isoflurane רכובים במנגנון stereotaxic, בעקבות הליכים סטנדרטיים 23,24.

  1. לאסוף ולעקר את כל הכלים.
  2. לגרום להרדמה עם isoflurane (5% ב 100% חמצן, 1 ליטר / דקת flowrate) בתא פלסטיק שקוף. להעריך את העומק של מטוס ההרדמה על ידי ניטור הקולות של בעלי החיים ונסיגה-רפלקסים בתגובה לבוהן ו / או צביטת זנב. השתמש בשמן מינרלים או משחת עיניים כדי להגן על עיניים.
  3. להזריק 0.05 מיליליטר marcaine תת עורי בחלק העליון של ראש ולאפשר בולוס להתפזר. השתמש אזמל וhemostats כדי להסיר את headcap מהגולגולת. להשתמש בכוח קטן ככל האפשר, כדי למנוע טשטוש גבחת.
  4. מניחים את החיה במכשיר stereotaxic. השתמש באזמל כדי להרחיב את החתך לחשוף שתי מבדה וגבחת. לשמור על מטוס הרדמה עם isoflurane (3% ב 100% חמצן, 1 ליטר / דקת flowrate) באמצעות nosecone.
  5. לקדוח חורים לתוך הגולגולת מעל קליפת המוח הקדם חזיתית infralimbic (IL) והאמיגדלה basolateral (BLA). מנמיכים microelectrodes זכוכית (2M KCl; 1-2 MOhms התנגדות) לBLA (D / V: 7.2, / P: 2.7, M / L: 4.9 מגבחת) וstimulatאלקטרודה יון לאזור IL של קליפת המוח הקדם חזיתית המדיאלי (D / V: 4.6, / P: 0.7 מגבחת: 3.0, M / L) (איור 4 א).
  6. לעורר את IL לעורר EFPs בBLA. הנתונים מוצגים באיור 4 נרכשו עם ההגדרות הבאות: דופק גירוי של 0.3 משך msec, באמצעות עוצמת גירוי שתואם 40% מעוצמת הזרם המינימלית שעוררה תגובת שדה מרבי (המבוסס על עקומת קלט פלט נקבעה לפני אוסף של נתונים בסיסיים), מועבר כל 15 שניות.
  7. לאסוף נתונים בסיסיים למינימום של 10 - 15 דקות לפני התרמה פלסטיות הסינפטית.
    הערה: הפרוטוקול המשמש כדי לעורר פלסטיות הסינפטית ישתנו עם הדרישות של הניסויים, ויש שנבחר בקפידה על ידי כל ניסוי. הנתונים באיור 4C מראה שינויים בEFP הבא 3 התפרצויות של 100 פולסים בתדר 50 הרץ (2 שניות), עם מרווחים-פרץ בין 20 שניות בעצמה הנוכחית המינימום שמעוררותהיית תגובת השדה המרבית.
  8. מדוד את משרעת של EFP כהפרש בין הממוצע של 5 אלפיות שני לפני חלון חפץ הגירוי והממוצע של חלון 5 אלפיות שני סביב 20 - 25 אלפיות שניים לאחר חפץ הגירוי, מקביל לשיא השלילי של פוטנציאל השדה. לנרמל את הנתונים לבסיס ולהגדיר את הממוצע של תחילת המחקר 10 דקות כמו 100%. השתמש באמפליטודות EFP ממוצע של עוד 10 דקות לאחר תקופת אינדוקציה פלסטיות (למשל, 40 - דקות לאחר אינדוקציה 50) כדי להעריך את השינויים לטווח ארוך במשרעת EFP.
  9. לאחר סיום ההקלטה לערוף את החיה הרדים ולחלץ את המוח. הכן רקמות לאימות היסטולוגית של מיקום האלקטרודה.

תוצאות

סעיף זה ממחיש דוגמאות של תוצאות שניתן להשיג על ידי שימוש VNS בשילוב עם למידת הכחדה כדי להפחית את הביטוי של תגובת הפחד המותנה בחולדות. במשך ימים 1 ו -2 (שמיעתי פחד אוויר), חולדות אומנו על משימת פחד אוויר שמיעתית שבfootshocks היה זיווג עם טון. ביום 3 (טיפול מבחן טרום), גוונים הוצגו ...

Discussion

אנו מציגים כאן פרוטוקול המשמש כדי להקל על הכחדה של פחד מותנה בפגישה אחת של חשיפה לרמזים מותנים 19 ולווסת פלסטיות במסלול בין קליפת infralimbic והאמיגדלה basolateral שעשוי לתווך הכחדת למידת 20. צעד חיוני להצלחה של פרוטוקול זה הוא המשלוח התקין של VNS במהלך אימון הכחדה. לכן...

Disclosures

The authors have no competing interests or conflicts.

Acknowledgements

This research was supported by the National Institute of Mental Health MH 086960-01A1 (Christa K. McIntyre).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Alcohol
AtropineFisherA0132-5G
BetadineHenry Schein69066950
Hydrogen peroxide CVS209478
KetamineHenry Schein 1129300
MarcaineHenry Schein6312615
Mineral OilCVS152355
NeosporinCVS629451
OxygenHome Depot304179
PennicillinFisherPENNA-10MU
PropaneHome Depot304182
XylazineHenry Schein4019308
Tools
Jewelery TorchSmith Equipment23-1001D
Sewing NeedleWalgreens441831
#5 Forceps (2)Fine Science Tools11254-20
Soldering IronHome Depot 203525863
AmScope SM-4TX-144A 3.5X-45X Circuit Board Boom Stereo Microscope + 144 LEDAmScopeSM-4TX-144A
Helping HandsA-M Systems 726200
Scalpel Blade HolderFine Science Tools10003-12
Metal FileHome Depot6601
RulerHome Deopt202035324
Curved Hemostats Fine Science Tools130009-12
Fine ScissorsFine Science Tools14058-09
SpatulaFine Science Tools
Small ScrewdriverHome Depot646507
Magnetic Fixator Retraction SystemFine Science Tools18200-04, 18200-01, 18200-05
Heating PadWalgreens30294
ClippersWalgreens277966
SharpieStaples125328
Ring ForcepsFine Science Tools11103-09
Custom Micropipette Glass Tools (J shape and Straight) - Borosilicate glassSutter InstrumentB150-110-10
Adson ForcepsFine Science Tools11006-12
Cuffs
TubingBraintree Scientific IncMRE-065
Platinum Iridium WireMedwire10IR9/49T
Gold PinsMill-Max1001-0-15-15-30-27-04-0
Suture ThreadHenry Schein100-5797
22 G needlesFisher 14-815-525
Paper TapeFisher 03-411-602
SolderHome Depot327793
Flux Home Depot300142
Scalpel Blade, 10 or 15Stoelting52173-10
Silastic Laboratory Tubing .51 mm ID x .94 mm ODFisher 508-002
Headcaps
Connector Pieces (male)Omnetics Connector CorporationA25001-004
Headcap pieces (female)Omnetics Connector CorporationA24001-004
Teets Dental Acrylic, Liquid and PowderA-M Systems525000, 526000
26 Gauge Solid Copper WireStaples1016882  
Surgery
Bone ScrewsStoelting+CB33:C6151457
Scalpel Blades, 10 or 15Stoelting52173-10
1 ml syringesFisher14-826-261
22 G NeedlesFisher 14-815-525
27 G NeedlesFisher14-826-48
2" x 2" GauzeFisher22-362-178
SwabsFisher19-120-472
Puppy PadsPetCo1310747
Kim WipesFisher06-666-A
Chamber and Behavioral Setting 
Husky Metal Front Base Cabinet (30WX19DX34H)Home Depot100607961
Quiet Barrier­ HD Soundproofing Material (Sheet) (PSA)soundproofcow.com10203041
Convoluted Acoustic Foam Panelsoundproofcow.com10432400
Isolated Pulse Stimulator Model 2100A-M Systems720000
Digital Camera - Logitech Webcam C210LogitechB003LVZO88
MatLabMathworks.com
Sinometer 10 MHz Single Channel OscilloscopeSinometerCQ5010C
OxyLED T-01 DIY Stick-on Anywhere 4-LED Touch Tap LightOXYLEDB00GD8OKY0
5k ohm potentiomterAlpha ElectronicsB00CTWDHIO
Extech 407730 40-to-130-Decibel Digital Sound Level MeterExtech InstrumentsB000EWY67W
DSCK-C Dual Output, scrambled shockerKinder Scientific Co

References

  1. Quirk, G. J., Mueller, D. Neural mechanisms of extinction learning and retrieval. Neuropsychopharmacol. 33 (1), 56-72 (1038).
  2. Milad, M. R., Orr, S. P., Lasko, N. B., Chang, Y., Rauch, S. L., Pitman, R. K. Presence and acquired origin of reduced recall for fear extinction in PTSD: results of a twin study. J Psychiat Res. 42 (7), 515-520 (2008).
  3. Jovanovic, T., Norrholm, S. D., Blanding, N. Q., Davis, M., Duncan, E., Bradley, B., Ressler, K. J. Impaired fear inhibition is a biomarker of PTSD but not depression. Depress Anxiety. 27 (3), 244-251 (2010).
  4. Norrholm, S. D., et al. Fear extinction in traumatized civilians with posttraumatic stress disorder: relation to symptom severity. Biol Psychiat. 69 (6), 556-563 (2011).
  5. Phelps, E. A., LeDoux, J. E. Contributions of the amygdala to emotion processing: from animal models to human behavior. Neuron. 48 (2), 175-187 (2005).
  6. Pape, H. C., Paré, D. Plastic synaptic networks of the amygdala for the acquisition, expression, and extinction of conditioned fear. Physiol Rev. 90 (2), 419-463 (2010).
  7. Engineer, N. D., et al. Reversing pathological neural activity using targeted plasticity. Nature. 470 (7332), 101-104 (2011).
  8. Porter, B. A., et al. Repeatedly pairing vagus nerve stimulation with a movement reorganizes primary motor cortex. Cereb Cortex. 22 (10), 2365-2374 (2012).
  9. Hays, S. A., et al. Vagus nerve stimulation during rehabilitative training improves functional recovery after intracerebral hemorrhage. Stroke. 45, 3097-3100 (2014).
  10. Khodaparast, N., et al. Vagus nerve stimulation delivered during motor rehabilitation improves recovery in a rat model of stroke. Neurorehab Neural Re. 28 (7), 698-706 (2014).
  11. Clark, K. B., Krahl, S. E., Smith, D. C., Jensen, R. A. Post‐training unilateral vagal stimulation enhances retention performance in the rat. Neurobiol Learn Mem. 63 (3), 213-216 (1995).
  12. Clark, K. B., Smith, D. C., Hassert, D. L., Browning, R. A., Naritoku, D. K., Jensen, R. A. Posttraining electrical stimulation of vagal afferents with concomitant vagal efferent inactivation enhances memory storage processes in the rat. Neurobiol Learn Mem. 70 (3), 364-373 (1998).
  13. Clark, K. B., Naritoku, D. K., Smith, D. C., Browning, R. A., Jensen, R. A. Enhanced recognition memory following vagus nerve stimulation in human subjects. Nat. Neurosci. 2, 94-98 (1999).
  14. McGaugh, J. L. amygdala modulates the consolidation of memories of emotionally arousing experiences. Annu Rev Neurosci. 27, 1-28 (2004).
  15. McGaugh, J. L., Roozendaal, B. Role of adrenal stress hormones in forming lasting memories in the brain. Curr Opin Neurobiol. 12, 205-210 (2002).
  16. Miyashita, T., Williams, C. L. Epinephrine administration increases neural impulses propagated along the vagus nerve: Role of peripheral beta-adrenergic receptors. Neurobiol Learn Mem. 85 (2), 116-124 (2006).
  17. Williams, C. L., Men, D., Clayton, E. C., Gold, P. E. Norephinephrine release in the amygdala after systemic injection of epinephrine or escapable footshock: contribution of the nucleus of the solitary tract. Behavioral Neurosci. 112 (6), 1414-1422 (1998).
  18. Liang, K. C., Juler, R. G., McGaugh, J. L. Modulating effects of post-training epinephrine on memory: involvement of the amygdala noradrenergic system. Brain Res. 368 (1), 125-133 (1986).
  19. Peña, D. F., Engineer, N. D., McIntyre, C. K. Rapid remission of conditioned fear expression with extinction training paired with vagus nerve stimulation. Biol Psychiat. 73 (11), 1071-1077 (2013).
  20. Peña, D. F., Childs, J. E., Willett, S., Vital, A., McIntyre, C. K., Kroener, S. Vagus nerve stimulation enhances extinction of conditioned fear and modulates plasticity in the pathway from the ventromedial prefrontal cortex to the amygdala. Front Behav Neurosci. 8 (327), (2014).
  21. Maren, S. Overtraining does not mitigate contextual fear conditioning deficits produced by neurotoxic lesions of the basolateral amygdala. J Neurosci. 18 (8), 3088-3097 (1998).
  22. Blanchard, R. J., Blanchard, D. C. Crouching as an index of fear. J Comp Physiol Psych. 67 (3), 370-375 (1969).
  23. Maroun, M. Stress reverses plasticity in the pathway projecting from the ventromedial prefrontal cortex to the basolateral amygdala. Eur J Neurosci. 24 (10), 2917-2922 (2006).
  24. Moussawi, K., et al. N-Acetylcysteine reverses cocaine-induced metaplasticity. Nat Neurosci. 12, 182-189 (2009).
  25. Paintal, A. S. Vagal sensory receptors and their reflex effects. Physiol. Rev. 53 (1), 159-227 (1973).
  26. Aalbers, M., Vles, J., Klinkenberg, S., Hoogland, G., Majoie, M., Rijkers, K. Animal models for vagus nerve stimulation in epilepsy. Exp Neurol. 230 (2), 167-175 (2011).
  27. Ricardo, J. A., Koh, E. T. Anatomical evidence of direct projections from the nucleus of the solitary tract to the hypothalamus, amygdala, and other forebrain structures in the rat. Brain Res. 153, 1-26 (1978).
  28. Takigawa, M., Mogenson, G. J. A study of inputs to antidromically identified neurons of the locus coeruleus. Brain Res. 135 (2), 217-230 (1977).
  29. Groves, D. A., Bowman, E. M., Brown, V. J. Recordings from the rat locus coeruleus during acute vagal nerve stimulation in the anaesthetised rat. Neurosci Lett. 379 (3), 174-179 (2005).
  30. Manta, S., Dong, J., Debonnel, G., Blier, P. Enhancement of the function of rat serotonin and norepinephrine neurons by sustained vagus nerve stimulation. J Psychiatr Neurosci. 34 (4), 272-280 (2009).
  31. Manta, S., El Mansari, M., Debonnel, G., Blier, P. Electrophysiological and neurochemical effects of long-term vagus nerve stimulation on the rat monoaminergic systems. Int J Neuropsychoph. 16 (2), 459-470 (2013).
  32. Dorr, A. E., Debonnel, G. Effect of vagus nerve stimulation on serotonergic and noradrenergic transmission. J Pharmacol Exp Ther. 318, 890-898 (2006).
  33. Follesa, P., et al. Vagus nerve stimulation increases norepinephrine concentration and the gene expression of BDNF and bFGF in the rat brain. Brain Res. 1179 (7), 28-34 (2007).
  34. Biggio, F., et al. Chronic vagus nerve stimulation induces neuronal plasticity in the rat hippocampus. Int J Neuropsychoph. 12 (9), 1209-1221 (1017).
  35. Nichols, J. A., Nichols, A. R., Smirnakis, S. M., Engineer, N. D., Kilgard, M. P., Atzori, M. Vagus nerve stimulation modulates cortical synchrony and excitability through the activation of muscarinic receptors. Neuroscience. 189, 207-214 (2011).
  36. Peters, J., Kalivas, P. W., Quirk, G. J. Extinction circuits for fear and addiction overlap in prefrontal cortex. Learn Memory. 16, 279-288 (2009).
  37. Ji, J., Maren, S. Hippocampal involvement in contextual modulation of fear extinction. Hippocampus. 17 (9), 749-758 (2007).
  38. Roosevelt, R. W., Smith, D. C., Clough, R. W., Jensen, R. A., Browning, R. A. Increased extracellular concentrations of norepinephrine in cortex and hippocampus following vagus nerve stimulation in the rat. Brain Res. 1119 (1), 124-132 (2006).
  39. Hassert, D. L., Miyashita, T., Williams, C. L. The effects of peripheral vagal nerve stimulation at a memory-modulating intensity on norepinephrine output in the basolateral amygdala. Behav Neurosci. 118 (1), 79-88 (2004).
  40. Ura, H., et al. Vagus nerve stimulation induced long-lasting enhancement of synaptic transmission and decreased granule cell discharge in the hippocampal dentate gyrus of urethane-anesthetized rats. Brain Res. 1492, 63-71 (2013).
  41. Zuo, Y., Smith, D. C., Jensen, R. A. Vagus nerve stimulation potentiates hippocampal LTP in freely-moving rats. Physiol Behav. 90 (4), 583-589 (2007).
  42. Shen, H., Fuchino, Y., Miyamoto, D., Nomura, H., Matsuki, N. Vagus nerve stimulation enhances perforant path-CA3 synaptic transmission via the activation of β-adrenergic receptors and the locus coeruleus. Int J Neuropsychophl. 15 (4), 523-530 (2012).
  43. Fibiger, H. C., Mason, S. T. The effects of dorsal bundle injections of 6-hydroxydopamine on avoidance responding in rats. Bitr J Pharmacol. 64 (4), 601-605 (1978).
  44. Mason, S. T. Fibiger H.C. 6-OHDA lesion of the dorsal noradrenergic bundle alters extinction of passive avoidance. Brain Res. 152, 209-214 (1978).
  45. McGaugh, J. L. Memory consolidation and the amygdala: a systems perspective. Trends Neurosci. 25 (9), 456-461 (2002).
  46. LaLumiere, R. T., Niehoff, K. E., Kalivas, P. W. The infralimbic cortex regulates the consolidation of extinction after cocaine self-administration. Learn Memory. 17, 168-175 (2010).
  47. Mueller, D., Cahill, S. P. Noradrenergic modulation of extinction learning and exposure therapy. Behav Brain Res. 208 (1), 1-11 (2010).
  48. Smith, R. J., Aston-Jones, G. α(2) Adrenergic and imidazoline receptor agonists prevent cue-induced cocaine seeking. Biol Psychiat. 70 (8), 712-719 (2011).
  49. Buffalari, D. M., Baldwin, C. K., See, R. E. Treatment of cocaine withdrawal anxiety with guanfacine: relationships to cocaine intake and reinstatement of cocaine seeking in rats. Psychopharmacol. (Berl). 223 (2), 179-190 (2012).
  50. De Ridder, D., Vanneste, S., Engineer, N. D., Kilgard, M. P. Safety and efficacy of vagus nerve stimulation paired with tones for the treatment of tinnitus: a case series). Neuromodulation. 17 (2), 170-179 (2014).
  51. Hays, S. A., et al. The timing and amount of vagus nerve stimulation during rehabilitative training affect poststroke recovery of forelimb strength. Neuroreport. 25, 676-682 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

102

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved