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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

La stimolazione del nervo vago (VNS) è emerso come uno strumento per indurre mirato plasticità sinaptica nel proencefalo di modificare una serie di comportamenti. Questo protocollo descrive come implementare VNS per facilitare il consolidamento della memoria paura dell'estinzione.

Abstract

Extinction describes the process of attenuating behavioral responses to neutral stimuli when they no longer provide the reinforcement that has been maintaining the behavior. There is close correspondence between fear and human anxiety, and therefore studies of extinction learning might provide insight into the biological nature of anxiety-related disorders such as post-traumatic stress disorder, and they might help to develop strategies to treat them. Preclinical research aims to aid extinction learning and to induce targeted plasticity in extinction circuits to consolidate the newly formed memory. Vagus nerve stimulation (VNS) is a powerful approach that provides tight temporal and circuit-specific release of neurotransmitters, resulting in modulation of neuronal networks engaged in an ongoing task. VNS enhances memory consolidation in both rats and humans, and pairing VNS with exposure to conditioned cues enhances the consolidation of extinction learning in rats. Here, we provide a detailed protocol for the preparation of custom-made parts and the surgical procedures required for VNS in rats. Using this protocol we show how VNS can facilitate the extinction of conditioned fear responses in an auditory fear conditioning task. In addition, we provide evidence that VNS modulates synaptic plasticity in the pathway between the infralimbic (IL) medial prefrontal cortex and the basolateral complex of the amygdala (BLA), which is involved in the expression and modulation of extinction memory.

Introduzione

Classica paura condizionata fornisce un modello animale ampiamente usato per studiare le basi biologiche dei disturbi d'ansia. Durante la paura condizionata, uno stimolo avversivo (lo stimolo incondizionato, US, ad esempio, un footshock) è presentato in combinazione con uno stimolo neutro, quale un tono e / o di un contesto (stimolo condizionato; CS). Durante la paura condizionata, si formano associazioni tra il CS e gli Stati Uniti. Alla fine la presentazione del CS sola provoca una risposta di paura (la risposta condizionata; CR). In timore estinzione, la CS è presentato ripetutamente in assenza degli Stati Uniti, causando il CR a diminuire gradualmente 1. Così, l'estinzione della paura condizionata è un processo attivo in cui le risposte comportamentali a stimoli paurosi neutri vengono attenuate quando si prevedono più esiti avversi. Estinzione di risposte condizionate richiede il consolidamento di nuovi ricordi che competono con le associazioni apprese. Un tratto distintivo di disturbi d'ansia è impaestinzione ired 2-4. Così, l'estinzione della paura condizionata in modelli animali costituisce un paradigma importante sia per l'apprendimento inibitorio e come modello di terapia comportamentale per i disturbi d'ansia umani 5,6.

Perché vi sia una stretta corrispondenza tra la paura e l'ansia umana, si pensa che questi studi possono fornire informazioni sulla natura biologica dei disturbi d'ansia legati come il disturbo da stress post-traumatico e contribuiranno a sviluppare strategie per il trattamento di loro. Un importante obiettivo di ricerca preclinica è quello di aiutare l'apprendimento estinzione e di indurre la plasticità mirato nei circuiti di estinzione a consolidare l'apprendimento estinzione. Stimolazione del nervo vago (VNS) è un approccio neuroprosthetic minimamente invasiva che potrebbe essere utilizzato per fornire stretto modulazione temporale e specifico circuito di aree cerebrali e sinapsi impegnati in un compito permanente. Una serie di studi recenti del gruppo di Michael Kilgard presso l'Università del Texas a Dallas averedimostrato che l'abbinamento VNS con stimoli sensoriali o motorie discreti (per esempio, un tono o un pull leva) è altamente efficace nel promuovere la plasticità corticale per trattare il tinnito 7, o per superare i deficit motori dopo l'ictus 8-10. Inoltre, non contingente VNS che avviene all'interno di una breve finestra temporale dopo l'apprendimento promuove simile plasticità corticale e migliora consolidamento della memoria nei ratti e negli esseri umani 11-13.

Considerando il ruolo del nervo vago nel percorso parasimpatico, non è sorprendente che poteva partecipare nella modulazione memorie e la plasticità sinaptica. Altamente eventi emotivi tendono a produrre memorie più forte di memorie non-emozionali. Ciò è probabilmente dovuto all'influenza degli ormoni dello stress sul consolidamento della memoria. Posttraining somministrazione di adrenalina ormone dello stress aumenta il consolidamento della memoria in animali umani e non umani, ma l'adrenalina non attraversa la barriera emato-cerebrale-barriera 14, 15 . Pertanto, il rilascio di adrenalina indotta da stress deve influenzare il cervello indirettamente a migliorare il consolidamento della memoria. Esistono sempre più prove che il nervo vago può essere il legame tra circolante adrenalina e il cervello. Miyashita e Williams 16 hanno trovato che la somministrazione sistemica di adrenalina è aumentata vagale cottura dei nervi, e aumento dei livelli di noradrenalina nell'amigdala 17. La somministrazione sistemica di adrenalina non aumenta il consolidamento della memoria quando i recettori β-adrenergici sono bloccate nell'amigdala 18 suggerendo che il nervo vago ha un ruolo nel percorso che trasforma le esperienze emotivamente suscitando in memoria a lungo termine.

Così, l'associazione SNV con la formazione ha il potenziale per migliorare i cambiamenti del cervello che supportano il consolidamento della memoria e l'esposizione ai segnali condizionati in assenza del rinforzo migliora il consolidamento dell'apprendimento estinzione in ratti 19,20. Qui si descrive l'uso di un VNSstrumento sa per promuovere la plasticità corticale e facilitare l'estinzione di una risposta di paura condizionata.

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Protocollo

Tutte le procedure descritte in questo protocollo sono effettuati in conformità con la guida NIH per la cura e l'uso di animali da laboratorio, e sono stati approvati dalla cura e l'uso degli animali Comitato istituzionale di L'Università del Texas a Dallas.

1. Costruzione di VNS polsini

  1. Creare uno strumento di perforazione per segare la punta di un ago 22 G ½.
  2. Eseguire la fine ormai smussata del 22 ½ G ago su un file di metallo più volte per appiattirla. Tenere l'ago con un angolo di 45 ° per il file ed eseguirlo più volte il file mentre ruotandola. Questo farà sì che il metallo a diventare più sottile e furl verso l'interno. ATTENZIONE: inserire la punta del bisturi nell'estremità tagliata dell'ago e ruotare con una certa forza verso il basso a spiegare il metallo.
  3. Utilizzare binocolo ingrandimento per i passaggi rimanenti nella sezione 1.
  4. Usando un bisturi (10 o 15 lame) tagliato 4 segmenti mm di tubo.
  5. Inserire un Segmento 4 mm su unapiccola punta o un altro strumento di forma simile. Questo per tenere il tubo in posizione mentre viene manipolato.
  6. Praticare 4 fori nel tubo (Figura 1A). I fori dovrebbero rendere i quattro punti di 2 mm di 2 mm quadrati e devono essere pulite e senza spigoli.
    NOTA: Lo strumento di perforazione deve essere riaffilata (passo 1,2) ogni 2 o 3 fori. Difficoltà con questo passo è quasi certamente dovuto ad un utensile di perforazione che non è abbastanza affilato.
  7. Con il tubo ancora sulla punta, utilizzare un bisturi per tagliare il tubo longitudinalmente tra i fori in modo che due fori di estremità su entrambi i lati del taglio (Figura 1B).
  8. Usando un ago da cucito e filo di sutura, sutura passare attraverso i fori per creare il sartiame per il collocamento finale del bracciale intorno al nervo vago. Iniziare con l'ago all'interno del bracciale e farla passare attraverso uno dei fori, per poi tornare attraverso il foro adiacente dall'esterno (Figura 1C). Legare il Filettod insieme ~ 2 cm dalla plastica in modo che il tubo e filo fanno un triangolo. Lasciare ~ 8 centimetri di filo dopo il nodo e tagliare. Ripetere il processo per i fori sul lato opposto del taglio. Il tubo è ora pronto per essere cablato.
  9. Preparare i fili per i polsini.
    1. Tagliare filo platino iridio in 70 segmenti mm.
    2. Utilizzando la punta migliore per la torcia gioielli, creare un forte fiamma blu centro che sia il più raffinato possibile e usarlo per togliere ~ 1 cm di rivestimento di plastica dal filo. Applicare il blu centro della fiamma al fine spelata del cavo per creare una pallina. Applicare il blu centro della fiamma a vari punti della parte spelata di fondere le sette trefoli insieme. Apparirà il filo di queste macchie a piegare.
    3. Sul lato opposto del filo, applicare il blu centro della fiamma al fine di creare una pallina. Minimizzare nudo la plastica in questo fine.
  10. Cablare il bracciale (Figura 1D).
    NOTA: Steps al punto 1.10 deve essere fatto sotto un binocolo di ingrandimento.
    1. Nastro il manichetta utilizzando i fili in modo che è orientato con il taglio corre orizzontalmente. Tirare i fili stretto in modo che il bracciale sia aprì e poi nastro adesivo lungo i fili.
    2. Afferrare l'estremità appallottolato del lato spellata del filo preparato con # 5 pinze e spingere attraverso il foro in basso a destra. Estrarre la pinza dal foro, lasciando l'estremità del filo nel mezzo del bracciale.
    3. Re-afferrare l'estremità appallottolata del filo spelato (ora al centro del bracciale) e spingerlo attraverso il foro superiore destra. Estrarre la pinza dal foro, lasciando il filo passato completamente attraverso il bracciale e sciolto sul lato superiore del gambetto.
    4. Re-afferrare l'estremità appallottolata del filo spelato (ora fuori del bracciale sul lato superiore) e spingerlo indietro attraverso il foro superiore destra dall'interno. Continuare a farlo finché il filo è saldamente in posizione: Test tirando sull'estremità opposta del filo.
      NOTA:Durante questo processo è fondamentale per differenziare le porzioni spelati / isolati del filo. Il filo che è posizionato in definitiva nel 'trogolo' del bracciale deve essere denudato, ma tutto sotto i fori inferiori (fuori il bracciale sull'estremità inferiore) deve essere isolato. Questo garantisce la consegna di corrente solo al nervo vago.
    5. Afferrare l'estremità appallottolata del lato isolante e spingerlo attraverso il foro in basso a destra dall'interno del bracciale, avvolgendolo intorno volta.
    6. Ripetere i punti 1.10.2 - 1.10.5 sul lato sinistro del bracciale in modo che due fili finiscono fissato al tubo, una sul lato destro ed una sul lato sinistro.
    7. Inserire una spilla d'oro nel braccio della mano con il foro rivolto verso l'alto. Riempire il buco con il flusso.
    8. Saldare l'estremità isolata del filo (ormai attaccato al bracciale) nel perno.
    9. Lasciare che la saldatura raffreddare, e poi sciogliersi nuovamente. Questo garantisce un buon collegamento tra l'estremità del filo e la iabitacolo del perno. Applicare più saldatura, se necessario. Ripetere l'operazione per il secondo filo.
    10. Con i cavi in ​​esecuzione sulla destra, contrassegnare la parte superiore del bracciale con pennarello indelebile. Contrassegnare anche il perno oro collegato all'elettrocatetere superiore.

2. Costruzione di Cuffia per VNS sito Input

  1. Tagliare 30 millimetri segmenti di filo di rame 26 AWG. Striscia una piccola porzione su ciascuna estremità.
  2. Tagliare la parte più stretta via pin dorati sciolti e saldare l'estremità spellata del filo fino alla fine taglio della spilla d'oro. Creare due composti filo / pin per ogni sito di ingresso desiderata. Inserire un connettore nelle mani aiutare e saldare l'estremità del cavo di un composto fili / pin a ciascuno dei due denti flussati del connettore (figura 2G).
  3. Mark uno dei fili con pennarello. Durante l'intervento, posizionare l'impianto con la rostrale conduttore contrassegnato al filo marcato.

3. VNS Chirurgia

  1. Creare strumenti di vetro su misura per la gestione di vagus nervi durante l'intervento chirurgico.
    1. Utilizzare vetro borosilicato per tirare una micropipetta in modo che abbia una punta affusolata lunga. Se nessun estrattore pipetta è disponibile, rompere il vetro per creare un bordo più lungo.
    2. Tenere l'estremità non rastremata della pipetta con un panno spesso (per evitare ustioni) e premere il rastremata / fine spezzata in una superficie resistente al fuoco liscio durante l'applicazione della fiamma blu dalla torcia gioielli alla fine conica. Il vetro si piegherà come viene premuto sulla superficie. Applicare fiamma fino a un gancio o forme di forma J.
  2. Procedure chirurgiche VNS
    1. Raccogliere e sterilizzare tutti gli strumenti. Preparare una sanitario, area chirurgica riscaldata.
    2. Anestetizzare animale con ketamina / xilazina (85 mg / kg, 5 mg / kg, IP). Valutare la profondità del piano anestetico monitorando vocalizzazioni degli animali e di astinenza-riflessi in risposta ai piedi e / o coda pizzicare.
    3. Shave parte superiore della testa e lato sinistro del collo dell'animale. Proteggere gli occhi dell'animale con minatoreAl olio o pomata occhio. Applicare la soluzione di iodio detergente con garza e poi alcool con garza per le zone rasate. Ripetere una volta.
    4. Iniettare 0,05 ml Marcaine sottocutanea sulla sommità della testa e consentire il bolo disperdere pur ponendo l'animale nello strumento stereotassico.
    5. Utilizzare un bisturi per fare un'incisione nella pelle sul cranio per esporre sia lambda e bregma. Preparare un percorso per il bracciale utilizzando pinze smussate a tunnel sottocutanea dal sito di incisione lungo il lato sinistro di fronte l'orecchio sul lato sinistro del collo.
    6. Tirare il sito di incisione aperta con emostasi. Utilizzando tamponi di cotone, applicare il perossido di idrogeno al cranio esposto per rimuovere eventuali residui di tessuto.
    7. Usando un bisturi, praticare due fori iniziali poco profondi nel cranio di inserire viti di ancoraggio. Essi devono essere collocati una distanza sufficiente per lasciare spazio per l'impianto, ma non troppo vicino al tessuto circostante. Evitare di posizionare le viti direttamente sulla linea mediana.
      1. Con forzaps e cacciavite, guidare una vite ossea in entrambi i fori. Le viti devono essere a tenuta nei fori, con i tappi 2 - 3 mm dalla superficie del cranio per lasciare spazio per acrilico compilare sotto e intorno le viti.
    8. Riempire lo spazio sotto, intorno, e tra le viti con una piccola quantità di acrilico, evitando il tessuto circostante. Poi posto una maggiore quantità di acrilico in mezzo al cranio tra le due viti.
    9. Afferra l'impianto in modo che il filo segnato è orientata rostrale al filo non marcato e posizionare rapidamente l'impianto in acrilico, facendo attenzione a non entrare in acrilico nei perni oro, l'area chiusura, o il sito di ingresso sulla parte superiore. Una volta posizionato permette di impostare ~ 5 minuti fino a secco. Questo può anche essere eseguita utilizzando il braccio della stereotassico per il supporto. Riempire eventuali crepe o fessure tra l'impianto e il cranio con una miscela a bassa viscosità di acrilico. Lasciare asciugare.
    10. Utilizzare binocolo ingrandimento per i passaggi rimanenti nella sezione 3.2.
    11. Rimuovere the animale dallo strumento stereotassico. Posto l'animale sul lato destro, ruotando leggermente verso la posizione ventrale.
    12. Fai una piccola incisione di circa sopra la vena giugulare sinistra. L'osso della mascella e clavicola dovrebbero essere equidistante al sito di incisione. Ampliare l'incisione mediante dissezione smussata fino a raggiungere lo strato muscolare. I Sternocleidomasioideo, sterno-ioideo e omoioideo muscoli dovrebbero essere visibili. Utilizzare divaricatori muscolari per mantenere il sito aperto.
    13. Proseguire dissezione smussato lungo i solchi naturali tra i muscoli. Cercare la pulsazione della carotide. Rubrica attraverso il muscolo verso il pulsare rivelerà la carotide. Tirate i muscoli della schiena con il divaricatore muscolo. La guaina contenente carotide contiene anche il nervo vago. Smussare attenzione sezionare la guaina con le forbici.
    14. Identificare il nervo vago. E 'il nervo più grande nella guaina carotidea e di solito è al lato sinistro dell'animale dell'arteriama si possono trovare su qualsiasi lato. Passare agli strumenti di vetro personalizzati e separare il nervo vago dalla carotide. Il nervo deve essere esente da qualsiasi altro tessuto per almeno 5 mm.
    15. Dall'incisione sulla testa, utilizzando i filetti sul lato della cuffia opposta i cavi, tirare il bracciale attraverso il tunnel sottocutaneo precedenza tramite una pinza o piccoli emostatiche. Spingerlo attraverso il tessuto nel sito di incisione sul collo.
    16. Sollevare delicatamente il nervo usando gli strumenti di vetro e spingere i fili sul lato della cuffia opposta conduttori sotto il nervo. Tirare i fili tutto il percorso attraverso, facendo attenzione a non sfregare contro il nervo. Il bracciale deve essere immediatamente adiacente al nervo.
    17. Assicurarsi che il bracciale è orientato con il 'top' lato contrassegnato superiore. Eliminare il nervo al centro del bracciale. Il nervo dovrebbe trovarsi attraverso entrambi i fili nel trogolo del bracciale (Figura 2B). Legare i fili insieme per chiudere il bracciale.
    18. Sul headcap, collegare i perni fissati al bracciale nei perni oro sul sito di ingresso stimolazione. Inserire il piedino contrassegnato nel perno oro attaccato al dente più anteriore sul posto ingresso simulazione.
    19. Per verificare che il bracciale correttamente stimola il nervo vago, effettuare una cessazione di respirazione test, collegando lo stimolatore al sito di ingresso stimolazione sulla paletta e esecuzione stimolazione (0,2 mA, 60 Hz, fino a 10 secondi). La respirazione deve fermarsi brevemente e la frequenza cardiaca dovrebbe cadere, verificando funzione polsino.
    20. Fissare i perni sul sito di ingresso stimolazione con acrilico. Coprire i fili e verificare che pin e cavi esposti non portano a cortocircuiti. Utilizzare acrilico per appianare eventuali urti o per colmare le eventuali lacune. Lasciare asciugare.
    21. Sutura chiuso entrambi i siti di incisione. Iniettare 0,05 ml Marcaine sottocutanea nei pressi del sito di incisione collo. Applicare una pomata antibiotica a INCISIONE siti. Facoltativamente, lasciare un connettore maschio in luogo sul posto ingresso stimolazioneevitare danni o ostruzioni durante il processo di guarigione.
    22. Trattare con antibiotico e seguire le cure post-operatorie standard compreso adeguata analgesia. Animali Ritorno a struttura alloggiativa animale dopo che riprendano la mobilità. Lasciare 5 giorni per il recupero. Per garantire la massima durata e la funzione del headcap, animali casa singolarmente per il resto dell'esperimento.
      NOTA: ratti Sham-VNS subiscono lo stesso intervento, ma il circuito è progettato per short a livello della headcap (cioè, un headcap è impiantato ed il nervo vago è separato dalla carotide, ma senza polsino elettrodo viene posto intorno nervi).

4. uditiva paura condizionata

NOTA: Questo protocollo condizionata paura è più intenso rispetto alla maggior parte 21 perché l'obiettivo di questi esperimenti è quello di migliorare l'estinzione. Con lieve condizionamento alla paura che può essere facilmente spenta, un effetto pavimento può oscurare questo miglioramento.

  1. Gli animali di casa su un 12 ore di luce / buio ciclo con ad libitum accesso al cibo e all'acqua. Gestire gli animali ogni giorno durante il recupero da un intervento chirurgico.
  2. Impostare il condizionamento Apparecchi di prova e, costituito da una scatola operante alloggiata in una camera sonora attenuati (Figura 2C). La scatola operante ha pareti di plastica trasparente, 20 x 20 x 20 cm, e ha un pavimento griglia in acciaio inossidabile che è collegato ad un generatore di shock piedi. Utilizzare una casa bianca di luce per illuminare la camera per la registrazione video. Utilizzare un 9 kHz, 85 dB SPL tono come stimolo condizionato.
  3. Comportamento record utilizzando una fotocamera digitale si trova all'interno della camera, sopra la casella operante. Visualizzare e monitorare la sessione su un computer che si trova al di fuori della stanza comportamento. Salvare i video per una successiva analisi.
  4. Pulire le camere con il 70% di etanolo, prima e dopo ogni sessione per eliminare stimoli olfattivi.
  5. La paura-condizionare i ratti per 2 giorni (Figura 3A). Confermare che i topi non sono inNately paura del tono presentando 5 toni (9 kHz, 85 dB, 30 sec), il primo giorno. Verificare che i livelli di congelamento sono trascurabili.
    1. Seguire le presentazioni toni iniziali con 8 tono footshock (1 sec, 0,5 mA) abbinamenti su ciascuno dei 2 giorni consecutivi. Ripetere gli abbinamenti tono footshock il secondo giorno. Variare l'inter-stimolo intervallo (ISI) tra 2 e 4 minuti, con una media di 3 minuti per ogni prova. Randomize il punto in cui l'ammortizzatore si verifica durante il tono.
  6. Al terzo giorno, testare la forza dell'associazione tono / shock. Gioca 4 toni con un ISI di 3, 4, o 5 minuti (4 min media), in assenza di footshocks e registrare il comportamento di congelamento degli animali durante le presentazioni di tono e durante le inter-stimolo intervalli come misure della risposta di paura condizionata (CFR).
  7. Il giorno 4, iniziare l'allenamento di estinzione con VNS o Sham VNS.
    1. Inserire i ratti nella stimolatore inserendo i connettori maschio dal stimulator nel sito di ingresso stimolazione. Posizionare animali nella camera (Figura 2A, 2C). Impostare lo stimolatore a 0,4 mA, 500 ms larghezza di impulso a 30 Hz. Impostare stimolazione per una durata totale di 30.15 sec, partendo 150 msec prima dell'inizio del tono. Gioca animali 4 toni (come al punto 4.6) e associare ogni presentazione tono con VNS o Sham VNS.
  8. Verificare periodicamente l'integrità elettrica del bracciale e l'ingresso sito utilizzando un oscilloscopio.
    1. Inserire l'animale come normale e dividere l'uscita dallo stimolatore all'oscilloscopio.
    2. Impostare l'intervallo sull'oscilloscopio -20 V a +20 V ed eseguire la stimolazione. La forma d'onda della stimolazione 30 Hz deve essere visibile sull'oscilloscopio. Stimolazioni superiore a 10 V in formato indicano alta impedenza e una cuffia non funziona correttamente o il collegamento al sito di ingresso stimolazione.
  9. Per testare l'effetto del SNV sulla formazione estinzione eseguito un secondo test CFR (come al punto 4.6)il giorno 5. Registrare il tempo trascorso di congelamento durante le presentazioni di tono e confrontarle con il congelamento di base registrati durante la prima prova CFR (passo 4.6).
  10. Analizzare i video utilizzando un osservatore indipendente che è cieco alle condizioni di trattamento. Misurare il tempo trascorso il congelamento durante le presentazioni di tono con un cronometro. Congelamento è definito come l'immobilità totale, durante il quale il topo mostra una rapida respirazione, testa bassa, e sviluppa le zampe 22. Analisi del comportamento di blocco può essere suddiviso in due fasi: durante la presentazione tono e durante l'intervallo inter-stimolo.

5. In Vivo registrazioni di Evocati campo Potenziali

Nota: Questo passaggio è facoltativo. Potenziali di campo evocati (EFP) sono registrate 24 ore dopo che i test di ripristino (5 ° giorno) in ratti anestetizzati isoflurano-montati in un apparato stereotassico, seguendo le procedure standard 23,24.

  1. Raccogliere e sterilizzare tutti gli strumenti.
  2. Indurre anestesia con isoflurano (5% in 100% di ossigeno, portata 1l / min) in una camera di plastica trasparente. Valutare la profondità del piano anestetico monitorando vocalizzazioni degli animali e di astinenza-riflessi in risposta ai piedi e / o coda pizzicare. Usare olio minerale o pomata oculare per proteggere gli occhi.
  3. Iniettare 0,05 ml Marcaine sottocutanea sulla sommità della testa e consentire il bolo di disperdersi. Utilizzare un bisturi e pinze emostatiche per rimuovere il headcap dal cranio. Utilizzare come poca forza possibile per evitare oscurando bregma.
  4. Posto l'animale nello strumento stereotassico. Utilizzare un bisturi per ampliare l'incisione per esporre sia lambda e bregma. Mantenere aereo anestesia con isoflurano (3% in ossigeno al 100%, portata 1 L / min) con un musetto.
  5. Praticare dei fori nel cranio sopra la corteccia prefrontale infralimbica (IL) e l'amigdala basolaterale (BLA). Inferiore A microelettrodi vetro (2M KCl; 1-2 MOhm resistenza) nella BLA (D / V: 7.2, A / P: 2.7, M / L: 4.9 da bregma) e stimoione elettrodo nella regione IL della corteccia prefrontale mediale (D / V: 4.6, A / P: 3.0, M / L: 0.7 da bregma) (Figura 4A).
  6. Stimolare la IL a evocare EFP nella BLA. I dati mostrati in figura 4 è stata acquisita con le seguenti impostazioni: Un impulso di stimolazione di 0,3 msec durata, utilizzando una intensità di stimolazione che corrispondeva al 40% dell'intensità minima corrente che evoca una risposta massima del campo (sulla base di una curva di input-output determinato prima raccolta dei dati di base), consegnato ogni 15 secondi.
  7. Raccogliere dati di base per un minimo di 10 - 15 minuti prima di indurre la plasticità sinaptica.
    NOTA: Il protocollo utilizzato per evocare la plasticità sinaptica varierà con le esigenze degli esperimenti e devono essere attentamente selezionati da ciascuno sperimentatore. I dati in figura 4C mostra cambiamenti nel EFP seguente 3 raffiche di 100 impulsi a 50 Hz (2 sec), con intervalli tra loro scoppiare 20 sec alla intensità minima corrente che evocanod la risposta massima del campo.
  8. Misurare l'ampiezza della EFP come differenza tra la media di una finestra msec 5 prima del manufatto stimolazione e la media di una finestra 5 msec intorno 20 - 25 msec dopo l'artefatto stimolazione, corrispondente al picco negativo del potenziale di campo. Normalizzare i dati al basale e impostare la media di un 10 min basale come 100%. Utilizzare le ampiezze EFP medi di un altro periodo di 10 minuti dopo l'induzione della plasticità (ad esempio, 40 - 50 min dopo induzione) per valutare i cambiamenti a lungo termine nel EFP ampiezza.
  9. Dopo la fine della registrazione decapitarlo l'animale anestetizzato ed estrarre il cervello. Preparare il tessuto per la verifica istologica di posizionamento degli elettrodi.

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Risultati

Questa sezione illustra esempi di risultati ottenibili utilizzando SNV in combinazione con l'apprendimento estinzione per ridurre l'espressione della risposta di paura condizionata in ratti. Per giorni 1 e 2 (Auditory paura condizionata), ratti sono stati addestrati su un compito condizionamento alla paura uditivo in cui footshocks sono stati associati con un tono. Il giorno 3 (Pre trattamento Test), i toni sono stati presentati, in assenza di footshocks per misurare i livelli di congelamento e dedurre la paura ...

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Discussione

Presentiamo qui un protocollo utilizzato per facilitare l'estinzione della paura condizionata durante una singola sessione di esposizione a stimoli condizionata 19 e per modulare la plasticità nel percorso tra la corteccia infralimbica e basolaterale che possono mediare estinzione apprendimento 20. Un passo cruciale per il successo di questo protocollo è la corretta consegna dei VNS durante l'allenamento estinzione. Pertanto, particolare attenzione deve essere data alla costruzione degli ...

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Divulgazioni

The authors have no competing interests or conflicts.

Riconoscimenti

This research was supported by the National Institute of Mental Health MH 086960-01A1 (Christa K. McIntyre).

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Alcohol
AtropineFisherA0132-5G
BetadineHenry Schein69066950
Hydrogen peroxide CVS209478
KetamineHenry Schein 1129300
MarcaineHenry Schein6312615
Mineral OilCVS152355
NeosporinCVS629451
OxygenHome Depot304179
PennicillinFisherPENNA-10MU
PropaneHome Depot304182
XylazineHenry Schein4019308
Tools
Jewelery TorchSmith Equipment23-1001D
Sewing NeedleWalgreens441831
#5 Forceps (2)Fine Science Tools11254-20
Soldering IronHome Depot 203525863
AmScope SM-4TX-144A 3.5X-45X Circuit Board Boom Stereo Microscope + 144 LEDAmScopeSM-4TX-144A
Helping HandsA-M Systems 726200
Scalpel Blade HolderFine Science Tools10003-12
Metal FileHome Depot6601
RulerHome Deopt202035324
Curved Hemostats Fine Science Tools130009-12
Fine ScissorsFine Science Tools14058-09
SpatulaFine Science Tools
Small ScrewdriverHome Depot646507
Magnetic Fixator Retraction SystemFine Science Tools18200-04, 18200-01, 18200-05
Heating PadWalgreens30294
ClippersWalgreens277966
SharpieStaples125328
Ring ForcepsFine Science Tools11103-09
Custom Micropipette Glass Tools (J shape and Straight) - Borosilicate glassSutter InstrumentB150-110-10
Adson ForcepsFine Science Tools11006-12
Cuffs
TubingBraintree Scientific IncMRE-065
Platinum Iridium WireMedwire10IR9/49T
Gold PinsMill-Max1001-0-15-15-30-27-04-0
Suture ThreadHenry Schein100-5797
22 G needlesFisher 14-815-525
Paper TapeFisher 03-411-602
SolderHome Depot327793
Flux Home Depot300142
Scalpel Blade, 10 or 15Stoelting52173-10
Silastic Laboratory Tubing .51 mm ID x .94 mm ODFisher 508-002
Headcaps
Connector Pieces (male)Omnetics Connector CorporationA25001-004
Headcap pieces (female)Omnetics Connector CorporationA24001-004
Teets Dental Acrylic, Liquid and PowderA-M Systems525000, 526000
26 Gauge Solid Copper WireStaples1016882  
Surgery
Bone ScrewsStoelting+CB33:C6151457
Scalpel Blades, 10 or 15Stoelting52173-10
1 ml syringesFisher14-826-261
22 G NeedlesFisher 14-815-525
27 G NeedlesFisher14-826-48
2" x 2" GauzeFisher22-362-178
SwabsFisher19-120-472
Puppy PadsPetCo1310747
Kim WipesFisher06-666-A
Chamber and Behavioral Setting 
Husky Metal Front Base Cabinet (30WX19DX34H)Home Depot100607961
Quiet Barrier­ HD Soundproofing Material (Sheet) (PSA)soundproofcow.com10203041
Convoluted Acoustic Foam Panelsoundproofcow.com10432400
Isolated Pulse Stimulator Model 2100A-M Systems720000
Digital Camera - Logitech Webcam C210LogitechB003LVZO88
MatLabMathworks.com
Sinometer 10 MHz Single Channel OscilloscopeSinometerCQ5010C
OxyLED T-01 DIY Stick-on Anywhere 4-LED Touch Tap LightOXYLEDB00GD8OKY0
5k ohm potentiomterAlpha ElectronicsB00CTWDHIO
Extech 407730 40-to-130-Decibel Digital Sound Level MeterExtech InstrumentsB000EWY67W
DSCK-C Dual Output, scrambled shockerKinder Scientific Co

Riferimenti

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