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요약

미주 신경 자극 (VNS)는 행동의 범위를 수정하는 전뇌에 타겟 시냅스 가소성을 유도하기위한 도구로 떠오르고있다. 이 프로토콜은 공포 멸종 메모리의 통합을 용이하게하기 위해 VNS를 구현하는 방법에 대해 설명합니다.

초록

Extinction describes the process of attenuating behavioral responses to neutral stimuli when they no longer provide the reinforcement that has been maintaining the behavior. There is close correspondence between fear and human anxiety, and therefore studies of extinction learning might provide insight into the biological nature of anxiety-related disorders such as post-traumatic stress disorder, and they might help to develop strategies to treat them. Preclinical research aims to aid extinction learning and to induce targeted plasticity in extinction circuits to consolidate the newly formed memory. Vagus nerve stimulation (VNS) is a powerful approach that provides tight temporal and circuit-specific release of neurotransmitters, resulting in modulation of neuronal networks engaged in an ongoing task. VNS enhances memory consolidation in both rats and humans, and pairing VNS with exposure to conditioned cues enhances the consolidation of extinction learning in rats. Here, we provide a detailed protocol for the preparation of custom-made parts and the surgical procedures required for VNS in rats. Using this protocol we show how VNS can facilitate the extinction of conditioned fear responses in an auditory fear conditioning task. In addition, we provide evidence that VNS modulates synaptic plasticity in the pathway between the infralimbic (IL) medial prefrontal cortex and the basolateral complex of the amygdala (BLA), which is involved in the expression and modulation of extinction memory.

서문

고전 공포 조건화는 불안 장애의 생물학적 기초를 공부하는 널리 사용되는 동물 모델을 제공합니다. 공포 조건화 동안, 혐오 자극 (무조건 자극, 미국, 예를 들면, footshock)은 같은 톤 및 / 또는 컨텍스트 (; CS 조건 자극)와 같은 중립적 인 자극과 함께 제공됩니다. 공포 조건화 동안, CS 및 US 간의 연결이 형성된다. 결국 연사의 발표는 혼자 공포 응답 (; CR 조건 반응)을 이끌어 낸다. 공포 멸종, CS 서서히 1 감소시키는 CR 일으키는 US의 부재 하에서 반복되게된다. 따라서, 조절 된 공포의 멸종은 더 이상 혐오 결과를 예측할 수없는 경우 중립 자극에 무서운 행동 반응이 감쇠되는 활성 프로세스입니다. 조건 반응의 멸종 배운 협회와 경쟁 새로운 기억의 통합이 필요합니다. 불안 장애의 특징은 IMPA입니다IRED 멸종 2-4. 따라서, 동물 모델에서 컨디셔닝 두려움의 멸종은 억제 학습과 인간의 불안 장애 5,6에 대한 행동 치료의 모델로 모두 중요한 패러다임 역할을합니다.

두려움과 인간 불안 간의 긴밀한 대응이 있기 때문에, 이는 이러한 연구는 외상 후 스트레스 장애와 같은 불안 관련 장애의 생물학적 특성에 대한 통찰력을 제공 할 수 있고 그것들을 치료하기위한 전략을 개발하는데 도움 것이라고 생각된다. 전임상 연구의 중요한 목표는 멸종 학습을 돕기 위해 멸종 학습을 통합 멸종 회로의 타겟 가소성을 유도하는 것입니다. 미주 신경 자극 (VNS)은 뇌 영역과 지속적인 업무에 종사하는 시냅스의 꽉 시간적, 회로 별 변조를 제공하는 데 사용할 수있는 최소 침습 neuroprosthetic 접근 방법이다. 이 달라스 텍사스 대학의 마이클 Kilgard 씨의 그룹에서 최근 일련의 연구이산 감각 모터 자극과 그 페어링 VNS을 표시 (예, 톤 또는 레버를 당겨) 이명 (7)을 치료하기 위해, 또는 뇌졸중 8-10 다음 모터 적자를 극복하기 위해 대뇌 피질 가소성을 증진에 매우 효과적이다. 또한, VNS 비 조건부 유사하게 대뇌 피질 가소성을 촉진하고 쥐에서 인간 11-13 메모리 통합을 향상 학습 후 짧은 시간 창 내에서 발생하는.

부교감 통로에서 미주 신경의 역할을 고려할 때, 그것이 메모리와 시냅스를 변조에 참여할 수있는 것은 당연하다. 매우 감정적 인 이벤트가 아닌 감정적 인 기억보다 더 강한 기억을 생산하는 경향이있다. 이는 메모리에 통합 스트레스 호르몬의 영향으로 보인다. 스트레스 호르몬 아드레날린의 Posttraining 관리는 인간과 인간이 아닌 동물에서 메모리 통합을 강화하지만, 아드레날린, 15 혈액 - 뇌 장벽 (14)을 통과하지 않습니다 . 따라서 스트레스에 의한 아드레날린의 방출은 메모리 통합을 강화하기 위해 간접적으로 뇌에 영향을해야합니다. 강력한 증거는 미주 신경은 아드레날린 순환과 뇌 사이의 연결 고리가 될 수 있음을 시사한다. 미야 시타와 윌리엄스 (16)는 아드레날린의 전신 투여가 미주 신경 발사를 증가하고, 편도 17 노르 에피네프린의 수준을 증가 것으로 나타났습니다. β - 아드레날린 수용체는 미주 신경이 장기 기억으로 감정적으로 불러 일으키는 경험을 전환 경로에서 역할을 제안 편도 18에서 차단 될 때 아드레날린의 전신 투여는 메모리 통합을 강화하지 않습니다.

따라서, 훈련 VNS 페어링 19,20 쥐에서 흡광 학습의 통합을 향상 보강 부재 에어컨 큐 메모리에 통합 및 노출을 지원 뇌 변화를 향상시킬 가능성이있다. 여기에 우리의 VNS의 사용을 설명SA 도구는 대뇌 피질 가소성을 촉진하고 컨디셔닝 공포 응답의 소멸을 촉진한다.

프로토콜

이 프로토콜에 설명 된 모든 절차는 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 NIH 가이드에 따라 수행하고, 그들은 달라스에있는 텍사스 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.

VNS 소맷 부리 1. 건설

  1. 22 ½ G 바늘의 날카로운 끝을 절단하여 드릴링 도구를 만듭니다.
  2. 금속 파일 위를 평평하게 여러 번 22 ½ G 바늘의 지금 뭉툭한 끝을 실행합니다. 파일에 45도 각도로 바늘을 잡고, 회전하면서 파일을 통해 그것을 여러 번 실행합니다. 이 금속은 안쪽으로 얇고 감다가 원인이됩니다. 주의 : 바늘의 절단 끝으로 메스의 끝을 삽입하고 금속을 펴다 일부 하향 힘으로 회전합니다.
  3. 섹션 1의 나머지 단계를 확대 쌍안경을 사용합니다.
  4. 메스를 사용하여 (10 또는 15 블레이드) 튜브 4mm 세그먼트를 잘라.
  5. 이상 하나 4mm 세그먼트를 배치작은 드릴 비트 또는 다른 유사하게 모양의 도구입니다. 이것은이 조작되고있는 동안 위치에 호스를 유지하는 것이다.
  6. 튜브 (그림 1A)에 4 구멍을 드릴. 구멍 2mm 제곱으로 2mm의 네 점을 확인해야없이 거친 가장자리 청소해야합니다.
    참고 : 드릴링 도구 (단계 1.2) 매 2 또는 3 홀 resharpened 될 필요가있다. 이 단계의 어려움으로 인해 충분히 선명하지 않은 드릴링 도구에 거의 확실하다.
  7. 두 개의 구멍이 컷 (그림 1B)의 양쪽에 끝낼 수 있도록 드릴 비트에 여전히 튜브로, 구멍 사이에 길이 튜브를 잘라 메스를 사용합니다.
  8. 재봉 바늘과 봉합 실을 이용하여, 미주 신경 주위 커프스의 궁극적 배치 담합 만들 관통 구멍을 통과 봉합사. 팔목 안쪽에 바늘로 시작하고 외부 (그림 1C)에서 인접한 구멍을 통해 다시 이동, 구멍 중 하나를 통해 전달합니다. threa 타이D 플라스틱에서 함께 ~ 2cm가되도록 튜브 및 스레드는 삼각형을 만든다. 매듭 후 스레드의 ~ 8cm 허용하고 트림. 절단 반대측 구멍 대한 프로세스를 반복한다. 튜브는 이제 배선 할 준비가되어 있습니다.
  9. 수갑을 위해 와이어를 준비합니다.
    1. 70mm 세그먼트로 백금 이리듐 와이어를 잘라.
    2. 보석 토치를위한 최고의 팁을 사용하여, 가능한 한 세련 블루 센터와 날카로운 불꽃을 만들고 ~ 와이어에서 플라스틱 코팅의 1cm를 제거하는 데 사용합니다. 작은 공을 만드는 와이어의 제거 끝으로 불꽃의 블루 센터를 적용합니다. 함께 일곱 가닥을 융합 제거 부분의 여러 지점에 화염의 블루 센터를 적용합니다. 이러한 점에서 와이어를 꼬 나타납니다.
    3. 와이어의 대향 단부에서, 작은 공을 만드는 단부에 화염 블루 센터를 적용. 이 말의 플라스틱을 제거 최소화합니다.
  10. 커프 (그림 1D)를 연결할.
    참고 : 인트섹션 1.10에서 PS는 확대 쌍안경에 따라 수행해야합니다.
    1. 이 컷은 수평으로 실행하는 방향이되도록 스레드를 사용하여 아래로 커프를 테이프입니다. 커프가 열려 뽑아 다음 스레드를 테이프되도록 꽉 스레드를 당깁니다.
    2. # 5 집게로 제조 된 와이어의 제거 측의 고사리 끝을 잡고 오른쪽 아래 구멍을 통해 밀어 넣습니다. 커프의 중앙에 와이어의 끝을두고 구멍의 집게를 당겨.
    3. (현재 커프의 중간에) 제거 와이어의 고사리 끝을 다시 잡고 오른쪽 상단 구멍에 밀어 넣습니다. 커프의 위쪽에 커프 느슨한을 통해 완전히 전달 된 와이어를 떠나, 구멍의 집게를 잡아 당깁니다.
    4. (현재 위쪽에 커프 외부) 제거 와이어의 고사리 끝을 다시 잡고 안쪽에서 오른쪽 상단 구멍에 다시 밀어 넣습니다. 와이어의 반대편에 잡아 당 겼에 의해 시험 : 와이어가 제 위치에 단단히 고정 될 때까지 그렇게 계속합니다.
      노트 :이 과정에서 그 와이어의 벗겨진 / 절연 부분을 구별하는 것이 중요하다. 궁극적으로 커프의 '통'에 위치 와이어는 제거되어야하지만, (하단에 커프 외부) 바닥 구멍 아래 모든 것이 절연해야합니다. 이는 미주 신경에 현재의 배달을 보장합니다.
    5. 절연 측의 고사리 끝을 잡고 주위를 한 번 반복, 커프의 내부에서 오른쪽 아래 구멍을 통해 밀어 넣습니다.
    6. 두 개의 와이어가 튜브, 우측에 하나, 왼쪽에 하나의 고정 결국되도록 커프의 좌측 1.10.5 - 반복 1.10.2 단계.
    7. 구멍이 위를 향하도록 도움의 손길의 팔에 금 핀을 놓습니다. 플럭스로 구멍을 채 웁니다.
    8. 핀으로 와이어 (지금 팔목에 부착)의 절연 끝을 납땜.
    9. 솔더가 냉각되도록 한 다음 다시 용융. 이는 와이어의 단부와 I 사이 양호한 연결을 보장핀의 nside. 필요한 경우 더 솔더를 적용합니다. 제 2 와이어에 대해 반복합니다.
    10. 리드가 오른쪽으로 실행으로, 영구 마커 커프의 상단을 표시합니다. 또한 상단 리드에 부착 된 금 핀을 표시합니다.

VNS 입력 사이트에 대한 Headcap 2. 건설

  1. 26 AWG 구리 와이어의 30mm 세그먼트를 잘라. 양쪽 끝의 작은 부분을 벗겨.
  2. 느슨한 골드 핀을 좁은 끝을 잘라 골드 핀의 절단 끝으로 전선의 피복을 벗긴 끝을 납땜. 각각의 원하는 입력 사이트에 대한 두 개의 와이어 / 핀 화합물을 생성합니다. 돕는 손에 커넥터를 배치하고 커넥터 (도 2G)의 두 흐를 치아의 각 전선 / 핀 화합물 와이어 단부를 납땜.
  3. 마크 샤피와 와이어가. 수술하는 동안, 표시되지 않은 와이어에 표시된 와이어 주동이와 임플란트를 놓습니다.

3. VNS 수술

  1. vagu의 처리에 대한 사용자 지정 유리 도구 만들기수술 중의 신경.
    1. 이 긴 테이퍼 팁을 가질 수 있도록 마이크로 피펫을 끌어 붕규산 유리를 사용합니다. 더 피펫 풀러가 없다면, 긴 에지를 만드는 유리 휴식.
    2. 테이퍼 끝으로 보석 토치에서 푸른 불꽃을 적용하는 동안 두꺼운 천으로 피펫의 비 테이퍼 끝을 잡고 (화상을 방지하기 위해)과 부드러운 화재 방지 표면에 테이퍼 / 깨진 끝을 누릅니다. 이 표면으로 누르고있는 유리 구부 것입니다. 후크 또는 J 모양이 형성 될 때까지 불꽃을 적용합니다.
  2. VNS 수술
    1. 수집 및 모든 도구를 소독. 위생, 난방 수술 영역을 준비합니다.
    2. 케타민 / 자일 라진 (85 ​​㎎ / ㎏, 5 ㎎ / kg, IP)으로 마취 동물. TOE 및 / 또는 테일 핀치에 응답하여 동물의 발성과 빠짐 반사를 모니터하여 마취면의 깊이를 평가한다.
    3. 동물의 목의 머리의 상단과 왼쪽을 면도. 광부와 동물의 눈을 보호알 오일 또는 안연고. 면도 부위에 거즈에 알코올 다음 요오드 클렌징 거즈와 솔루션을 적용합니다. 한 번 반복합니다.
    4. 마르케 피하 머리의 상단에 0.05 ml에 주입하고, 정위 계기로 동물을 배치하는 동안 러스는 분산 할 수 있습니다.
    5. 람다와 브레 그마 모두 노출 두개골에 피부에 절개를 만들기 위해 메스를 사용합니다. 목의 왼쪽 귀 앞의 왼쪽 아래로 절개 사이트에서 피하로 터널을 무딘 집게를 사용하여 커프스에 대한 경로를 준비한다.
    6. 지혈제 오픈 절개 사이트를 당깁니다. 면봉을 사용하여, 남아있는 조직을 제거하기 위해 노출 된 두개골에 과산화수소를 적용한다.
    7. 메스를 사용하여 고정 나사를 배치 두개골에 두 개의 얕은 선발 구멍을 드릴. 그들은 충분히 멀리 떨어져 임플란트를위한 공간을 허용으로 배치하지만, 주변 조직에 너무 가까이하지해야합니다. 중간 선에 직접 나사를 두지 마십시오.
      1. 힘으로PS와 스크루 드라이버, 두 구멍에 뼈 나사를 드라이브. 두개골의 표면 위의 3mm에서하고 나사 주위에 채우기 위해 아크릴을위한 공간을 허용하는 - 나사 (2) 캡, 구멍에 꽉해야한다.
    8. 주변 조직을 피하고, 주위 및 아크릴 소량와 나사 사이에, 아래의 공간을 채우기. 그런 다음 두 개의 나사 사이의 두개골의 중간에 아크릴의 더 큰 금액을 배치합니다.
    9. 표시된 선이 표시되지 않은 와이어 주동이를 지향하고 신속 골드 핀 버클 지역, 또는 상단에 입력 사이트에 아크릴 묻지 않도록주의하면서, 아크릴에 임플란트를 배치되도록 임플란트를 잡아. 일단 건조 될 때까지 ~ 5 분을 설정할 수 있습니다 위치. 이것은 또한 지원 정위의 아암을 사용하여 수행 될 수있다. 아크릴의 낮은 점도의 조화와 함께 임플란트와 두개골 사이의 균열이나 틈 입력합니다. 건조하도록 허용합니다.
    10. 3.2의 나머지 단계를 확대 쌍안경을 사용합니다.
    11. 일을 제거정위기구의 전자 동물. 그 오른쪽에있는 동물을 놓고 복부 위치로 약간 회전.
    12. 약 왼쪽 경정맥을 통해 작은 절개를합니다. 턱 뼈와 쇄골은 절개 사이트에 거의 같은 거리에 있어야한다. 근육 층에 도달 할 때까지 무딘 절개를 이용하여 절개를 넓혀. sternomastoid, sternohyoid 및 omohyoid 근육이 볼 수 있어야합니다. 열려있는 사이트를 유지하기 위해 근육 견인기를 사용합니다.
    13. 근육 사이의 자연 고랑을 따라 무딘 해부를 계속합니다. 경동맥의 펄스를 찾아보십시오. 펄스쪽으로 근육을 통해 제목은 경동맥을 공개합니다. 근육 트랙터와 근육을 다시 잡아 당깁니다. 경동맥을 포함하는 시스는 미주 신경이 포함되어 있습니다. 조심스럽게 가위로 칼집을 해부 무딘.
    14. 미주 신경을 식별합니다. 그것은 경동맥 시쓰에서 가장 신경하고 동맥의 동물의 왼쪽 통상그러나 어떤 측면에서 찾을 수 있습니다. 사용자 정의 유리 도구로 전환 경동맥에서 미주 신경을 분리합니다. 신경 적어도 5mm 위해 다른 조직이 없어야합니다.
    15. 리드 반대 커프의 측면에있는 나사를 사용하여 머리에 절개,에서, 집게 또는 작은 지혈제와 이전에 만든 피하 터널을 통해 커프를 당깁니다. 목에 절개 부위에 조직을 통해 밀어 넣습니다.
    16. 부드럽게 유리 툴을 사용하여 신경을 들어 올리고 신경 아래 리드 커프스의 대향 측면에 나사산을 누른다. 신경 마찰 않도록주의하면서, 모든 방법을 통해 스레드를 당깁니다. 커프는 신경에​​ 바로 인접해야한다.
    17. 커프가 우수한 표시 '최고'면의 방향이 있는지 확인합니다. 커프의 중앙으로 신경을 삭제합니다. 신경은 이제 커프 (그림 2B)의 골에 모두 와이어를 통해 거짓말을한다. 커프를 닫 함께 스레드를 묶어.
    18. headcap에서 자극 입력 사이트의 금색 핀으로 팔목에 부착 된 핀을 연결합니다. 시뮬레이션 입력 사이트의 가장 앞쪽에 치아에 부착 된 골드 핀으로 표시된 핀을 연결합니다.
    19. 커프가 제대로 미주 신경을 자극하는지 확인하려면, (10 초까지 0.2 mA, 60 Hz에서) 자극에 의​​해 테스트 호흡 headcap에 자극 입력 사이트에 자극을 연결하고 실행 중지를 수행합니다. 호흡이 잠시 중지해야하고 심장 박동이 커프 기능을 확인, 드롭한다.
    20. 아크릴로 자극 입력 사이트에 핀을 고정합니다. 전선을 덮고 노출 핀과 전선이 단락으로 이어질하지 않는 것이 확인합니다. 어떤 범프를 통해 부드럽게 아크릴 사용하거나 틈새를 입력 할 수 있습니다. 건조하도록 허용합니다.
    21. 봉합은 모두 절개 사이트를 마감했다. 목 절개 부위 근처에 마르케 피하 0.05 ml를 주입한다. 사이트를 절개하기 위해 항생제 연고를 적용합니다. 선택적으로 자극 입력 사이트에 장소에 남성 커넥터를 남겨치유 과정 동안의 손상 또는 폐색을 방지 할 수있다.
    22. 항생제 치료와 적절한 진통제를 포함하여 표준 수술 후주의 사항을 따르십시오. 그들은 이동성을 회복 한 후 동물 주거 시설에 동물을 돌려줍니다. 복구를위한 오일을 허용합니다. 단독으로 실험의 나머지 부분에 대한 최대 수명과 headcap의 기능, 집 동물을 보장합니다.
      주 : 가성 VNS 래트 동일한 수술을 그러나 회로 headcap의 레벨 (즉, headcap가 주입되고, 미주 신경은 경동맥으로부터 분리되지만 전극 커프스 주위에 배치되지 않을 때 짧은 설계 신경).

4. 청각 공포 컨디셔닝

참고 :이 실험의 목표는 멸종을 강화하기 때문에이 공포 조건화 프로토콜은 대부분보다 21 더 많이 사용합니다. 쉽게 소멸 가벼운 두려움 컨디셔닝, 바닥 효과는 이러한 개선을 모호하게 할 수 있습니다.

  1. 음식과 물에 대한 광고 무제한 액세스 할 수있는 12 시간의 빛 / 어둠주기에 집 동물. 수술에서 회복하는 동안 매일 동물을 처리합니다.
  2. 사운드 감쇠 챔버 (그림 2C)에 보관 조건화 상자로 구성, 조절 및 테스트 장치를 설정합니다. 조건화 상자는, 20 × 20 ​​× 20 ​​㎝의 투명한 플라스틱 벽을 갖고, 발 충격 발생기에 연결된 스테인레스 그리드 바닥을 갖는다. 비디오 녹화 실을 조명 백악관 빛을 사용합니다. 9 kHz에서, 조건 자극으로 85dB SPL 톤을 사용합니다.
  3. 조작 적 상자 위, 챔버 내부에있는 디지털 카메라를 사용하여 기록 동작. 보고 동작 공간 외부에있는 컴퓨터의 세션을 모니터링한다. 나중에 분석을위한 비디오를 저장합니다.
  4. 후각 신호를 제거하기 전에 각 세션 후 70 % 에탄올로 챔버를 닦아주십시오.
  5. 이일 (그림 3A)의 쥐를 두려움은 조건. 쥐에없는 것을 확인첫 날 5 톤 (9 kHz에서, 85dB, 30 초)을 제시하여 톤의하게도 두려워. 동결 수준은 무시할 수 있는지 확인합니다.
    1. 2 일 연속 각각 8 톤 footshock (1 초, 0.5 mA) 짝과 초기 톤 프리젠 테이션을 따르십시오. 두 번째 날에 다시 톤 footshock의 짝을 반복합니다. 모든 시험에 대한 3 분의 평균, 2, 4 분 사이의 상호 자극 간격 (ISI)를 다릅니다. 충격 톤 중 발생하는 지점을 무작위.
  6. 셋째 날, 톤 / 충격 협회의 강도를 테스트합니다. footshocks의 부재 (3)의 ISI, 4, 또는 5 분 (4 분 평균) 4 톤을 플레이 톤 프레젠테이션 동안 및 조건 공포 반응의 대책으로서 인터 - 자극 간격 동안 동물 동결 행동을 기록 (CFR).
  7. 하루에 4 일, VNS 또는 위장 VNS와 멸종 훈련을 시작한다.
    1. stimulato에서 남성 커넥터를 삽입하여 자극에 쥐를 연결자극 부위에 입력 r에. 챔버 (그림 2A, 2C)에 배치 할 동물. 30 Hz에서 0.4 mA, 500 μs의 펄스 폭에 자극을 설정합니다. 30.15 초 총 지속 기간으로 설정 자극은, 톤의 개시 전에 150 밀리 초를 시작. (단계 4.6에서와 같이) 동물 4 톤을 플레이 VNS 또는 위장 VNS 각 톤 프리젠 테이션을 쌍.
  8. 주기적 오실로스코프를 이용하여 커프 및 입력 위치의 전기적 무결성을 테스트.
    1. 정상에 동물을 연결하고 오실로스코프로 자극기의 출력을 분할합니다.
    2. 20 V -20 V와 오실로스코프의 범위를 설정하고 자극을 실행합니다. 30 Hz에서 자극의 파형은 오실로스코프에 볼 수 있어야합니다. 크기 10 V를 초과 자극은 높은 임피던스와 부적절하게 작동 커프 또는 자극 입력 사이트에서 연결을 나타냅니다.
  9. 흡광 훈련 VNS의 효과를 테스트하기 (단계 4.6에서와 같이) 제 CFR 테스트를 실행할하루 5. 기록에 시간이 톤 프리젠 테이션 동안 동결 및 제 CFR 시험 (단계 4.6) 동안 기록 기준 동결 비교 보냈다.
  10. 처리 조건에 눈이 독립적 인 관찰자를 사용하여 비디오를 분석합니다. 스톱워치를 사용하여 톤 프리젠 테이션 동안 동결 소요되는 시간을 측정한다. 냉동은 쥐가 빠른 호흡을 전시하는 동안 완전한 부동, 저하 머리로 정의하고, 발 (22) 전염됩니다. 동결 동작의 분석은 두 단계로 분할 될 수있다 : 톤 및 프레젠테이션 중에 자극 간 간격 동안.

이 필드를 유발 전위 생체 녹음 5.

참고 :이 단계는 선택 사항입니다. 필드 유발 전위 (EFPs)는 표준 절차 (23, 24) 다음 정위 장치에 장착 된 이소 플루 란-마취 쥐에 복직의 테스트 후 24 시간 (5 일)를 기록하고 있습니다.

  1. 수집 및 모든 도구를 소독.
  2. 투명한 플라스틱 용기 내의 이소 플루 란 (5 %에서 100 % 산소 유량 1리터 / 분)으로 마취를 유도한다. TOE 및 / 또는 테일 핀치에 응답하여 동물의 발성과 빠짐 반사를 모니터하여 마취면의 깊이를 평가한다. 눈을 보호하기 위해 미네랄 오일 또는 안연고를 사용한다.
  3. 마르케 피하 머리의 상단에 0.05 ml에 주입하고, 덩어리가 분산 할 수 있습니다. 두개골에서 headcap을 제거하는 메스와 지혈제를 사용합니다. 브레 그마을 모호하게하는 것을 피하기 위해 가능한 적은 힘을 사용한다.
  4. 정위 기기에서 동물을 놓습니다. 람다와 브레 그마 모두 노출 절개를 확대하기 위해 메스를 사용합니다. 노즈콘을 통해 이소 플루 란 (100 % 산소 3 %, 유량 1 L / 분)로 마취 평면을 유지한다.
  5. infralimbic 전두엽 피질 (IL) 및 기저 편도 (BLA) 위의 두개골에 구멍을 뚫습니다. 유리 미세 전극 (2M KCl을 1-2 옴 저항) 내려 BLA에 (D / V를 : 7.2, A / P : 2.7, M은 / L : 브레 그마 4.9)과 stimulat내측 전두엽 피질의 일리노이 지역에 이온 전극 (D / V : 4.6, A / P : 3.0, M / L : 브레 그마 0.7) (그림 4A).
  6. BLA에 EFPs을 불러 일으키는 IL을 자극한다. 도 4에 도시 된 데이터는 다음과 같은 설정으로 취득되었다 : 최대 필드 응답을 유발 최소 전류 강도의 40 %에 해당 자극 강도를 사용하여, 0.3 msec의 지속 기간의 자극 펄스 (이전에 결정된 입출력 곡선에 기초 기준 데이터의 수집), 매 15 초를 전달했다.
  7. 시냅스 가소성을 유도하기 전에 15 분 - 10의 최소 기준 데이터를 수집합니다.
    참고 : 실험의 요구 사항에 따라 달라질 수 시냅스 가소성을 연상 조심스럽게 각각의 실험에 의해 선택해야합니다 사용되는 프로토콜입니다. 그림 (c)의 데이터는 그대로 보여주고 최소 전류 세기에서 20 초 간 버스트 간격으로 50 Hz에서 (2 초)에 100 펄스의 3 버스트를 다음 EFP의 변화를 보여줍니다최대 필드 응답을 거라고.
  8. 필드 전위의 극성의 피크에 대응하는 25 밀리 초 자극 인공물 후 - 자극 인공물 전에 5 밀리 초 윈도우의 평균 사이의 차이와 약 20도 5 밀리 초 윈도우의 평균으로 EFP의 진폭을 측정한다. 기준에 데이터를 정규화 100 %로 10 분 기준의 평균을 설정합니다. EFP 진폭의 장기적인 변화를 평가하기 - (50 분 포스트 유도 예를 들어, 40) 소성 유도 한 후 다른 10 분 기간의 평균 EFP 진폭을 사용합니다.
  9. 녹화 종료 후 마취 된 동물의 목을 벨 뇌의 압축을 풉니 다. 전극 배치의 조직 학적 확인을 위해 조직을 준비합니다.

결과

이 섹션은 래트에서 에어컨 공포 반응의 발현을 감소시키기 위해 흡광 학습과 VNS 조합을 사용하여 얻을 수있다 결과의 예를 도시한다. 일 1, 2 (청각 공포 컨디셔닝)의 경우, 쥐 footshocks를 톤와 결합 된에 청각 공포 조건화 작업에 대한 교육을했다. 3 일 (전처리 시험)에서 톤이 동결 수준을 측정하고 조절 공포 응답 수집을 유추 footshocks의 부재에 제시 하였다. 4 일에 (치료) 쥐 그룹 별 멸종 훈련과 ?...

토론

우리는 여기 컨디셔닝 큐 (19)에 노출 단일 세션에서 컨디셔닝 두려움의 멸종을 촉진하고 infralimbic 피질과 소멸 (20) 학습 중재 할 수 있습니다 기저 편도체 사이의 경로에 가소성을 조절하는 데 사용되는 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜의 성공을위한 중요한 단계는 멸종 트레이닝 동안 VNS의 적절한 전달합니다. 따라서, 특별한주의 커프 전극의 구성 및 미주 신경 주위 커프스의 ...

공개

The authors have no competing interests or conflicts.

감사의 말

This research was supported by the National Institute of Mental Health MH 086960-01A1 (Christa K. McIntyre).

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Alcohol
AtropineFisherA0132-5G
BetadineHenry Schein69066950
Hydrogen peroxide CVS209478
KetamineHenry Schein 1129300
MarcaineHenry Schein6312615
Mineral OilCVS152355
NeosporinCVS629451
OxygenHome Depot304179
PennicillinFisherPENNA-10MU
PropaneHome Depot304182
XylazineHenry Schein4019308
Tools
Jewelery TorchSmith Equipment23-1001D
Sewing NeedleWalgreens441831
#5 Forceps (2)Fine Science Tools11254-20
Soldering IronHome Depot 203525863
AmScope SM-4TX-144A 3.5X-45X Circuit Board Boom Stereo Microscope + 144 LEDAmScopeSM-4TX-144A
Helping HandsA-M Systems 726200
Scalpel Blade HolderFine Science Tools10003-12
Metal FileHome Depot6601
RulerHome Deopt202035324
Curved Hemostats Fine Science Tools130009-12
Fine ScissorsFine Science Tools14058-09
SpatulaFine Science Tools
Small ScrewdriverHome Depot646507
Magnetic Fixator Retraction SystemFine Science Tools18200-04, 18200-01, 18200-05
Heating PadWalgreens30294
ClippersWalgreens277966
SharpieStaples125328
Ring ForcepsFine Science Tools11103-09
Custom Micropipette Glass Tools (J shape and Straight) - Borosilicate glassSutter InstrumentB150-110-10
Adson ForcepsFine Science Tools11006-12
Cuffs
TubingBraintree Scientific IncMRE-065
Platinum Iridium WireMedwire10IR9/49T
Gold PinsMill-Max1001-0-15-15-30-27-04-0
Suture ThreadHenry Schein100-5797
22 G NeedlesFisher 14-815-525
Paper TapeFisher 03-411-602
SolderHome Deopt327793
Flux Home Deopt300142
Scalpel Blade, 10 or 15Stoelting52173-10
Silastic Laboratory Tubing .51 mm ID x .94 mm ODFisher 508-002
Headcaps
Connector Pieces (male)Omnetics Connector CorporationA25001-004
Headcap pieces (female)Omnetics Connector CorporationA24001-004
Teets Dental Acrylic, Liquid and PowderA-M Systems525000, 526000
26 Gauge Solid Copper WireStaples1016882  
Surgery
Bone ScrewsStoelting+CB33:C6151457
Scalpel Blades, 10 or 15Stoelting52173-10
1 ml syringesFisher14-826-261
22 G NeedlesFisher 14-815-525
27 G NeedlesFisher14-826-48
2" x 2" GauzeFisher22-362-178
SwabsFisher19-120-472
Puppy PadsPetCo1310747
Kim WipesFisher06-666-A
Chamber and Behavioral Setting 
Husky Metal Front Base Cabinet (30WX19DX34H)Home Depot100607961
Quiet Barrier­ HD Soundproofing Material (Sheet) (PSA)soundproofcow.com10203041
Convoluted Acoustic Foam Panelsoundproofcow.com10432400
Isolated Pulse Stimulator Model 2100A-M Systems720000
Digital Camera - Logitech Webcam C210LogitechB003LVZO88
MatLabMathworks.com
Sinometer 10MHz Single Channel OscilloscopeSinometerCQ5010C
OxyLED T-01 DIY Stick-on Anywhere 4-LED Touch Tap LightOXYLEDB00GD8OKY0
5k ohm potentiomterAlpha ElectronicsB00CTWDHIO
Extech 407730 40-to-130-Decibel Digital Sound Level MeterExtech InstrumentsB000EWY67W
DSCK-C Dual Output, scrambled shockerKinder Scientific Co

참고문헌

  1. Quirk, G. J., Mueller, D. Neural mechanisms of extinction learning and retrieval. Neuropsychopharmacol. 33 (1), 56-72 (1038).
  2. Milad, M. R., Orr, S. P., Lasko, N. B., Chang, Y., Rauch, S. L., Pitman, R. K. Presence and acquired origin of reduced recall for fear extinction in PTSD: results of a twin study. J Psychiat Res. 42 (7), 515-520 (2008).
  3. Jovanovic, T., Norrholm, S. D., Blanding, N. Q., Davis, M., Duncan, E., Bradley, B., Ressler, K. J. Impaired fear inhibition is a biomarker of PTSD but not depression. Depress Anxiety. 27 (3), 244-251 (2010).
  4. Norrholm, S. D., et al. Fear extinction in traumatized civilians with posttraumatic stress disorder: relation to symptom severity. Biol Psychiat. 69 (6), 556-563 (2011).
  5. Phelps, E. A., LeDoux, J. E. Contributions of the amygdala to emotion processing: from animal models to human behavior. Neuron. 48 (2), 175-187 (2005).
  6. Pape, H. C., Paré, D. Plastic synaptic networks of the amygdala for the acquisition, expression, and extinction of conditioned fear. Physiol Rev. 90 (2), 419-463 (2010).
  7. Engineer, N. D., et al. Reversing pathological neural activity using targeted plasticity. Nature. 470 (7332), 101-104 (2011).
  8. Porter, B. A., et al. Repeatedly pairing vagus nerve stimulation with a movement reorganizes primary motor cortex. Cereb Cortex. 22 (10), 2365-2374 (2012).
  9. Hays, S. A., et al. Vagus nerve stimulation during rehabilitative training improves functional recovery after intracerebral hemorrhage. Stroke. 45, 3097-3100 (2014).
  10. Khodaparast, N., et al. Vagus nerve stimulation delivered during motor rehabilitation improves recovery in a rat model of stroke. Neurorehab Neural Re. 28 (7), 698-706 (2014).
  11. Clark, K. B., Krahl, S. E., Smith, D. C., Jensen, R. A. Post‐training unilateral vagal stimulation enhances retention performance in the rat. Neurobiol Learn Mem. 63 (3), 213-216 (1995).
  12. Clark, K. B., Smith, D. C., Hassert, D. L., Browning, R. A., Naritoku, D. K., Jensen, R. A. Posttraining electrical stimulation of vagal afferents with concomitant vagal efferent inactivation enhances memory storage processes in the rat. Neurobiol Learn Mem. 70 (3), 364-373 (1998).
  13. Clark, K. B., Naritoku, D. K., Smith, D. C., Browning, R. A., Jensen, R. A. Enhanced recognition memory following vagus nerve stimulation in human subjects. Nat. Neurosci. 2, 94-98 (1999).
  14. McGaugh, J. L. amygdala modulates the consolidation of memories of emotionally arousing experiences. Annu Rev Neurosci. 27, 1-28 (2004).
  15. McGaugh, J. L., Roozendaal, B. Role of adrenal stress hormones in forming lasting memories in the brain. Curr Opin Neurobiol. 12, 205-210 (2002).
  16. Miyashita, T., Williams, C. L. Epinephrine administration increases neural impulses propagated along the vagus nerve: Role of peripheral beta-adrenergic receptors. Neurobiol Learn Mem. 85 (2), 116-124 (2006).
  17. Williams, C. L., Men, D., Clayton, E. C., Gold, P. E. Norephinephrine release in the amygdala after systemic injection of epinephrine or escapable footshock: contribution of the nucleus of the solitary tract. Behavioral Neurosci. 112 (6), 1414-1422 (1998).
  18. Liang, K. C., Juler, R. G., McGaugh, J. L. Modulating effects of post-training epinephrine on memory: involvement of the amygdala noradrenergic system. Brain Res. 368 (1), 125-133 (1986).
  19. Peña, D. F., Engineer, N. D., McIntyre, C. K. Rapid remission of conditioned fear expression with extinction training paired with vagus nerve stimulation. Biol Psychiat. 73 (11), 1071-1077 (2013).
  20. Peña, D. F., Childs, J. E., Willett, S., Vital, A., McIntyre, C. K., Kroener, S. Vagus nerve stimulation enhances extinction of conditioned fear and modulates plasticity in the pathway from the ventromedial prefrontal cortex to the amygdala. Front Behav Neurosci. 8 (327), (2014).
  21. Maren, S. Overtraining does not mitigate contextual fear conditioning deficits produced by neurotoxic lesions of the basolateral amygdala. J Neurosci. 18 (8), 3088-3097 (1998).
  22. Blanchard, R. J., Blanchard, D. C. Crouching as an index of fear. J Comp Physiol Psych. 67 (3), 370-375 (1969).
  23. Maroun, M. Stress reverses plasticity in the pathway projecting from the ventromedial prefrontal cortex to the basolateral amygdala. Eur J Neurosci. 24 (10), 2917-2922 (2006).
  24. Moussawi, K., et al. N-Acetylcysteine reverses cocaine-induced metaplasticity. Nat Neurosci. 12, 182-189 (2009).
  25. Paintal, A. S. Vagal sensory receptors and their reflex effects. Physiol. Rev. 53 (1), 159-227 (1973).
  26. Aalbers, M., Vles, J., Klinkenberg, S., Hoogland, G., Majoie, M., Rijkers, K. Animal models for vagus nerve stimulation in epilepsy. Exp Neurol. 230 (2), 167-175 (2011).
  27. Ricardo, J. A., Koh, E. T. Anatomical evidence of direct projections from the nucleus of the solitary tract to the hypothalamus, amygdala, and other forebrain structures in the rat. Brain Res. 153, 1-26 (1978).
  28. Takigawa, M., Mogenson, G. J. A study of inputs to antidromically identified neurons of the locus coeruleus. Brain Res. 135 (2), 217-230 (1977).
  29. Groves, D. A., Bowman, E. M., Brown, V. J. Recordings from the rat locus coeruleus during acute vagal nerve stimulation in the anaesthetised rat. Neurosci Lett. 379 (3), 174-179 (2005).
  30. Manta, S., Dong, J., Debonnel, G., Blier, P. Enhancement of the function of rat serotonin and norepinephrine neurons by sustained vagus nerve stimulation. J Psychiatr Neurosci. 34 (4), 272-280 (2009).
  31. Manta, S., El Mansari, M., Debonnel, G., Blier, P. Electrophysiological and neurochemical effects of long-term vagus nerve stimulation on the rat monoaminergic systems. Int J Neuropsychoph. 16 (2), 459-470 (2013).
  32. Dorr, A. E., Debonnel, G. Effect of vagus nerve stimulation on serotonergic and noradrenergic transmission. J Pharmacol Exp Ther. 318, 890-898 (2006).
  33. Follesa, P., et al. Vagus nerve stimulation increases norepinephrine concentration and the gene expression of BDNF and bFGF in the rat brain. Brain Res. 1179 (7), 28-34 (2007).
  34. Biggio, F., et al. Chronic vagus nerve stimulation induces neuronal plasticity in the rat hippocampus. Int J Neuropsychoph. 12 (9), 1209-1221 (1017).
  35. Nichols, J. A., Nichols, A. R., Smirnakis, S. M., Engineer, N. D., Kilgard, M. P., Atzori, M. Vagus nerve stimulation modulates cortical synchrony and excitability through the activation of muscarinic receptors. Neuroscience. 189, 207-214 (2011).
  36. Peters, J., Kalivas, P. W., Quirk, G. J. Extinction circuits for fear and addiction overlap in prefrontal cortex. Learn Memory. 16, 279-288 (2009).
  37. Ji, J., Maren, S. Hippocampal involvement in contextual modulation of fear extinction. Hippocampus. 17 (9), 749-758 (2007).
  38. Roosevelt, R. W., Smith, D. C., Clough, R. W., Jensen, R. A., Browning, R. A. Increased extracellular concentrations of norepinephrine in cortex and hippocampus following vagus nerve stimulation in the rat. Brain Res. 1119 (1), 124-132 (2006).
  39. Hassert, D. L., Miyashita, T., Williams, C. L. The effects of peripheral vagal nerve stimulation at a memory-modulating intensity on norepinephrine output in the basolateral amygdala. Behav Neurosci. 118 (1), 79-88 (2004).
  40. Ura, H., et al. Vagus nerve stimulation induced long-lasting enhancement of synaptic transmission and decreased granule cell discharge in the hippocampal dentate gyrus of urethane-anesthetized rats. Brain Res. 1492, 63-71 (2013).
  41. Zuo, Y., Smith, D. C., Jensen, R. A. Vagus nerve stimulation potentiates hippocampal LTP in freely-moving rats. Physiol Behav. 90 (4), 583-589 (2007).
  42. Shen, H., Fuchino, Y., Miyamoto, D., Nomura, H., Matsuki, N. Vagus nerve stimulation enhances perforant path-CA3 synaptic transmission via the activation of β-adrenergic receptors and the locus coeruleus. Int J Neuropsychophl. 15 (4), 523-530 (2012).
  43. Fibiger, H. C., Mason, S. T. The effects of dorsal bundle injections of 6-hydroxydopamine on avoidance responding in rats. Bitr J Pharmacol. 64 (4), 601-605 (1978).
  44. Mason, S. T. Fibiger H.C. 6-OHDA lesion of the dorsal noradrenergic bundle alters extinction of passive avoidance. Brain Res. 152, 209-214 (1978).
  45. McGaugh, J. L. Memory consolidation and the amygdala: a systems perspective. Trends Neurosci. 25 (9), 456-461 (2002).
  46. LaLumiere, R. T., Niehoff, K. E., Kalivas, P. W. The infralimbic cortex regulates the consolidation of extinction after cocaine self-administration. Learn Memory. 17, 168-175 (2010).
  47. Mueller, D., Cahill, S. P. Noradrenergic modulation of extinction learning and exposure therapy. Behav Brain Res. 208 (1), 1-11 (2010).
  48. Smith, R. J., Aston-Jones, G. α(2) Adrenergic and imidazoline receptor agonists prevent cue-induced cocaine seeking. Biol Psychiat. 70 (8), 712-719 (2011).
  49. Buffalari, D. M., Baldwin, C. K., See, R. E. Treatment of cocaine withdrawal anxiety with guanfacine: relationships to cocaine intake and reinstatement of cocaine seeking in rats. Psychopharmacol. (Berl). 223 (2), 179-190 (2012).
  50. De Ridder, D., Vanneste, S., Engineer, N. D., Kilgard, M. P. Safety and efficacy of vagus nerve stimulation paired with tones for the treatment of tinnitus: a case series). Neuromodulation. 17 (2), 170-179 (2014).
  51. Hays, S. A., et al. The timing and amount of vagus nerve stimulation during rehabilitative training affect poststroke recovery of forelimb strength. Neuroreport. 25, 676-682 (2014).

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