כמו כריך microenvironments לרתום ניידים / חומרי אינטראקציות

Summary

The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.

Abstract

תרבית תאים בוצעה באופן מסורתי על מצעים דו-ממדי (2D) שבו תאים לדבוק באמצעות קולטנים הגחון אל פני השטח בחומר ביולוגי. עם זאת in vivo, רוב התאים מוקפים לחלוטין על ידי מטריקס (ECM), וכתוצאה מכך הפצה תלת ממדי (3D) של קולטנים. זה עלול לעורר הבדלים במחוץ-במסלולי איתות וכך בהתנהגות תא.

מאמר זה מראה שגירוי קולטני הגב של תאים כבר דבקו מצע 2D ידי כיסה סרט של חומר חדש (תרבות כמו כריך) מפעיל שינויים חשובים ביחס לתרבויות 2D סטנדרטיים. יתר על כן, העירור הזמני של קולטני הגחון ועל גב משמרות התנהגות תא קרוב יותר לזה שנמצא בסביבות 3D. בנוסף, בשל אופייה של המערכת, תרבות כמו כריך הוא כלי רב-תכליתי שמאפשר הלימוד של פרמטרים שונים בתא / inte חומרractions, למשל, טופוגרפיה, נוקשות וציפוי חלבון שונה בשני הצדדים הגחון ועל גב. לבסוף, מאז תרבויות כמו כריך מבוססות על מצעי 2D, מספר הליכי ניתוח כבר פיתחו לתרבויות 2D סטנדרטיים יכול לשמש בדרך כלל, להתגבר על הליכים מורכבים יותר הנדרשים למערכות 3D.

Introduction

באופן מסורתי, תרבית תאים בוצעה על מצעים דו-ממדיים (2D), שרוב microenvironments הסלולרי in vivo יש לי טבע תלת ממדי (3D). סביבת 2D לא טבעית זה גורמת לשינויים בהתנהגות תא כדרך של הסתגלות עצמית לעולם שטוח, המשפיעה ישירות על תא גורל ^1,2. לפיכך, תוצאות שהתקבלו בתרביות תאי 2D לא תמיד לשחזור in vivo. זה עודד את הפיתוח של מערכות תרבות הרלוונטיות חדשות המבקשות לספק תנאים כמו-פיסיולוגיים יותר כדי לקבל תובנות נוספות כל ^3,4 מנגנון ביולוגי ממד תלוי.

אחד ההבדלים העיקריים בין תרבות 2D ו3D בסביבת vivo הוא ההפצה של קולטני תא מעוגן למטריצה ​​תאית (ECM): בעוד ב2D מצעי תאים לדבוק ventrally, רוב התאים בגוף חי מוקפות לחלוטין על ידי ECM ו כך לסה"נהידבקות ll מתרחשת באמצעות הפצת 3D של הקולטנים. זה מעורר מסלולי איתות הידבקות תאים שונים ובכך ויסות תהליכים חשובים כגון צמיחת תאים, התמיינות תאים וביטוי גנים. במהלך העשורים האחרונים, מערכות תרבות 3D שונות הוקמו ^5-8, אם כי שונות והמורכבות שלהם לעכב סטנדרטיזציה שלהם בהליכי תרבות תא משותף. יתר על כן מערכות 3D הן בדרך כלל לא קלה לטפל ופרוצדורות הנוכחיות על מצעי 2D לא ניתן לקבוע בקלות לתרבויות 3D. בנוסף, רק לעתים נדירות ספרות משווה תרבויות 3D עם מצב 2D שווה הערך או מערכות אחרות 3D, פוגע ההבנה הנכונה של התנהגות תא במודלים אלה.

ברגע שיש את התאים דבקים על מצע 2D, העירור של קולטני גב - על ידי שכיסה סרט של חומר חדש (תרבות כמו כריך) - יכול לעורר תגובות תא אחד סביבות 3D. המחשבהבן מאחורי זה הוא ההפעלה בו זמנית של שני גב וגחון קולטנים לדבוק והתפשט בתוך סביבת הכריך (איור 1) ^9,10. כתוצאה מכך, תאים עוברים שינויים חשובים ביחס לתרבויות 2D ^11,12. כך, גורל תא נקבע במהלך עצרת בגלל תרבות הכריך, מאז גירוי הגב מפעיל שינויים במסלולים סלולריים מפתח. לכן, גורל התא נקבע מאוד על ידי הזמן שבו התרבות כמו הכריך מורכבת ^11.

בשל אופייה של המערכת, תרבות כמו כריך היא כלי פשוט ורב-תכליתי שמאפשר הלימוד של פרמטרים שונים באינטראקציות תא / חומר כגון ציפויי כימיה, טופוגרפיה, נוקשות וחלבון בשני הצדדים הגחון ועל גב. זו מציעה רמה גבוהה יותר של גמישות בהשוואה למערכות אחרות 3D (איור 2) בשל הגב העצמאי ושילוב הגחון של נ 'רחבariety של תנאי שטח. בנוסף, ניתן ללמוד שורות תאים שונות ובזמנים שונים כדי להרכיב את התרבות כמו כריך, הגדלת הספקטרום הרחב של אפשרויות.

פרוטוקול סטנדרטי של התרבות כמו כריך מפורט להלן או באמצעות פולי-L-לקטית סיבי electrospun חומצה (PLLA) או סרטים כמו מצעי גב, coverslip זכוכית כמצע הגחון ופיברונקטין כציפוי חלבון. תרבויות כמו כריך נאספו רק לאחר זריעת תאים או אחרי 3 שעות של תרבות 2D. עם זאת, שימו לב שיכולים לשמש מערכות חומר אחרות וחלבונים; כמו כן התרבות כמו כריך ניתן להרכיב בנקודות זמן שונות.

Protocol

1. ייצור מצעים הגבי

1. הפקת סרט שטוח של PLLA ידי יציקת ממס.
   1. לעבוד במנדף להכין פתרון של 2% (w / v) PLLA בכלורופורם (2 PLLA גרם ל -100 מיליליטר כלורופורם) על ידי ערבוב בטמפרטורת חדר (RT) עד שהיא נמסה לחלוטין (3 שעות בערך).
   2. מניחים את מנקי בצלחת פטרי מזכוכית.
      הערה: מכונות כביסה הנירוסטה שימוש עם קוטר פנימי של 10.5 מ"מ (מעט קטן יותר מאשר קוטר מדגם הגחון), כך שמכונת הכביסה מוצבת על גבי מצע הגחון. יכולים לשמש חומרים אחרים כגון polytetrafluoroethylene (PTFE) או מכונות כביסה זכוכית גם כן.
   3. הוסף 200 μl של פתרון PLLA במכונת הכביסה ולתת להתאדות לאט למשך 30 דקות ב RT. על מנת לאפשר אידוי איטי של הממס, לסגור את צלחת פטרי עם רדיד אלומיניום עם כמה חורים.
   4. מחממים את הדגימות ב 120 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי להתאדות עקבות ממס.
   5. בואו דוגמאות מגניב לעשותwn ב RT.
   6. ברגע שהדגימות התקררו (30 דקות בערך), לכסות עם 18.2 MΩ · מים סנטימטר בצלחת פטרי והדגירה של 8 דקות ב RT.
      הערה: אם הדגימות לא התקררו לחלוטין, ייתכן שהם תופסים 18.2 MΩ · מים סנטימטר ולאמץ מדינת גומי. בנוסף, דוגרים ב18.2 MΩ · מים סנטימטרים פחות מ -8 דקות עלול לגרום לניתוק לא תקין, ובמשך יותר מ -8 דקות בניתוק ממכונת הכביסה.
   7. עם סכין גילוח, לחטט מנקי לקלף אותם מצלחת פטרי.
   8. הסר את כל פגמים מהקצה של מכונת הכביסה עם פינצטה ולתת דגימות האוויר יבשה.
   9. אחסן את הדגימות בייבוש ואקום (80 mbar) עד ליום של הניסוי כי PLLA הוא מתכלה על ידי הידרוליזה.
2. ייצור של סיבי PLLA ידי electrospinning.
   1. לעבוד במנדף להכין פתרון של 8% (w / v) PLLA בhexafluoroisopropanol (PLLA 8 גרם ב 100 מיליליטר hexafluoroisopropanol) על ידי stirring ב RT עד נמס לגמרי (3 שעות בערך).
   2. מניחים את polytetrafluoroethylene (PTFE) מכונות כביסה בגיליון אלומיניום או בתוף לelectrospinning על מנת לקבל סיבים אקראיים או מיושר בהתאמה.
      הערה: השתמש polytetrafluoroethylene (PTFE) מכונות כביסה עם קוטר פנימי של 10.5 מ"מ (מעט קטן יותר מאשר קוטר מדגם הגחון), כך שמכונת הכביסה מוצבת על גבי מצע הגחון. יכולים לשמש חומרים אחרים כגון מכונות כביסה פלדת אל-חלד או זכוכית, כמו גם. התוף צריך לסובב במהירות הזוויתית של 160.7 שניות ^-1 (רדיוס = 7 סנטימטרים) על מנת לקבל סיבים מיושרים. מהירות איטית יותר עשויה שלא לגרום ליישור סיבים ומהירות גבוה יותר תגרום לסיבים השבורים.
   3. טען את המזרק עם פתרון הפולימר ולמקם אותו על משאבת המזרק.
   4. Electrospin פתרון PLLA באמצעות קצב זרימה 0.9 מיליליטר / שעה עם מתח של 30 וולט ומרחק אספן של 12 סנטימטר.
   5. לעצור את התהליך האחורי electrospinningאה 20-30 דקות, פעם בצפיפות סיבים טובה מושגת (מאז תאים צריכים אינטראקציה עם כמה סיבים בו זמנית).
   6. מחממים את הדגימות ב 120 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי להתאדות עקבות ממס.
   7. אחסן את הדגימות בייבוש ואקום (80 mbar) עד ליום של הניסוי כי PLLA הוא מתכלה על ידי הידרוליזה.

תרבות 2. סנדוויץ

1. להרכיב את התרבות כמו כריך פעם תאים דבקו במצע 2D הגחון.
   1. העבודה במנדף תרבות על מנת להבטיח תנאים סטריליים ולעקר את כל החומרים (coverslips זכוכית, מצעי גב, פינצטה, וכו ') על ידי חשיפה לקרינת UV למשך 30 דקות.
   2. מעיל מצע הגחון ועל גב עם פיברונקטין כדי לכוון הידבקות תא חלבון ספציפית. כדי לעשות זאת, דגירה הדגימות ב -20 / מיליליטר מיקרוגרם של פיברונקטין מומס בפוספט שנאגר מלוח של Dulbecco (DPBS) המכיל Ca ^{2 +} וMg ^{2 +} (200 μl / sשפע) במשך שעה 1.
      הערה: בשל תהליך הייצור, יש לי מצעי גב צדדים העליונים ותחתונים מיועדים כי סיבי סרט וelectrospun ממס יציקה מצורפים לאחד הצדדים של מכונת הכביסה. הצד הזה הוא אפוא אחד מול התאים (איור 3).
      1. לאחר ציפוי החלבון, לשטוף את הדגימות פעמיים עם DPBS כדי להסיר חלבון בעודף. אז דגירה דגימות בDPBS עד לשימוש שלהם על מנת למנוע דגימות ממקבלים יבש מאז זה גורם שלילת אזרחות חלבון. DPBS שימוש המכיל Ca ^{2 +} וMg ^{2 +} מאז קטיונים דו ערכיים להסדיר קיפול חלבונים.
   3. תאי זרע על הזכוכית coverslips ^13.
      הערה: כתרבות כמו כריך מבוססת על מצעי 2D, זריעת תאים תבוצע באופן דומה כמו על מדגם 2D. לדוגמא, והיצמדות למנגנון C2C12 הם זורעים ב17,500 תאי סנטימטר ^-1 לניסויי בידול ופיברובלסטים NIH3T3 הם זורעים ב7,000 גסנטימטר אמות ^-1 לתרבויות מבודדות ללמוד מורפולוגיה תא והדבקה.
   4. מניחים את הדגימות בחממה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO ₂ ולאפשר לתאים לדבוק במצע הגחון במשך 3 שעות.
   5. מניחים את מצע זרע הגחון בבאר חדשה של צלחת 12 רב-היטב (שבו מנקי יתאימו).
      הערה: הרכבת התרבות כמו כריך בבאר חדשה היא אחת דרכים להיפטר מהתאים שדבקו בתחתית הבאר לאחר הזריעה שכן אלה יצרכו חומרים מזינים ומפרישים גורמי גדילה ופסולת המשפיעים על תאים בתרבית בתוך מערכת כמו כריך. זוהי גם חובה לעקירות סלולריות כדי lyse רק התאים בתרבית בתוך הסביבה כמו הכריך.
   6. בזהירות ובעזרת פינצטה, כיסוי המצע הגבי בתאים. למלא עם מדיום (1 מיליליטר) ולדגור על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO _2.
      הערה: המשקל של מכונת הכביסה ימנע תת הגבstrate מצפה.
   7. לשנות בינוני פעמיים בשבוע כמו בתרבויות 2D סטנדרטיים. אל תזיז את מצע הגב מאז זה עלול לגרום לניזק לתאים.
2. להרכיב את התרבות כמו כריך רק לאחר זריעת תאים.
   1. העבודה במנדף תרבות על מנת להבטיח תנאים סטריליים ולעקר את כל החומרים (coverslips זכוכית, מצעי גב, פינצטה, וכו ') על ידי חשיפה לקרינת UV למשך 30 דקות.
   2. מעיל מצע הגחון ועל גב עם פיברונקטין כדי לכוון הידבקות תא חלבון ספציפית. כדי לעשות זאת, דגירה הדגימות ב -20 מיקרוגרם / מיליליטר של פיברונקטין מומס בDPBS מכיל Ca ^{2 +} וMg ^{2 +} (200 μl / מדגם) במשך שעה 1.
      1. לאחר ציפוי החלבון, לשטוף את הדגימות פעמיים עם DPBS כדי להסיר חלבון בעודף. אז דגירה דגימות בDPBS עד לשימוש שלהם על מנת למנוע דגימות ממקבלים יבש מאז זה גורם שלילת אזרחות חלבון. DPBS שימוש המכיל Ca ^{2 +} Mg ו 2 + מאז קטיונים דו ערכיים להסדיר קיפול חלבונים.
   3. תאי זרע על coverslips זכוכית בבאר של צלחת 12 רב-היטב (שבו מנקי יתאימו). כדי לעשות זאת, השתמש השעיה סלולרית מרוכזת מאוד כדי להימנע מאובדן תא לאחר הנחת המצע הגבי.
   4. בזהירות ובעזרת פינצטה, כיסוי המצע הגבי בתאים. למלא עם מדיום (1 מיליליטר) ולדגור על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO _2.
      הערה: המשקל של מכונת הכביסה ימנע מצע הגבי מצף.
   5. לשנות בינוני פעמיים בשבוע כמו בתרבויות 2D סטנדרטיים.
      הערה: אל תזיז את מצע הגב מאז זה עלול לגרום לניזק לתאים.

3. ניתוח

הערה: תרבויות כמו כריך מבוססות על מצעי 2D, ולכן יכול להיות מנותחת בדרך כלל על ידי נהלים כבר פיתחו לתרבויות 2D סטנדרטיים. לדוגמא, מאז PLLA הוא שקוף וcelLS מוגבל לנוע בתוך המטוס XY, מיקרוסקופיה נעשה כעל מצעי 2D. נדידת תאים ניתן לנתח לכן כלתרבויות 2D, ללא הצורך במעקב אחר תאים בציר z כלתרבויות 3D, אשר מפשטת את ניתוח ניסוי ותמונה. כדי לחקור את assay ריפוי הפצע על ידי assay שריטה מעקב פרוטוקול זה:

1. הגירת מחקר תאים (assay ריפוי פצע) בתוך התרבות כמו כריך.
   1. העבודה במנדף תרבות על מנת להבטיח תנאים סטריליים ולעקר את כל החומרים (coverslips זכוכית, מצעי גב, פינצטה, וכו ') על ידי חשיפה לקרינת UV למשך 30 דקות.
   2. מעיל מצע הגחון ועל גב עם פיברונקטין כדי לכוון הידבקות תא חלבון ספציפית. כדי לעשות זאת, דגירה הדגימות ב -20 מיקרוגרם / מיליליטר של פיברונקטין מומס בפוספט שנאגר מלוח של Dulbecco (DPBS) המכיל Ca ^{2 +} וMg ^{2 +} עבור שעה 1.
      1. לאחר ציפוי החלבון, לשטוף את הדגימות פעמיים עם DPBSכדי להסיר חלבון בעודף. אז דגירה דגימות בDPBS עד לשימוש שלהם על מנת למנוע דגימות ממקבלים יבש מאז זה יכול לגרום לשלילת אזרחות חלבון. DPBS שימוש המכיל Ca ^{2 +} וMg ^{2 +} מאז קטיונים דו ערכיים להסדיר קיפול חלבונים.
   3. תאי זרע על coverslips הזכוכית בצפיפות גבוהה ^13.
   4. מניחים את הדגימות בחממה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO ₂ ולאפשר לתאים כדי להשיג נקודת המפגש.
   5. השתמש קצה פיפטה לגרד את monolayer התא על מנת לקבל 2 אוכלוסיות תאים מופרדות בפער.
   6. מניחים את מצע זרע הגחון בחדש גם מתאים לרכישת הזמן לשגות ובי מצעי גב יתאימו (כלומר 12 צלחת רב גם).
   7. בזהירות ובעזרת פינצטה, כיסוי המצע הגבי על התאים ולאחר מכן למלא עם מדיום (1 ​​מיליליטר לצלחת 12 רב גם).
      הערה: המשקל של מכונת הכביסה ימנע tהוא מגבה מצע מצף.
   8. מניחים את המדגם במיקרוסקופ הזמן לשגות (מוגדר 37 ° C ו 5% CO ₂₎ ולקחת תמונות של סגירת הפער בכל 20 דקות.
   9. נתח את סגירת הפער באמצעות תוכנה ספציפית כגון MiToBo התוסף מImageJ. ¹⁴

הערה: חלבון וחומצות גרעין חילוץ מתבצע באופן דומה כמו על מצעי 2D. יש רק צעד אחד נוסף שמורכב בפירוק התרבות כמו הכריך להוסיף למאגר תמוגה ישירות על התאים כדי להגביר את יעילות המיצוי. לדוגמא, להפקת mRNA:

2. לחלץ mRNA מתרבויות כמו כריך
   1. הכן את כל המאגרים מהערכה המסחרית בהתאם להוראות היצרן.
   2. קח את התרבות כמו כריך החוצה מהחממה.
   3. הסר את התקשורת והתרבות מהדגימות.
   4. שטוף את הדגימות פעם עם DPBS מכיל Ca2 + וMg ^{2 +} (1 מיליליטר) ולהסיר את כל הפתרון.
   5. בעזרת פינצטה, להסיר את מצע הגב ולהוסיף למאגר תמוגה (350 μl) למצע הגחון. כיסוי שוב מצע הגב על מצע הגחון כדי lyse גם התאים דבקו במצע הגבי.
   6. הסר את מצע גב לבודד את פתרון תמוגה.
   7. עקוב אחר ההוראות של היצרן כדי לקבל את ה- mRNA.

הערה: immunodetection של חלבונים יכול להיות גם הופיע כעל מצעי 2D. מאז תרבויות כמו כריך יכולות לעכב את דיפוזיה הנכונה של הנוגדנים ומאגרים, יש להגדיל פעמים דגירה. כמו כן, הכריך יכול להיות מפורק לפני תחילת הפרוטוקול מכתים אבל במקרה אחרון זה כמה תאים יישארו צמוד למצע הגב וחלק למצע הגחון.

3. חלבוני Immunodetect בתוך תרבות כמו כריך
   1. לשטוף את המדגם פעם אחת עם DPBS ולתקן עם פורמלין 4% PBS במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
      הערה: מצע הגבי ניתן להסיר בתהליך הקיבוע, כך שבעיות דיפוזיה נמנעות.
   2. לשטוף עם DPBS (1 מיליליטר) ולאחר מכן permeabilize עם 0.5% Triton X-100 בDPBS (1 מיליליטר) במשך 5 דקות ב RT.
   3. לחסום אתרי קישור הלא ספציפי עם אלבומין 1% בDPBS (1 מיליליטר) במשך 30 דקות ב RT.
   4. דגירה עם נוגדן ראשוני (2 מיקרוגרם / מיליליטר; 1 מיליליטר) בחסימת פתרון לשעה 3 ב RT.
   5. לשטוף 3 פעמים במשך 10 דקות עם DPBS / Tween% 0.5 (20 מיליליטר 1).
   6. דגירה 2 שעות עם נוגדנים משני (2 מיקרוגרם / מיליליטר) ו1 מיקרוגרם / מיליליטר DAPI בפתרון חסימה (1 מיליליטר) ב RT.
   7. לשטוף 3 פעמים במשך 10 דקות בDPBS / Tween% 0.5 (20 מיליליטר 1).
   8. לשטוף בDPBS.
      הערה: ניתן להרכיב דוגמאות בשקופית עם Vectashield ואטום עם לק כאשר מצעי גב יוסרו לפני immunodetection.
   9. שים לב תחת מייקר הקרינההיקף כלמצעי 2D סטנדרטיים.

תוצאות

הגירוי של הקולטנים גב בתוך התרבות כמו הכריך מפעיל שינויים במורפולוגיה תא, הידבקות תא ומסלולי איתות תאיות (למשל קינאז מוקדי הדבקה, FAK) ^10-12. כדוגמא, fibroblasts תרבית בתוך המערכת כמו כריך ביטוי יתר למקטע integrin α ₅ לעומת 2D, כפי שנצפה לתרבויות אחרות 3D ^15,16.

Discussion

כיום, תרבות 3D הוא נושא חשוב לתעשיית התרופות ביוטכנולוגיות וכמו גם מחקר בביולוגיה של תא, כוללים סרטן ותאי גזע. כתוצאה מכך כמה מערכות תרבות 3D פותחו. למרבה הצער, הבדלים בין מערכות 3D בדרך כלל התוצאה של התנהגות תא שונה, מעכבת את ההבנה של גורל תא. חוץ מזה, הפרוצדורות הן בדרך כ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ploy(lactic acid)	NatureWorks	4042D	Reagent
Cover glasses (12 mmØ)	Marienfeld	631-0666	Equipment
Chloroform	Scharlab	CL0200	Reagent
1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP)	Sigma	105228	Reagent
Syringe (1 ml)	Henke Sass Wolf	4010-200V0	Equipment
Syringe pump	New Era Pump Systems	NE1000	Equipment
High Voltage DC Power Supply	Glassman High Voltage	Series FC	Equipment
Incubator	Hucoa-Herlös	3111	Equipment
Laminar flow  hood	Telstar	AV30/70	Equipment
Human Fibronectin	Sigma	F2006	Reagent
RNeasy Micro Kit	Qiagen	74004	Reagent
Inverted microscope	Leica Microsystems	DMI 6000	Equipment
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Reagent
Albumin	Sigma-Aldrich	A7409	Reagent
Tween 20	Sigma-Aldrich	P2287	Reagent