Sandwichartigen Mikroumgebungen zu nutzen Handy / Material-Interaktionen

Zusammenfassung

The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.

Zusammenfassung

Zellkultur wurde traditionell auf zweidimensionalen (2D) Substrate, wo Zellen mit Rezeptoren, die zur ventralen Biomaterialoberfläche haften geführt. Jedoch in vivo, die meisten Zellen sind vollständig von der extrazellulären Matrix (ECM) umgeben ist, was in einem dreidimensionalen (3D) Verteilung der Rezeptoren. Hiermit können die Unterschiede in der Outside-in-Signalwege und damit das Verhalten der Zelle auslösen.

Dieser Artikel zeigt, dass die Stimulation der dorsalen Rezeptoren von Zellen durch Überlagerung eines Films aus einem neuen Material (a sandwichartigen Kultur) bereits zu einer 2D-Substrat haftet löst wichtige Änderungen in Bezug auf Standard-2D-Kulturen. Außerdem verschiebt sich die gleichzeitige Anregung ventralen und dorsalen Rezeptoren Zellverhalten stärker an die in 3D-Umgebungen gefunden. Zusätzlich aufgrund der Art des Systems ist eine sandwichartige Kultur ein vielseitiges Werkzeug, das die Untersuchung der verschiedenen Parameter in Zell / Material inte ermöglichtractions zB Topographie, Steifigkeit und unterschiedlichen Proteinbeschichtungen sowohl auf der ventralen und dorsalen Seiten. Da schließlich sandwichartigen Kulturen werden auf 2D Substraten, mehrere Analyseverfahren bereits für Standard-2D-Kulturen entwickelt normalerweise verwendet werden kann, die Überwindung komplexere Verfahren für die 3D-Systemen benötigt.

Einleitung

Traditionell Zellkultur wurde auf zweidimensionalen (2D) als Substrate verwendet, obwohl die meisten in vivo zelluläre Mikro eine dreidimensionale (3D) Natur. Diese unnatürliche 2D-Umgebung löst Veränderungen im Verhalten der Zelle als eine Möglichkeit der Selbstanpassung zu einer flachen Welt, die einen direkten Einfluss auf das Schicksal der Zelle ^1,2. Daher Ergebnisse auf 2D-Zellkulturen erhalten werden, sind nicht immer reproduzierbar in vivo. Dies hat die Entwicklung von neuen relevanten Kultursystemen versuchen, mehrere physiologische ähnlichen Bedingungen um weitere Einblicke in jeder Dimension abhängige biologische Mechanismus ^3,4 zu liefern gefördert.

Einer der Hauptunterschiede zwischen dem 2D- und dem 3D-Kultur in vivo-Umgebung ist die Verteilung der Zellen-Rezeptoren der extrazellulären Matrix (ECM) verankert ist: während auf 2D Substrate Zellen ventral haften, sind die Mehrzahl der Zellen in vivo vollständig durch das ECM umgeben so cell Adhäsion tritt durch eine 3D-Verteilung von Rezeptoren. Dies löst verschiedene Zelladhäsion Signaltransduktionswege modulieren, wodurch wichtige Prozesse wie Zellwachstum, Zelldifferenzierung und Genexpression. In den letzten Jahrzehnten wurden viele verschiedene 3D-Kultursysteme etabliert ^5-8, obwohl ihre Variabilität und Komplexität behindert deren Standardisierung gemeinsam Zellkulturverfahren. Außerdem 3D-Systeme sind in der Regel nicht leicht zu handhaben und zu aktuellen experimentellen Verfahren 2D Substrate nicht ohne weiteres für die 3D-Kulturen hergestellt werden. Außerdem Literatur selten vergleicht 3D-Kulturen mit dem Äquivalent 2D Bedingung oder anderen 3D-Systemen, behindern die richtige Verständnis des Zellverhaltens in diesen Modellen.

Sobald mit den Zellen auf einem 2D Substrat die Anregung der dorsalen Rezeptoren haften - durch Überlagerung einer Schicht aus einem neuen Material (Sandwich-ähnlichen Kultur) - Zell-Antworten können gleichermaßen 3D-Umgebungen auszulösen. Die reaSohn dafür ist die gleichzeitige Aktivierung sowohl dorsalen und ventralen Rezeptoren zu haften und in der Sandwich-Umgebung verteilt (Abbildung 1) ^9,10. Als Konsequenz Zellen eine wichtige Änderungen bezüglich 2D Kulturen ^11,12. Auf diese Weise wird das Schicksal der Zelle bei der Montage aufgrund der Sandwichkultur bestimmt, da die Rücken Stimulation löst Veränderungen im zellulären Wege-Taste. Daher wird das Zellschicksal stark von der Zeit, wenn die sandwichartige Kultur zusammengebaut ¹¹ bestimmt.

Aufgrund der Natur des Systems, ist eine sandwichartige Kultur ein einfaches und vielseitiges Werkzeug, das Studium der verschiedenen Parameter in Zell / Material-Wechselwirkungen wie Chemie, Topographie, Steifigkeit und Proteinbeschichtungen sowohl auf der ventralen und dorsalen Seiten ermöglicht. Dies bietet einen höheren Grad an Flexibilität im Vergleich zu anderen 3D-Systemen (Figur 2) aufgrund der unabhängigen dorsalen und ventralen Kombination verschieden variety der Oberflächenbeschaffenheit. Zudem können andere Zelllinien und verschiedene Zeiten, die sandwichartig zusammenzusetzen Kultur untersucht werden, was die breite Spektren von Möglichkeiten.

Ein Standardprotokoll des sandwichartigen Kultur wird unter Verwendung von detaillierten entweder Poly-L-Milchsäure (PLLA) elektrogesponnenen Fasern oder Folien als Rücken Substraten Deckglas als ventral Substrat und Fibronectin als Proteinbeschichtung. Sandwichartigen Kulturen wurden direkt nach Zellaussaat oder nach 3 h von 2D-Kultur zusammengebaut. Beachten Sie jedoch, dass andere Materialsysteme und Proteine ​​eingesetzt werden könnten; ebenfalls sandwichartigen Kultur kann zu unterschiedlichen Zeitpunkten zusammengesetzt werden.

Protokoll

1. Herstellung von Rückengründe

1. Produktion von Flachfolie von PLLA durch Lösungsmittelgießen.
   1. Arbeiten in einem Abzug, um eine Lösung von 2% (w / v) PLLA in Chloroform (2 g PLLA in 100 ml Chloroform), gefolgt von Rühren bei Raumtemperatur (RT) bis zur vollständigen Lösung (ca. 3 h) herzustellen.
   2. Legen Sie die Scheiben auf einer Glaspetrischale.
      Anmerkung: Die Verwendung Edelstahlscheiben mit einem Innendurchmesser von 10,5 mm (etwas kleiner als der ventral Probendurchmesser), so dass die Scheibe auf der Oberseite der ventralen Substrat platziert. Andere Materialien wie etwa Polytetrafluorethylen (PTFE) oder Glasscheiben ebenso verwendet werden.
   3. Zugeben von 200 ul der PLLA-Lösung in die Waschmaschine und verdampfen lassen langsam für 30 min bei RT. Um eine langsame Verdampfung des Lösungsmittels zu ermöglichen, schließen Sie die Petrischale mit Aluminiumfolie mit ein paar Löcher.
   4. Erhitzen Sie die Proben bei 120 ° C für 5 Minuten, um Lösungsmittelspuren zu verdampfen.
   5. Lassen Proben kühl zu tunwn bei RT.
   6. Sobald Proben abgekühlt sind (30 min ungefähr), Deckel mit 18,2 M & Omega; · cm Wasser in der Petrischale und Inkubation für 8 min bei RT.
      Hinweis: Wenn Proben nicht vollständig abgekühlt ist, können sie aufnehmen 18,2 M & Omega; · cm Wasser und einem gummiartigen Zustand übernehmen. Zusätzlich Inkubation in 18,2 M & Omega; · cm Wasser für weniger als 8 min kann in unangebrachter Ablösung, und für mehr als 8 min in Loslösung von der Scheibe führen.
   7. Mit einer Rasierklinge, hebeln Sie die Scheiben, um sie ziehen Sie die Petrischale.
   8. Entfernen Sie alle Unvollkommenheiten von der Kante der Scheibe mit einer Pinzette und lassen Sie die Proben an der Luft trocknen.
   9. Speichern der Proben in einem Vakuum-Exsikkator (80 mbar) bis zum Tag des Experiments aufgrund PLLA abbaubar durch Hydrolyse.
2. Produktion von PLLA-Fasern durch Elektrospinnen.
   1. Arbeiten Sie in einem Abzug, um eine Lösung von 8% (w / v) PLLA in Hexafluorisopropanol (8 g PLLA in 100 ml Hexafluorisopropanol) durch umrühren vorbereitening bei RT bis zur vollständigen Auflösung (3 Stunden ungefähr).
   2. Legen Sie das Polytetrafluorethylen (PTFE) Scheiben auf ein Aluminiumblech oder auf einer Trommel für die Elektrospinnen, um zufällige oder ausgerichteten Fasern bzw. zu erhalten.
      Anmerkung: Die Verwendung Polytetrafluorethylen (PTFE) Scheiben mit einem Innendurchmesser von 10,5 mm (etwas kleiner als der ventral Probendurchmesser), so dass die Scheibe an der Spitze der ventralen Substrat platziert. Andere Materialien, wie rostfreier Stahl oder Glas Scheiben könnten ebenso verwendet werden. Sollte die Trommel mit einer Winkelgeschwindigkeit von 160,7 s ^-1 (Radius = 7 cm), um die ausgerichteten Fasern zu erhalten, zu drehen. Eine langsamere Geschwindigkeit könnte Faserausrichtung nicht auslösen und eine schnellere Geschwindigkeit wird in gebrochenen Fasern führen.
   3. Legen Sie die Spritze mit der Polymerlösung und auf der Spritzenpumpe.
   4. Elektrospinnen PLLA Lösung unter Verwendung eines 0,9 ml / h Fließgeschwindigkeit mit einer Spannung von 30 kV und einer Kollektorabstand von 12 cm.
   5. Stoppen Sie das Elektrospinnverfahren achterner 20-30 Minuten, einmal eine gute Faserdichte erreicht wird (da Zellen mit mehreren Fasern gleichzeitig interagieren).
   6. Erhitzen Sie die Proben bei 120 ° C für 5 Minuten, um Lösungsmittelspuren zu verdampfen.
   7. Speichern der Proben in einem Vakuum-Exsikkator (80 mbar) bis zum Tag des Experiments aufgrund PLLA abbaubar durch Hydrolyse.

2. Sandwich Kultur

1. Montieren Sie den sandwichartigen Kultur einmal Zellen dem ventralen 2D Substrat haftet.
   1. Arbeit in einer Kultur Haube sterilen Bedingungen, um sicherzustellen und zu sterilisieren alle Materialien (Deckgläser, Rücken Substrate, Pinzette, etc.) durch UV-Exposition für 30 min.
   2. Coat die ventralen und dorsalen Substrat mit Fibronektin, um spezifische Zellproteinhaftung leiten. Dazu läßt man die Proben in 20 & mgr; g / ml von Fibronektin in Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (DPBS), die Ca ²⁺ und Mg ²⁺ (200 & mgr; l / s gelöstausreichend) für 1 Stunde.
      Hinweis: Aufgrund des Herstellungsprozesses, haben Rücken Substrate A bezeichnet Ober- und Unterseite, da die Lösungsmittel gegossene Film und elektrogesponnenen Fasern auf einer der Seiten der Scheibe angebracht. Diese Seite ist daher ein Blick auf die Zellen (Figur 3).
      1. Nach der Proteinbeschichtung, waschen Sie die Proben zweimal mit DPBS, um Protein im Überschuß zu entfernen. Dann inkubieren Proben in DPBS, bis ihre Verwendung, um die Proben vor zu trockener, da dies bewirkt, dass Protein Denaturierung zu verhindern. Verwendung DPBS, das Ca ²⁺ und Mg ^2+, da zweiwertige Kationen regulieren Proteinfaltung.
   3. Samenzellen auf dem Glasplättchen ^13.
      Hinweis: Da die sandwichartige Kultur wird auf 2D Substraten basieren, werden Zellaussaat, ähnlich wie auf einer 2D-Probe durchgeführt werden. Beispielsweise werden C2C12 Myoblasten bei 17,500 Zellen cm ^-1 für Differenzierungsexperimente und NIH3T3-Fibroblasten sind bei 7000 c ausgesät ausgesätEllen cm ^-1 für isolierte Kulturen Zellmorphologie und die Haftung zu studieren.
   4. Die Proben werden im Brutschrank bei 37 ° C mit 5% CO ₂ und, sodass die Zellen an der ventralen Substrat für 3 Stunden zu halten.
   5. Setzen Sie den ventralen ausgesät Substrat in einer neuen Vertiefung einer 12 Multiwellplatte (wo Waschmaschinen passen).
      Hinweis: Montage des sandwichartigen Kultur in einer neuen und ist ein Weg, der Zellen, die an der Unterseite der Brunnen nach der Aussaat eingehalten haben, zu befreien, da diese Nährstoffe verbrauchen und sezernieren Wachstumsfaktoren und Abfälle, die Zellen innerhalb der kultivierten beeinflussen lassen sandwichartigen Systems. Dies ist auch ein Muss für zellulare Extraktionen, um nur die Zellen in der sandwichartigen Umgebung kultiviert lysieren.
   6. Sorgfältig und mit Hilfe einer Pinzette, überlagern die dorsale Substrat, auf die Zellen. Nachfüllung mit Medium (1 ml) und bei 37 ° C mit 5% CO _2.
      Hinweis: Das Gewicht der Scheibe wird in die dorsale Unter verhindernStrate aus schwimmenden.
   7. Ändern Sie das Medium zweimal pro Woche, wie in Standard-2D-Kulturen. Den dorsalen Substrat nicht bewegen, da dies könnte in Zellschäden führen.
2. Montieren Sie den sandwichartigen Kultur kurz nach Zellaussaat.
   1. Arbeit in einer Kultur Haube sterilen Bedingungen, um sicherzustellen und zu sterilisieren alle Materialien (Deckgläser, Rücken Substrate, Pinzette, etc.) durch UV-Exposition für 30 min.
   2. Coat die ventralen und dorsalen Substrat mit Fibronektin, um spezifische Zellproteinhaftung leiten. Dazu läßt man die Proben in 20 & mgr; g / ml von Fibronektin in DPBS, die Ca ²⁺ und Mg ²⁺ (200 ul / Probe) 1 h gelöst.
      1. Nach der Proteinbeschichtung, waschen Sie die Proben zweimal mit DPBS, um Protein im Überschuß zu entfernen. Dann inkubieren Proben in DPBS, bis ihre Verwendung, um die Proben vor zu trockener, da dies bewirkt, dass Protein Denaturierung zu verhindern. Verwendung DPBS, das Ca ²⁺ und Mg ^{2+ da zweiwertige Kationen regulieren Proteinfaltung.}
   3. Seed-Zellen auf Deckgläsern in eine Vertiefung einer 12 Multiwellplatte (wo Scheiben passen). Um dies zu tun, verwenden Sie ein hochkonzentrierte Zellsuspension zu Zellverlust nach der Verlegung die dorsale Substrat zu vermeiden.
   4. Sorgfältig und mit Hilfe einer Pinzette, überlagern die dorsale Substrat, auf die Zellen. Nachfüllung mit Medium (1 ml) und bei 37 ° C mit 5% CO _2.
      Hinweis: Das Gewicht der Scheibe wird in die dorsale Substrat Aufschwimmen verhindern.
   5. Ändern Sie das Medium zweimal pro Woche, wie in Standard-2D-Kulturen.
      Hinweis: Die Rücken Substrat nicht bewegen, da dies zu Zellschäden führen.

3. Analyse

Anmerkung: sandwichartigen Kulturen werden auf 2D Substraten, und so ist üblicherweise durch die bereits für Standard-2D-Kulturen entwickelten Verfahren analysiert werden. Da beispielsweise PLLA ist transparent und cells gezwungen sind, innerhalb der xy-Ebene zu bewegen, wird die Mikroskopie als auf 2D-Substraten durchgeführt. Die Zellmigration kann daher als für 2D Kulturen analysiert werden, ohne die Notwendigkeit von Tracking-Zellen in der z-Achse wie für 3D-Kulturen, die das Experiment und Bildanalyse vereinfacht. Um die Wundheilung Assay durch einen Kratzer Test studieren folgen Sie diesem Protokoll:

1. Untersuchung der Zellwanderung (Wundheilungs Assay) innerhalb des sandwichartigen Kultur.
   1. Arbeit in einer Kultur Haube sterilen Bedingungen, um sicherzustellen und zu sterilisieren alle Materialien (Deckgläser, Rücken Substrate, Pinzette, etc.) durch UV-Exposition für 30 min.
   2. Coat die ventralen und dorsalen Substrat mit Fibronektin, um spezifische Zellproteinhaftung leiten. Dazu läßt man die Proben in 20 & mgr; g / ml von Fibronektin in Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (DPBS), die Ca ²⁺ und Mg ²⁺ 1 h gelöst.
      1. Nach der Proteinbeschichtung, waschen Sie die Proben zweimal mit DPBSum Protein im Überschuß zu entfernen. Dann inkubieren Proben in DPBS, bis ihre Verwendung, um die Proben vor zu trockener da dies Protein Denaturierung verursachen zu vermeiden. Verwendung DPBS, das Ca ²⁺ und Mg ^2+, da zweiwertige Kationen regulieren Proteinfaltung.
   3. Samenzellen auf den Deckgläschen mit hoher Dichte ^13.
   4. Die Proben werden im Brutschrank bei 37 ° C mit 5% CO ₂ und sodass die Zellen Konfluenz erreichen.
   5. Verwenden Sie eine Pipettenspitze, um die Zellschicht, um Kratzer zu 2 Zellpopulationen durch einen Spalt getrennt zu erhalten.
   6. Setzen Sie den ventralen ausgesät Substrat in einem neuen gut geeignet für die Zeitraffer-Akquisition und dem dorsalen Substrate passen (dh 12 Multi-Well-Platte).
   7. Sorgfältig und mit Hilfe einer Pinzette, überlagern die dorsale Substrat, auf die Zellen und dann nachgefüllt Medium (1 ml für eine 12 Multi-Well-Platte).
      Hinweis: Das Gewicht der Scheibe wird verhindert ter dorsal Substrat aus schwimmenden.
   8. Legen Sie die Probe in der Zeitraffer-Mikroskop (bis 37 ° C und 5% CO ₂₎ und nehmen Sie Bilder von der Lückenschluss alle 20 Minuten.
   9. Analysieren Sie den Lückenschluss mit speziellen Software wie das Plugin MiToBo von ImageJ. ¹⁴

Hinweis: Protein und Nukleinsäure-Extraktion wird in ähnlicher Weise wie auf der 2D-Substraten durchgeführt. Es gibt nur einen zusätzlichen Schritt, der in der Demontage des sandwichartigen Kultur Lysepuffer direkt auf die Zellen, um die Effizienz der Extraktion hinzuzufügen besteht. Beispielsweise für mRNA-Extraktion:

2. Extrahieren von mRNA aus sandwichartigen Kulturen
   1. Vorbereitung alle Puffer vom kommerziellen Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers.
   2. Nehmen Sie die sandwichartige Kultur aus dem Inkubator.
   3. Entfernen Sie die Kulturmedien aus den Proben.
   4. Die Proben einmal Waschen mit DPBS, die Ca²⁺ und Mg 2+ (1 ml), und entfernen Sie die gesamte Lösung.
   5. Mit Hilfe einer Pinzette, entfernen Sie den Rücken Substrat und fügen Sie die Lyse-Puffer (350 ul) zur ventralen Substrat. Overlay wieder die dorsale Substrat auf der ventralen Substrat zur Lyse der Zellen auch an der dorsalen Substrat haftet.
   6. Entfernen Sie die Rücken Substrat, um die Lyse-Lösung zu isolieren.
   7. Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers, um die mRNA zu erhalten.

Anmerkung: Immunodetektion von Proteinen kann auch als 2D Substraten durchgeführt werden. Seit sandwichartigen Kulturen könnte die korrekte Diffusion der Antikörper und Puffer zu behindern, sollte Inkubationszeiten erhöht werden. Auch kann das Sandwich vor dem Starten des Färbeprotokoll demontiert werden, aber im letzteren Fall einige Zellen im dorsalen Substrat und einige zur ventralen Substrat verbunden bleiben.

3. Immunodetect Proteine ​​innerhalb einer sandwichartigen Kultur
   1. Die Probe einmal Waschen mit DPBS setzen und mit 4% Formaldehyd in PBS für 20 Minuten bei 4 ° C.
      Anmerkung: Dorsal Substrat kann während des Fixierungsprozesses, so daß Diffusionsprobleme vermieden entfernt werden.
   2. Gründlich mit DPBS (1 ml) und dann mit permeabilisieren 0,5% Triton X-100 in DPBS (1 ml) für 5 min bei RT.
   3. Blockieren unspezifischer Bindungsstellen mit 1% Albumin in DPBS (1 ml) für 30 min bei RT.
   4. Inkubieren mit dem primären Antikörper (2 ug / ml; 1 ml) in Blockierungslösung 3 h bei RT.
   5. Für 10 min mit DPBS / 0,5% Tween 20 (1 ml) 3x waschen.
   6. Inkubieren 2 Std mit sekundärem Antikörper (2 ug / ml) und 1 & mgr; g / ml DAPI in Blocking-Lösung (1 ml) bei RT.
   7. Für 10 min in DPBS / 0,5% Tween 20 (1 ml) 3x waschen.
   8. In DPBS waschen.
      Hinweis: Die Proben können auf einem Objektträger mit Vectashield montiert und mit Nagellack versiegelt, wenn Rücken Substrate vor der Immundetektion entfernt werden.
   9. Beachten Sie unter dem FluoreszenzmikroUmfang wie für Standard-2D-Substraten.

Ergebnisse

Die Stimulation der Rezeptoren dorsal im sandwichartigen Kultur löst Veränderungen in der Zellmorphologie, Zelladhäsion und intrazelluläre Signalwege (zB focal adhesion kinase, FAK) ^10-12. Als Beispiel Fibroblasten innerhalb des sandwichartigen System kultiviert überexprimiert die α _{5-Integrin-Untereinheit} im Vergleich zu dem 2D, wie für andere 3D-Kulturen ^15,16 beobachtet.

Zellschicksal ist stark abhängig von der Zeit, wenn die Rücken Rezep...

Diskussion

Heutzutage ist 3D-Kultur ein wichtiges Thema für die pharmazeutische und biotechnologische Industrie und Forschung in der Zellbiologie, einschließlich Krebs und Stammzellen. Als Folge mehrere 3D-Kultursysteme entwickelt worden. Leider Unterschiede zwischen den 3D-Systemen in der Regel in verschiedenen Zellverhalten führen, behindert das Verständnis der Zellschicksal. Außerdem sind die experimentellen Verfahren in der Regel nicht so einfach, wie für die 2D-Kultursysteme. Daher die Entwicklung neuer Kultursystemen v...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ploy(lactic acid)	NatureWorks	4042D	Reagent
Cover glasses (12 mmØ)	Marienfeld	631-0666	Equipment
Chloroform	Scharlab	CL0200	Reagent
1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP)	Sigma	105228	Reagent
Syringe (1 ml)	Henke Sass Wolf	4010-200V0	Equipment
Syringe pump	New Era Pump Systems	NE1000	Equipment
High Voltage DC Power Supply	Glassman High Voltage	Series FC	Equipment
Incubator	Hucoa-Herlös	3111	Equipment
Laminar flow  hood	Telstar	AV30/70	Equipment
Human Fibronectin	Sigma	F2006	Reagent
RNeasy Micro Kit	Qiagen	74004	Reagent
Inverted microscope	Leica Microsystems	DMI 6000	Equipment
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Reagent
Albumin	Sigma-Aldrich	A7409	Reagent
Tween 20	Sigma-Aldrich	P2287	Reagent