サンドイッチ状の微小環境は、Cell /材料の相互作用を活用します

要約

The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.

要約

細胞培養物は、伝統的に、細胞が生体材料の表面に腹受容体を使用して接着する二次元（2D）基板上で行われています。しかしながら、インビボで 、細胞のほとんどは完全に受容体の三次元（3D）分布をもたらす、細胞外マトリックス（ECM）によって囲まれています。これは、シグナル伝達経路における外、したがって細胞の挙動での違いをトリガすることができます。

この記事では、すでに新素材（サンドイッチ状文化）のフィルムを重ね合わせることによって、2D基板に付着した細胞の背側の受容体を刺激すると、標準の2D文化に対する重要な変更をトリガーすることを示しています。また、腹側と背側の受容体の同時励起が近い3D環境で見られるものと細胞の挙動をシフトします。また、原因システムの性質上、サンドイッチ状の培養は、細胞/材料INTEで異なるパラメータの研究を可能にする汎用性の高いツールです。ractions、 例えば 、地形、剛性との両方の腹と背側面に異なるタンパク質コーティング。サンドイッチ様培養物を2D基板に基づいているので、最終的に、既に標準的な2D培養のために開発され、いくつかの分析手順は、3Dシステムのために必要な、より複雑な手順を克服し、正常に使用することができます。

概要

インビボ細胞微小環境の大部分は3次元（3D）の性質を持っているのに伝統的に、細胞培養物は、二次元（2D）基板上で行われています。この不自然な2D環境では、フラット世界に自己適応の方法として、細胞の挙動の変化をトリガし、これに直接影響を与える細胞の運命^1,2。したがって、2D細胞培養に得られた結果は、 生体内で常に再現性がありません。これは、任意の次元に依存する生物学的メカニズムの^3,4へのさらなる洞察を得るために、より生理的に似た条件を提供しようとしている新しい関連する培養システムの開発を奨励してきました。

2Dおよび3D培養における生体内環境との間の主な違いの1つは、細胞外マトリックス（ECM）に固定細胞受容体の分布である：2Dに細胞が腹側に付着する基質に対して、 インビボでの細胞の大部分は、完全にECMに囲まれているとこのように、CELLの接着は、受容体の三次元分布を介して行われます。これにより、細胞増殖、細胞分化および遺伝子発現のような重要なプロセスを調節する別の細胞接着シグナル伝達経路を誘発します。その変動性と複雑さは、一般的な細胞培養手順での標準化を妨げるのに、最後の十年の間に、多くの異なる三次元培養系は^、5-8を確立されています。また3Dシステムは、通常、取り扱いが容易ではなく、2D基板上に現在の実験手順は、簡単に3Dの文化のために確立することはできません。さらに、文献はほとんどこれらのモデルにおける細胞の挙動の適切な理解を妨げ、同等の2D条件や他の3Dシステムと3Dの文化を比較しません。

一度2D基板上に付着した細胞を持つ、背側の受容体の励起 - 新材料（サンドイッチ状文化）のフィルムを重ねることでは - 似た3D環境の細胞応答を誘発することができます。 REAこの背後にある息子は背側と腹側の受容体付着およびサンドイッチ環境内で拡散する（ 図^1）9,10の両方の同時活性化です。結果として、細胞は、2D培養物^11,12に対する重要な変更を受けます。背側刺激が重要な細胞経路の変化をトリガするのでこのように、細胞の運命は、理由サンドイッチ文化の組み立て中に決定されます。したがって、細胞の運命は非常にサンドイッチ状培養^11を組み立てられた時点で決定されます。

によるシステムの性質上、サンドイッチ状文化は両方腹と背側部で、このような化学、地形、剛性およびタンパク質のコーティングなどの細胞/材料の相互作用における異なるパラメータの研究を可能にする、シンプルで汎用性の高いツールです。これは、幅の広いVの独立した背と腹の組み合わせに他の3Dシステム（ 図2）に比べて汎用性の高い学位を提供しています表面状態のariety。また、サンドイッチ状培養を組み立てるために、異なる細胞株および異なる時間での可能性の広いスペクトルを増加させる、研究することができます。

サンドイッチ様培養の標準プロトコルは、タンパク質コーティングなどの腹側基板およびフィブロネクチンのような背側基板としてカバーガラスをポリ-L-乳酸（PLLA）エレクトロ繊維またはフィルムのいずれかを用いて以下に詳述します。サンドイッチ状の文化だけで、細胞播種後または2D培養3時間後に組み立てました。しかし、他の材料系およびタンパク質を使用できることに注意。同様にサンドイッチ状培養を異なる時点で組み立てることができます。

プロトコル

背の基板1の製造

1. 溶媒キャスティングによるPLLAのフラットフィルムの製造。
   1. 完全に溶解するまで（約3時間）、室温（RT）で攪拌し、クロロホルム中の2％（w / v）のPLLA（100mLのクロロホルム中の2gのPLLA）の溶液を調製し、ドラフト中で作業。
   2. ガラスシャーレ上にワッシャーを配置します。
      注：（腹サンプル直径よりわずかに小さい）10.5ミリメートルの内径で使用ステンレス鋼ワッシャをワッシャが腹側基板の上に配置されるようになっています。ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）またはガラス洗濯機のような他の材料も同様に使用することができます。
   3. 洗濯機でPLLA溶液200μlを加え、室温で30分間ゆっくりと蒸発させます。溶媒をゆっくり蒸発を可能にするために、いくつかの穴を持つアルミホイルでペトリ皿を閉じ。
   4. 溶媒の痕跡を蒸発させるために5分間120℃で試料を加熱します。
   5. サンプルはクールやってみましょうRTでWN。
   6. サンプルは（30分程度）まで冷却した後、ペトリ皿中·cmの水18.2MΩで覆い、室温で8分間インキュベートします。
      注：サンプルを完全に冷却されていない場合は、·cmの水18.2MΩを取るとゴム状態を採用することができます。さらに、8未満分·cmの水18.2MΩでインキュベートして、不適切な脱離で、ワッシャから離脱以上の8分なることがあります。
   7. かみそりの刃で、ペトリ皿を、それらを剥離するワッシャを取り外します。
   8. ピンセットでワッシャの端から任意の欠陥を除去し、試料は空気乾燥してみましょう。
   9. PLLAは、加水分解により分解可能であるため、実験日まで、真空デシケーター（80ミリバール）でサンプルを保管してください。
2. エレクトロスピニングによるPLLA繊維の製造。
   1. stirrによりヘキサフルオロイソプロパノール中の（w / v）のPLLA（100ミリリットルヘキサ8グラムPLLA）8％の溶液を調製し、ヒュームフード内で作業完全に溶解するまで（約3時間）は室温でる。
   2. それぞれランダムまたは整列した繊維を得るために、アルミニウムシート上に、またはエレクトロスピニングのためのドラムにポリテトラフルオロエチレン（PTFE）、洗濯機を置きます。
      注：使用し、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）、ワッシャー（腹サンプル直径よりわずかに小さい）10.5ミリメートルの内径を有するワッシャを腹側基板の上に配置されるようになっています。例えば、ステンレス鋼又はガラスワッシャーのような他の材料も同様に使用することができます。ドラムは、整列した繊維を得るためには160.7秒^-1（半径= 7センチ）の角速度で回転させるべきです。遅い速度は、繊維配向と壊れた繊維になります高速化は発生しません。
   3. ポリマー溶液と注射器をロードして、シリンジポンプの上に置きます。
   4. 30キロボルトの電圧を0.9ミリリットル/時間の流速及び12cmのコレクタ距離を用いてPLLA溶液をエレクトロスピニング。
   5. エレクトロスピニング法の後方を停止ER 20〜30分、（細胞は、同時に複数の繊維と相互作用する必要があるため）一度良好な繊維密度が達成されます。
   6. 溶媒の痕跡を蒸発させるために5分間120℃で試料を加熱します。
   7. PLLAは、加水分解により分解可能であるため、実験日まで、真空デシケーター（80ミリバール）でサンプルを保管してください。

2.サンドイッチ文化

1. 細胞は腹側2D基板に接着されるとサンドイッチ状文化を組み立てます。
   1. 培養フード中で作業は、無菌状態を確保し、30分間UV照射して、すべての材料（カバーガラス、背面基板、ピンセットなど ） を滅菌します。
   2. 特異的細胞タンパク質付着を指示するために、コートフィブロネクチンと腹側と背側の基板を。これを行うには、のCa ²⁺およびMg ^2+（200μL/秒を含むダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）中に溶解し、フィブロネクチン20μg/ mlの中でサンプルをインキュベート1時間）十分。
      注：溶剤キャストフィルムとエレクトロ繊維は洗濯機の側面の一方に取り付けられているためにより製造工程に、背側基板は、指定された上部と下部の側面を持っています。この辺は、したがって、細胞（ 図3）に対向するものです。
      1. タンパク質コーティングの後、過剰なタンパク質を除去するためにDPBSで二回サンプルを洗浄します。そして、これはタンパク質の変性を引き起こすため、乾燥なってからサンプルを防ぐためにそれらを使用するまでDPBSでサンプルをインキュベートします。二価の陽イオンは、タンパク質の折り畳みを調節することからのCa ²⁺およびMg ²⁺を含む使用DPBS。
   3. ガラスの種子細胞は^13をカバースリップ。
      注：サンドイッチ様培養物を2D基板に基づいているように、細胞播種は、2Dサンプル上と同様に行われます。例えば、C2C12筋芽は^-1分化実験およびNIH3T3線維芽細胞のためには、7,000℃で播種された17,500個の細胞で播種し、ellsの^-1細胞形態との密着性を研究するために、単離された培養物について。
   4. 5％CO ₂で37℃のインキュベーターでサンプルを置き、細胞が3時間腹基板に接着することができます。
   5. （ワッシャーが収まら）12マルチウェルプレートの新しいウェル内腹シードの基板を配置します。
      注：新しい十分にサンドイッチ状文化を組み立てることは、これらの栄養素を消費し、内の培養細胞に影響を与える増殖因子および廃棄物を分泌するため、播種後ウェルの底に付着した細胞を取り除くために一つの方法ですサンドイッチのようなシステム。これは、サンドイッチのような環境内で培養した細胞のみを溶解するために、また、細胞抽出のための絶対必要です。
   6. 慎重にピンセットの助けを借りて、細胞の背側基板をオーバーレイ。培地（1ml）で補充し、5％CO _2、37℃でインキュベートします。
      注意：ワッシャーの重量は背側のサブを防ぐことができますフローティングからstrate。
   7. 標準的な2D培養のように1週間に2回培地を変更します。これは細胞の損傷につながる可能性があるので、背側基板を移動しないでください。
2. ちょうど細胞播種後にサンドイッチ状文化を組み立てます。
   1. 培養フード中で作業は、無菌状態を確保し、30分間UV照射して、すべての材料（カバーガラス、背面基板、ピンセットなど ） を滅菌します。
   2. 特異的細胞タンパク質付着を指示するために、コートフィブロネクチンと腹側と背側の基板を。これを行うには、のCa ²⁺およびMg ^2+を 1時間（200μL/サンプル）を含むDPBSに溶解フィブロネクチンの20 / mlの中でサンプルをインキュベートします。
      1. タンパク質コーティングの後、過剰なタンパク質を除去するためにDPBSで二回サンプルを洗浄します。そして、これはタンパク質の変性を引き起こすため、乾燥なってからサンプルを防ぐためにそれらを使用するまでDPBSでサンプルをインキュベートします。のCa ²⁺およびMgを含む使用DPBS まで。
   3. （ワッシャーが収まら）12マルチウェルプレートのウェル中のガラスカバースリップ上にシード細胞。これを行うには、背側基板を敷設した後、細胞の損失を回避するために、高度に濃縮された細胞懸濁液を使用しています。
   4. 慎重にピンセットの助けを借りて、細胞の背側基板をオーバーレイ。培地（1ml）で補充し、5％CO _2、37℃でインキュベートします。
      注意：ワッシャーの重量はフローティングから背側基板を防ぐことができます。
   5. 標準的な2D培養のように1週間に2回培地を変更します。
      注：これは、細胞損傷をもたらす可能性があるので、背側基板を移動しないでください。

3.分析

注：サンドイッチ状培養物を2D基板に基づいており、そのため一般に、既に標準2D培養のために開発された手順によって分析することができます。例えば、PLLAは透明とセル画であるため、LSは、xy平面内で移動するように拘束され、顕微鏡検査は2D基板上のように行われます。細胞移動は、従って、実験および画像解析を簡素化し、3D培養の場合と同様に、z軸に細胞を追跡する必要性なしに、2D培養の場合と同様に分析することができます。スクラッチアッセイによってアッセイ創傷治癒を研究するため、このプロトコルは、次のとおりです。

1. サンドイッチ状の培養内の研究細胞の移動（創傷治癒アッセイ）。
   1. 培養フード中で作業は、無菌状態を確保し、30分間UV照射して、すべての材料（カバーガラス、背面基板、ピンセットなど ） を滅菌します。
   2. 特異的細胞タンパク質付着を指示するために、コートフィブロネクチンと腹側と背側の基板を。これを行うには、1時間²⁺のCa ²⁺およびMgを含むダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）中に溶解し、フィブロネクチン20μg/ mlの中でサンプルをインキュベートします。
      1. タンパク質コーティングの後、DPBSで二回サンプルを洗浄過剰なタンパク質を除去するためです。そして、これはタンパク質の変性を引き起こす可能性があるので、乾燥なってからサンプルを防ぐためにそれらを使用するまでDPBSでサンプルをインキュベートします。二価の陽イオンは、タンパク質の折り畳みを調節することからのCa ²⁺およびMg ²⁺を含む使用DPBS。
   3. 高密度¹³でガラスカバースリップ上の細胞をシード。
   4. 5％CO ₂で37℃のインキュベーター内でサンプルを置き、細胞がコンフルエンスを達成することを可能にします。
   5. ギャップによって分離2細胞集団を得るために細胞単層を傷つけピペットチップを使用してください。
   6. タイムラプス取得のための新しい同様に適切で腹シードの基板を配置し、背側の基板（ すなわち 12マルチウェルプレート）を取り付けてあります。
   7. 慎重にピンセットの助けを借りて、細胞の背側基板をオーバーレイしてから（12マルチウェルプレートには1 ml）を培地に補充します。
      注意：ワッシャーの重量はTを防ぐことができます彼は、フローティングから基板を背側。
   8. （37℃、5％CO ₂に設定）タイムラプス顕微鏡でサンプルを置き、隙間閉鎖の画像ごとに20分を取ります。
   9. このようなImageJのプラグインからのMiToBoとして、特定のソフトウェアを使用して、隙間閉鎖を分析します^。14

注：タンパク質および核酸抽出を2次元基板上と同様に行われます。抽出効率を向上させるために細胞に直接、溶解緩衝液を添加することがサンドイッチ状培養物を分解することからなる唯一の余分なステップがあります。例えば、mRNA抽出のために：

2. サンドイッチ状の培養からmRNAを抽出します
   1. 製造業者の説明書に従って市販のキットからすべてのバッファを準備します。
   2. インキュベーターからサンドイッチ状文化を取り出します。
   3. サンプルから培地を除去します。
   4. カルシウムを含むDPBSで一度サンプルを洗います2+およびMg ^2+（1ml）およびすべてのソリューションを削除します。
   5. ピンセットの助けを借りて、背側基板を除去し、腹側基板に溶解バッファー（350μl）を追加します。また、背側基板に付着した細胞を溶解するために、再び腹基板上に背側基板をオーバーレイ。
   6. 溶解液を分離するために背側基板を取り外します。
   7. のmRNAを取得するには、製造元の指示に従ってください。

注：タンパク質の免疫検出はまた、2D基板上のように行うことができます。サンドイッチ状の文化が、抗体および緩衝液の正確な拡散を妨げる可能性があるため、インキュベーション時間を増やす必要があります。また、サンドイッチは、染色プロトコルを開始する前に分解することができるが、後者の場合には、いくつかの細胞が背側基板と腹側の基板にはいくつかに付着したままになります。

3. サンドイッチ状文化内Immunodetectタンパク質
   1. DPBSで一度サンプルを洗浄し、4℃で20分間、PBS中の4％ホルムアルデヒドで固定します。
      注：背側基板は、拡散の問題が回避されるように、固定プロセスの間に除去することができます。
   2. DPBS（1ml）ですすぎ、次いで室温で5分間、DPBS中0.5％トリトンX-100（1 ml）で透過性。
   3. RTで30分間、DPBS中の1％アルブミン（1mL）で非特異的結合部位をブロックします。
   4. 一次抗体とインキュベート（2 / mlの、1ミリリットル）を室温で3時間ブロッキング溶液中で。
   5. DPBSで10分/ 0.5％のTween 20（1ミリリットル）のために3回洗浄します。
   6. 室温で溶液（1 ml）を遮断する二次抗体（2μg/ ml）および1 / mlのDAPIで2時間インキュベートします。
   7. DPBSで10分/ 0.5％のTween 20（1ミリリットル）のために3回洗浄します。
   8. DPBSで洗浄します。
      注：サンプルは、ベクタシールドでスライド上にマウントし、背側基板は、従来の免疫削除されたときにマニキュアで封止することができます。
   9. 蛍光マイクロ下で観察します標準の2D基板用としてスコープ。

結果

サンドイッチ状の培養内の背側の受容体の刺激は、細胞形態の変化、細胞接着および細胞内シグナル伝達経路（ 例えば、焦点接着キナーゼ^{、FAK）10〜12を}トリガーします。他の3Dの文化^15,16のために観察されるような例として、サンドイッチ状システム内で培養した線維芽細胞は、2Dと比較して_、α5インテグリンサブユニットを過剰発現しました。

ディスカッション

現在、3D培養は、癌および幹細胞を含む医薬品やバイオテクノロジーの業界だけでなく、細胞生物学の研究のための重要なトピックです。結果として、いくつかの3D培養系が開発されています。残念ながら、3Dシステムの違いは、通常、細胞の運命の理解を妨げ、別の細胞の挙動をもたらします。また、実験手順は、通常の2D培養システムのためのほど簡単ではありません。したがって、これ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ploy(lactic acid)	NatureWorks	4042D	Reagent
Cover glasses (12 mmØ)	Marienfeld	631-0666	Equipment
Chloroform	Scharlab	CL0200	Reagent
1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP)	Sigma	105228	Reagent
Syringe (1 ml)	Henke Sass Wolf	4010-200V0	Equipment
Syringe pump	New Era Pump Systems	NE1000	Equipment
High Voltage DC Power Supply	Glassman High Voltage	Series FC	Equipment
Incubator	Hucoa-Herlös	3111	Equipment
Laminar flow  hood	Telstar	AV30/70	Equipment
Human Fibronectin	Sigma	F2006	Reagent
RNeasy Micro Kit	Qiagen	74004	Reagent
Inverted microscope	Leica Microsystems	DMI 6000	Equipment
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Reagent
Albumin	Sigma-Aldrich	A7409	Reagent
Tween 20	Sigma-Aldrich	P2287	Reagent