샌드위치 같은 미세 환경은 셀 / 재료의 상호 작용을 활용하는

요약

The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.

초록

세포 배양은 전통적 세포가 생체 복부 표면 수용체를 사용하여 부착 BI 차원 (2D)의 기판상에서 수행되었다. 그러나, 생체 내에서, 대부분의 셀이 완전히 수용체의 3 차원 분포의 결과로, 세포 외 기질 (ECM)에 의해 둘러싸여있다. 이 신호 전달 경로에 외부-따라서 세포 행동의 차이를 유발 할 수 있습니다.

이 문서에서는 이미 새로운 물질 (샌드위치 같은 문화)의 필름을 중첩하여 2D 기판에 부착 된 세포의 지느러미 수용체를 자극하는 표준 2D 문화에 대한 중요한 변경 사항을 트리거 보여줍니다. 또한, 복부와 지느러미 수용체의 동시 여기 가까이 3D 환경에서 발견에 셀 동작을 이동합니다. 또한 인해 시스템의 특성상, 샌드위치 형상 배양 세포 / 재료 INTE 상이한 파라미터들의 연구를 허용 다용도 공구이다ractions, 예를 들어, 지형, 강성과 모두 복부와 등의 측면에서 다른 단백질 코팅. 샌드위치 형 배양액 2D 기판에 기초하기 때문에 최종적으로, 여러 분석 절차는 이미 3D 시스템에 필요한 더 복잡한 절차를 극복 정상적으로 사용할 수있는 표준 2D 배양을 위해 개발.

서문

생체 세포의 미세 환경의 대부분은 3 차원 (3D) 성질을 가지고 있지만 전통적으로, 세포 배양 물은 바이 - 차원 (2D)의 기판상에서 수행되었다. 이 부 자연스러운 2D 환경은 평평한 세계에 스스로 적응하는 방법으로 세포의 행동 변화를 유발하는 직접적인 영향을 세포 운명 ^1,2. 따라서, 2 차원 세포 배양에서 얻어진 결과는 항상 생체 내에서 재현 할 수 없습니다. 이것은 모든 사이즈 의존성 생물학적기구 ^3,4-으로 더 통찰력을 얻기 위해 더 많은 생리 같은 조건을 제공하고자하는 새로운 비즈니스 배양 시스템의 개발을 장려하고있다.

2D는 세포 복부 부착 기판 상에 반해 생체 내에서 세포의 대부분이 완전히 ECM에 의해 둘러싸여있다 : 2 차원 배양 및 생체 환경에서 3D 간의 주된 차이점들 중 하나는 세포 외 기질 (ECM)에 고정 세포 수용체의 분포 따라서 CELL 밀착성이 수용체의 3 차원 분포를 통해 발생한다. 이것에 의해 이러한 세포 성장, 세포 분화 및 유전자 발현에 중요한 프로세스를 변조 다른 세포 접착 신호 전달 경로를 트리거한다. 그들의 변동 및 복잡성이 일반적인 세포 배양 과정에서의 표준화를 방해하지만 지난 수십 년 동안, 다양한 3 차원 배양 시스템은 ^5-8 확립되었다. 또한 3D 시스템은 일반적으로 처리 할 수​​ 및 2D 기판에 현재의 실험 절차는 쉽게 3D 문화 확립 할 수 없습니다 쉽지 않다. 또한, 문헌은 거의 이러한 모델에서 세포 행동의 적절한 이해를 방해하고, 동등한 조건 2D 또는 3D 다른 시스템과 3 차원 배양을 비교하지 않는다.

일단 2D 기판 등의 수용체의 자극에 부착 된 세포를 가진 - 신소재 (샌드위치 같은 문화)의 필름을 중첩하여 - 셀 모두 응답 3D 환경을 트리거 할 수 있습니다. REA이 뒤에 아들은 지느러미와 복부 수용체 준수와 샌드위치 환경 내에서 확산 (그림 1) ^{9, 10} 두의 동시 활성화입니다. 결과적으로, 세포는 배양 ^11,12 2D에 대해서 중요한 변화를 겪는다. 등의 자극이 키 세포 경로의 변화를 유발하기 때문에 따라서, 세포의 운명은, 때문에 샌드위치 문화의 조립시 결정됩니다. 따라서, 세포의 운명은 고도로 샌드위치 형 배양 ¹¹ 조립 시간에 의해 결정된다.

인해 시스템의 특성상, 샌드위치 형상 배양 모두 복부 및 등쪽 측면에 같은 화학, 지형, 강성 및 단백질 코팅 같은 셀 / 재료 상호 상이한 파라미터들의 연구를 허용 간단하고 다양한 도구이다. 이는 넓은 V의 독립적 지느러미와 복부 조합에 다른 3D 시스템 (그림 2)에 비해 다양한 기능의 높은 수준을 제공합니다표면 상태의 ariety. 부가 적으로, 다른 세포주 및 배양 샌드위치 형 조립 상이한 시간은 가능성의 넓은 스펙트럼을 증가​​ 연구 될 수있다.

샌드위치 같은 문화의 표준 프로토콜을 사용하여 아래에 자세히 설명되어 하나 등의 기판, 단백질 코팅으로 복부 기판과 피브로넥틴 등의 유리 커버 슬립과 같은 산 (PLLA) 전기 방사 섬유 또는 필름-L-유산 폴리. 샌드위치 같은 문화는 세포 파종 후 또는 2D 문화의 3 시간 후 조립했다. 그러나, 다른 재료 시스템 및 단백질이 사용될 수 있음에 유의 마찬가지로 샌드위치 형상의 배양은 상이한 시점에서 조립 될 수있다.

프로토콜

지느러미 기판 1. 생산

1. 용매 캐스팅에 의해 PLLA의 평면 필름의 생산.
   1. 실온 완전히 (약 3 시간)에 용해 될 때까지 (RT)에서 교반하여 2 % 용액을 클로로포름 (w / v)의 PLLA (100 ㎖의 클로로포름에 2g의 PLLA)을 제조 흄 후드에서 작업.
   2. 유리 페트리 접시에 와셔를 놓습니다.
      주 : (복부 샘플 직경보다 약간 작다) 10.5 mm의 내경 사용 스테인레스 와셔 와셔 복부 기판 위에 배치되도록. 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE) 또는 유리 와셔와 같은 다른 재료도 사용될 수있다.
   3. 세탁기에서 PLLA 용액 200 μl를 추가하고 실온에서 30 분 동안 천천히 증발 할 수 있습니다. 용매의 느린 증발을 허용하기 위해, 몇 개의 구멍을 알루미늄 호일로 페트리 접시를 닫는다.
   4. 용매를 증발 추적하기 위하여 5 분 동안 120 ℃에서 샘플을 가열한다.
   5. 샘플 할 식지실온에서 WN.
   6. 샘플 (30 분 정도) 냉각 한 후, 페트리 접시 · CM 물 18.2 MΩ 커버하고 실온에서 8 분 동안 품어.
      참고 : 샘플이 완전히 냉각되지 않으면, 그들이 · 최대 CM 물을 18.2 MΩ을 가지고 고무 상태를 채택 할 수있다. 또한,보다 8 분 · CM 물 18.2 MΩ에서 배양하는 것은 부적절한 분리, 그리고 세탁기에서 분리 이상 8 분 동안 발생할 수 있습니다.
   7. 면도날로, 페트리 접시를 벗겨 와셔를 들어 올립니다.
   8. 핀셋 세탁기의 가장자리에서 모든 결함을 제거하고 샘플을 자연 건조 할 수 있습니다.
   9. PLLA는 가수 분해에 의해 분해 가능하므로 실험 일까지 진공 데시 케이 터 (80 밀리바)에서 샘플을 보관.
2. 전기 방사에 의한 PLLA 섬유의 제조.
   1. stirr하여 헥사 플루오로 이소프로판올 용액의 8 % (w / v)의 PLLA (100 ㎖의 헥사 플루오로 이소프로판올 8g의 PLLA)을 제조 흄 후드에서 작동완전히 용해 될 때까지 실온에서 보내고 (3 시간 정도).
   2. 각각 랜덤 또는 정렬 된 섬유를 얻기 위해서 알루미늄 판 또는 전기 방사를위한 드럼 상에 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE) 와셔를 놓는다.
      주 : (복부 샘플 직경보다 약간 작다) 10.5 mm의 내경 사용 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE) 와셔 와셔 복부 기판 위에 배치되도록. 스테인리스 강이나 유리 와셔와 같은 다른 재료도 사용될 수있다. 드럼 정렬 된 섬유를 얻기 위해서는 160.7 초 ^-1 (반경 = 7cm)의 각속도로 회전한다. 느린 속도는 섬유 정렬을 유발하지 않을 수 있습니다 및 빠른 속도를 절단 섬유 발생합니다.
   3. 고분자 용액을 주사기를로드하고 주사기 펌프에 놓습니다.
   4. 30 kV의 전압의 12 cm의 컬렉터 거리 0.9 ㎖ / 시간의 유속을 사용 PLLA 용액 Electrospin.
   5. 전기 방사 공정 후방 정지ER 20-30 분, (셀이 동시에 여러 섬유와 상호 작용이 있기 때문에) 회 좋은 섬유 밀도가 달성된다.
   6. 용매를 증발 추적하기 위하여 5 분 동안 120 ℃에서 샘플을 가열한다.
   7. PLLA는 가수 분해에 의해 분해 가능하므로 실험 일까지 진공 데시 케이 터 (80 밀리바)에서 샘플을 보관.

2. 샌드위치 문화

1. 세포가 복부 2D 기판에 부착되면 샌드위치와 같은 문화를 조립합니다.
   1. 문화 후드에서 작업은 무균 조건을 보장하고 30 분 동안 자외선 노출에 의해 모든 자료 (커버 글라스, 등의 기판, 핀셋 등)을 살균합니다.
   2. 순서 코트 피브로넥틴과 복부와 지느러미 기판은 특정 세포 단백질 접착을 지시합니다. 이렇게하려면, 둘 베코의 인산염 완충 식염수 (DPBS) 칼슘을 포함하는 ^{2 +} Mg를 ^{2 +} (200 μL / S에 용해 피브로넥틴의 20 μg의 / ㎖에서 샘플을 품어1 시간 동안) 충분한.
      주 : 용매 캐스트 필름과 전기 방사 섬유가 세탁기의 측면 중 하나에 부착하므로 인해 제조 공정에, 등쪽 기판 지정된 상부 및 하부면을 갖는다. 이 측면 따라서 세포 (그림 3)에 직면 하나입니다.
      1. 단백질을 코팅 한 후, 과잉의 단백질을 제거하기 위해 DPBS 두 번 샘플을 세척한다. 그런 다음이 단백질 변성의 원인부터 건조되기에서 샘플을 방지하기 위해 자신의 사용까지 DPBS에서 샘플을 품어. 가의 양이온 이후 ^{2 + 칼슘과} 마그네슘이 포함 된 사용 DPBS는 단백질 접힘을 조절한다.
   3. 유리에 종자 세포는 ¹³ 된 커버.
      참고 : 샌드위치 같은 문화가 2D 기판을 기반으로, 휴대 시드 유사하게 2D 샘플로 수행됩니다. 예를 들어,의 C2C12 근육 모세포가 분화 cm ^-1 실험 및 NIH3T3 섬유 아세포에 대한 7,000 C에서 시딩 17,500 세포로 시딩ELL 학생 센티미터 ^-1 고립 된 문화가 세포 형태 및 접착 성을 연구하기 위해.
   4. 5 % CO _2, 37 ℃ 인큐베이터에서 샘플을 배치 및 셀 3 시간 동안 복부 기판에 부착 할 수있다.
   5. (와셔 맞는 경우) 12 멀티 웰 플레이트의 새로운 우물에 복부 시드 기판을 놓습니다.
      참고 : 새로운 잘 샌드위치와 같은 문화를 조립하는 것은 이러한 영양소를 소비하고 내에서 배양 된 세포에 영향을 미치는 성장 인자 및 폐기물을 분비하기 때문에 잘 파종 후 하단에 부착 한 세포를 제거하는 방법 중 하나입니다 샌드위치 같은 시스템. 이것은 또한 샌드위치 형 환경 내에서만 배양 세포를 용균시키기 위하여 세포 추출을위한 필요한 것이다.
   6. 조심스럽게 및 핀셋의 도움으로, 세포 등의 기판을 오버레이. 매체 (1 ml)로 리필 5 % CO _2와 37 ° C에서 품어.
      참고 : 세탁기의 무게는 등의 서브를 방지 할 수 있습니다부동에서 strate.
   7. 표준 2 차원 문화로 일주일에 두 번 매체를 변경합니다. 이 세포가 손상 될 수 있기 때문에 등의 기판을 이동하지 마십시오.
2. 단지 세포 파종 후 샌드위치와 같은 문화를 조립합니다.
   1. 문화 후드에서 작업은 무균 조건을 보장하고 30 분 동안 자외선 노출에 의해 모든 자료 (커버 글라스, 등의 기판, 핀셋 등)을 살균합니다.
   2. 순서 코트 피브로넥틴과 복부와 지느러미 기판은 특정 세포 단백질 접착을 지시합니다. 이렇게하려면, ^칼슘 및 마그네슘 ^{2 +} 1 시간 동안 (200 μL / 샘플)를 포함 DPBS에 용해 피브로넥틴의 20 μg의 / ㎖에서 샘플을 품어.
      1. 단백질을 코팅 한 후, 과잉의 단백질을 제거하기 위해 DPBS 두 번 샘플을 세척한다. 그런 다음이 단백질 변성의 원인부터 건조되기에서 샘플을 방지하기 위해 자신의 사용까지 DPBS에서 샘플을 품어. ^칼슘과 마그네슘이 포함 된 사용 DPBS 2+까지 가의 양이온은 단백질 접힘을 조절하기 때문이다.
   3. (와셔에 맞게) 12 멀티 웰 플레이트의 잘 커버 글라스에 씨앗 세포. 이를 위해, 등쪽 기판 누워 후 세포의 손실을 방지하기 위해 고농도의 세포 현탁액을 사용한다.
   4. 조심스럽게 및 핀셋의 도움으로, 세포 등의 기판을 오버레이. 매체 (1 ml)로 리필 5 % CO _2와 37 ° C에서 품어.
      참고 : 세탁기의 무게는 부동에서 지느러미 기판을 방지 할 수 있습니다.
   5. 표준 2 차원 문화로 일주일에 두 번 매체를 변경합니다.
      참고 :이 세포 손상을 초래할 수 있기 때문에 등의 기판을 이동하지 마십시오.

3. 분석

주 : 샌드위치 형 2D 배양 기질에 기초하고 있으며, 그래서 일반적으로 이미 표준 2D 배양을 위해 개발 과정에 의해 분석 될 수있다. 예를 들어, 이후 PLLA는 투명하고 CEL입니다LS가 xy 평면 내에서 이동 제한됩니다, 현미경은 2D 기판에로 이루어집니다. 세포 이동 따라서 실험 및 이미지 분석을 단순화 3D 배양 용으로서 Z 축에서 트래킹 셀의 필요없이, 2 차원 배양 용으로 분석 될 수있다. 스크래치 분석에 의해 상처 치유 분석을 연구하려면이 프로토콜을 따르

1. 샌드위치 같은 문화 내에서 연구 세포 이동 (상처 치유 분석).
   1. 문화 후드에서 작업은 무균 조건을 보장하고 30 분 동안 자외선 노출에 의해 모든 자료 (커버 글라스, 등의 기판, 핀셋 등)을 살균합니다.
   2. 순서 코트 피브로넥틴과 복부와 지느러미 기판은 특정 세포 단백질 접착을 지시합니다. 이렇게하려면 1 시간 동안 둘 베코 인산염 완충 식염수 (DPBS) 칼슘을 포함하는 ^{2 +} Mg를 ^{2 +에} 용해 피브로넥틴의 20 μg의 / ㎖에서 샘플을 품어.
      1. 단백질 코팅 후 DPBS 두 번 샘플을 씻어순서를 초과하는 단백질을 제거합니다. 이어서 단백질 변성을 일으킬 수이 때문에 건조 샘플을 얻는 것을 방지하기 위해, 이들의 사용까지 DPBS에서 샘플을 배양. 가의 양이온 이후 ^{2 + 칼슘과} 마그네슘이 포함 된 사용 DPBS는 단백질 접힘을 조절한다.
   3. 고밀도 ^(13)에 커버 글라스에 종자 세포.
   4. 5 % CO _2, 37 ℃ 인큐베이터에서 샘플을 배치 및 세포가 합류를 달성 할 수있다.
   5. 간격으로 구분이 세포 인구를 얻기 위해 세포 단일 층을 긁어 피펫 팁을 사용합니다.
   6. 시간 경과 수집을위한 새로운 잘 적합한에서 복부 시드 기판을 놓고 등의 기판 (즉, 12 멀티 웰 플레이트)을 맞게한다.
   7. 조심스럽게 및 핀셋의 도움으로, 세포 등의 기판을 오버레이하고 (12 멀티 웰 플레이트 1 ㎖) 매체 리필.
      주 : 세탁기의 중량을 방지 할 t그는 부동에서 기판을 지느러미.
   8. 시간 경과 현미경에서 샘플을 배치 (37 ° C로 설정하고, 5 % CO _2)와 갭 폐쇄 매 20 분의 이미지를 가져 가라.
   9. 같은 ImageJ에에서 플러그인 MiToBo로 특정 소프트웨어를 사용하여 갭 폐쇄를 분석한다. ⁽¹⁴⁾

주 : 단백질 및 핵산 추출은 기판 상에 2 차원으로 유사하게 수행된다. 추출 효율을 증가시키기 위해 세포에 직접 용해 완충액을 추가 샌드위치 형 배양 분해로 이루어져 하나의 추가 단계가있다. 예를 들어, mRNA의 추출 :

2. 샌드위치 같은 문화에서의 mRNA를 추출
   1. 제조업체의 지시에 따라 상업용 키트에서 모든 버퍼를 준비한다.
   2. 인큐베이터에서 밖으로 샌드위치와 같은 문화를 가지고.
   3. 샘플에서 배양 배지를 제거합니다.
   4. DPBS이 칼슘을 함유 한 번 샘플을 씻으십시오Mg를 2+ ²⁺ (1 mL) 및 모든 용액을 제거한다.
   5. 핀셋의 도움으로, 등의 기판을 제거하고 복부 기판에 용해 버퍼 (350 μL)를 추가합니다. 또한 지느러미 기판에 부착 세포를 용균시키기 위해 다시 복부 기판 지느러미 기판 오버레이.
   6. 분해 용액을 분리하는 등의 기판을 제거합니다.
   7. 의 mRNA를 얻기 위해 제조업체의 지침을 따르십시오.

참고 : 단백질의 면역 적 또한 2D 기판에로 수행 할 수 있습니다. 샌드위치 같은 문화가 항체와 버퍼의 올바른 확산을 방해 할 수 있기 때문에, 배양 시간이 증가한다. 또한, 샌드위치 염색 프로토콜을 시작하기 전에 분해 될 수 있지만, 후자의 경우 일부 셀은 등쪽 기판 및 기판에 대한 일부 복부에 부착 된 상태를 유지한다.

3. 샌드위치 같은 문화 내에서 Immunodetect 단백질
   1. DPBS 한 번 샘플을 세척하고 4 ℃에서 20 분 동안 PBS에서 4 % 포름 알데히드로 고정한다.
      주 : 도설 기판 확산 문제를 회피되도록 정착 과정에서 제거 될 수있다.
   2. DPBS (1 ml)으로 헹군 후, RT에서 5 분 동안 0.5 % DPBS에서 트리톤 X-100 (1 ml)로 Permeabilize 하시려면.
   3. RT에서 30 분 동안 1 % DPBS 알부민 (1 mL)로 비특이적 결합 부위를 차단.
   4. 일차 항체와 함께 품어 (2 μg의 / ㎖ 1 ml)을 실온에서 3 시간 동안 솔루션을 차단한다.
   5. DPBS 10 분 / 0.5 % 트윈 20 (1 ㎖)에 대해 3 회 반복한다.
   6. 실온에서 용액 (1 ml)에 차단하는 이차 항체 (2 μg의 / ㎖) 및 1 μg의 / ㎖ DAPI와 2 시간을 품어.
   7. DPBS에서 10 분 / 0.5 % 트윈 20 (1 ㎖)에 대해 3 회 반복한다.
   8. DPBS에 씻으십시오.
      참고 : 시료는 Vectashield와 슬라이드에 장착 등의 기판 전에 면역을 제거 할 때 매니큐어로 밀봉 할 수있다.
   9. 형광 마이크로 하에서 관찰표준 2D 기판 용으로 범위.

결과

샌드위치 형 배양 내 등쪽 수용체의 자극은 세포 형태학, 세포 부착 및 세포 내 신호 전달 경로 (예, 국소 유착 키나제, FAK) ^10-12의 변화를 트리거한다. 다른 3D 배양 ^15,16 관찰로서 예를 들어, 샌드위치 형 시스템 내에서의 배양 섬유 아세포는 2D에 비해 ₅ 인테그린 α 서브 유닛을 과발현.

셀 운명은 하이드로 겔과 같은 다른 3D 시스템에서 발생하는...

토론

요즘, 3D 문화는 암을 포함한 세포 생물학에서 중요한 제약 및 생명 공학 산업을위한 주제뿐만 아니라 연구이고, 줄기 세포. 결과적으로 여러 3 차원 배양 시스템이 개발되어왔다. 불행히도, 3D 시스템 간의 차이는 일반적으로 세포의 운명 이해를 방해하는 다른 셀 동작이 발생할. 또한, 실험 절차는 일반적으로 2D 문화 시스템처럼 간단하지 않다. 따라서, 이들 단점 중 일부는 매우 중요하다 극복하?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ploy(lactic acid)	NatureWorks	4042D	Reagent
Cover glasses (12 mmØ)	Marienfeld	631-0666	Equipment
Chloroform	Scharlab	CL0200	Reagent
1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP)	Sigma	105228	Reagent
Syringe (1 ml)	Henke Sass Wolf	4010-200V0	Equipment
Syringe pump	New Era Pump Systems	NE1000	Equipment
High Voltage DC Power Supply	Glassman High Voltage	Series FC	Equipment
Incubator	Hucoa-Herlös	3111	Equipment
Laminar flow  hood	Telstar	AV30/70	Equipment
Human Fibronectin	Sigma	F2006	Reagent
RNeasy Micro Kit	Qiagen	74004	Reagent
Inverted microscope	Leica Microsystems	DMI 6000	Equipment
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Reagent
Albumin	Sigma-Aldrich	A7409	Reagent
Tween 20	Sigma-Aldrich	P2287	Reagent