שיטות לעכב קטריאלי Pyomelanin ייצור וקבעו את הגידול המקביל ברגישות לסטרס חמצונים

Summary

Bacterial pyomelanin production results in increased resistance to oxidative stress and virulence. We report on techniques that can be used to determine inhibition of pyomelanin production and assay the resulting increase in sensitivity to oxidative stress in bacteria, as well as determine antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC).

Abstract

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism pathway and contributes to increased oxidative stress resistance. Pyomelanin production in Pseudomonas aeruginosa is reduced in a dose dependent manner through treatment with 2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC). We describe a titration method using multiple concentrations of NTBC to determine the concentration of drug that will reduce or abolish pyomelanin production in bacteria. The titration method has an easily quantifiable outcome, a visible reduction in pigment production with increasing drug concentrations. We also describe a microtiter plate method to assay antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC) in bacteria. This method uses a minimum of resources and can easily be scaled up to test multiple antibiotics in one microtiter plate for one strain of bacteria. The MIC assay can be adapted to test the affects of non-antibiotic compounds on bacterial growth at specific concentrations. Finally, we describe a method for testing bacterial sensitivity to oxidative stress by incorporating H₂O₂ into agar plates and spotting multiple dilutions of bacteria onto the plates. Sensitivity to oxidative stress is indicated by reductions in colony number and size for the different dilutions on plates containing H₂O₂ compared to a no H₂O₂ control. The oxidative stress spot plate assay uses a minimum of resources and low concentrations of H₂O₂. Importantly, it also has good reproducibility. This spot plate assay could be adapted to test bacterial sensitivity to various compounds by incorporating the compounds in agar plates and characterizing the resulting bacterial growth.

Introduction

Pseudomonas aeruginosa is a Gram negative bacterium that produces a variety of pigments including pyomelanin, a red-brown pigment that helps provide protection from oxidative stress^1-4 and binds a variety of compounds, including aminoglycoside antibiotics^5-7. Pyomelanin production is caused by a defect in the tyrosine catabolism pathway^4,8, either through deletions or mutations of the gene encoding homogentisate 1,2-dioxygenase (HmgA)^1,9 or through imbalances in the various enzymes in the pathway¹⁰. Homogentisate accumulates due to inactivation of HmgA, and is secreted and oxidized to form pyomelanin¹¹. Production of pyomelanin can be abolished or reduced in a dose dependent manner through treatment with the herbicide 2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC)¹², which inhibits 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (Hpd) in the tyrosine catabolism pathway¹³. Hpd is required for the formation of homogentisate, and therefore pyomelanin¹¹.

We describe in detail three techniques that were important in our studies of NTBC treatment of pyomelanin producing strains of P. aeruginosa. These techniques include titration of NTBC to determine the concentrations that will abolish or reduce pyomelanin production in laboratory and clinical pyomelanin producing strains, determination of the minimum inhibitory concentration (MIC) of antibiotics when bacteria are treated with NTBC, and the resulting sensitivity to oxidative stress with NTBC treatment.

The titration assay we developed serves two purposes. First, the assay will allow the user to determine if NTBC can abolish or reduce pyomelanin production in the bacterium being studied and at which concentrations. This will allow the user to determine sensitivity to NTBC, since different strains of bacteria may have different sensitivities to this compound, as observed in P. aeruginosa¹². Second, the NTBC titration assay will allow the user to determine the appropriate concentration of NTBC to use in subsequent assays, such as antibiotic MIC and oxidative stress response assays, if the goal is to abolish or reduce pyomelanin production and determine the effects of pigment reduction.

The titration assay works because a visible difference in pyomelanin production can be seen in strains treated with NTBC and the differences in pyomelanin production are dose dependent¹². Additionally, this technique can be applied to the study of other compounds that may eliminate or enhance pigment production in bacteria.

Antibiotic MICs are used to determine the sensitivity of bacteria to antibiotics. There are several methods to determine MICs, including agar dilution plates and broth dilutions¹⁴. Broth dilutions can be performed in small test tubes or in a 96-well microtiter plate. The microtiter plate method of MIC determination described herein will allow the user to test a wide range of antibiotics using a minimum of resources. The assay provides reproducibility as well as flexibility in the number of antibiotics and strains tested by this method. Additionally, with the incorporation of NTBC in the assay, the user can determine if elimination or reduction of pyomelanin production alters antibiotic sensitivity in bacteria that produce pyomelanin.

Bacterial response to oxidative stress can be tested in several ways. The most common methods described are either viable counts of bacteria subjected to oxidative stress for a period of time¹, or oxidative stress disc diffusion assays¹⁵. These methods tend to use high concentrations of oxidative stressors to examine the effects of oxidative stress in bacteria and results can be quite variable between biological replicates. The viable count assay also tends to use more agar plates than the other methods. The spot plate assay we describe uses low concentrations of H₂O₂ and allows the user to test the oxidative stress response of multiple strains using a minimum of plates. The assay is also consistently reproducible between technical and biological replicates. As pyomelanin is involved in resistance to oxidative stress, the incorporation of NTBC in the assay allows the user to determine the effects of elimination of pyomelanin production on oxidative stress resistance.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. הכנת תרבות מדיה, אנטיביוטיקה, ו2- [2-ניטרו-4 (trifluoromethyl) נזואיל] -1,3-cyclohexanedione (טיפול עם NTBC)

1. הפוך מרק LB (tryptone 1%, 0.5% תמצית שמרים, 0.25% NaCl בH ₂ O) וaliquot לתוך כרכים מתאימים. לעקר על ידי החיטוי. לאחסן בטמפרטורת חדר.
2. הפוך 100 מיליליטר אגר LB (tryptone 1%, 0.5% תמצית שמרים, 0.25% NaCl, אגר 1.5% בH ₂ O) ב 250 מיליליטר צלוחיות. לעקר על ידי החיטוי ולאחסן בטמפרטורת חדר. ודא שאגר הוא נמס לפני המזיגה לצלחות.
   הערה: צלוחיות המכילות אגר LB 100 מיליליטר יניב 4 צלחות. הסכום של אגר LB ניתן לשנות למתאים למספר הצלחות הדרושות עבור assay.
3. הפוך PBS (137 מ"מ NaCl, 2.7 מ"מ KCl, 10 מ"מ Na _{2 4} HPO, 2 מ"מ KH ₂ PO ₄₎ ^16. לעקר על ידי החיטוי או סינון ולאחסן בטמפרטורת חדר.
4. הכן את פתרונות מניות האנטיביוטיקה לגנטמיצין, kanamycin,tobramycin ד.
   1. הכן ריכוזי המניה אנטיביוטיים מתאימים לפ זני aeruginosa המכילים 100 מ"ג / מיליליטר גנטמיצין, 30 מ"ג / מיליליטר kanamycin, ו -10 מ"ג / מיליליטר tobramycin. ממיסים את האנטיביוטיקה במים, סנן לעקר (0.2 מיקרומטר), וחנות על 4 מעלות צלזיוס. לשנות את האנטיביוטיקה וריכוזים בהתאם לחיידק למד.
5. הכן את פתרונות מניות הטיפול עם NTBC. ממיסים 10 מ"ג בטיפול עם NTBC ב400 μl של DMSO. זה מניב ריכוז של 75.9 מ"מ טיפול עם NTBC. פתרונות מניות טיפול עם NTBC חנות ב -20 ° C. פתרונות הפשרה בטמפרטורת חדר כנדרש.
   יש מקורות שונים בטיפול עם NTBC הבדלים במסיסות: הערה. לקבוע את הרכב המתאים שבי לפזר את הטיפול עם NTBC מבוסס על המלצות היצרן ולהתאים שלב 1.5 בהתאם.

2. טיפול עם NTBC titrations של זני חיידקים

1. תרבויות לילה הוקמו של הזנים להיבדק. הוסף 2 מבחנת מרק 16 x 150 מ"מ מיליליטר LBים (אחד לכל זן) ולחסן עם 1 מושבה מבודדת מכל זן. דגירה הלילה על 37 מעלות צלזיוס עם אוורור על הכתף תרבית רקמה בחממת אוויר.
2. למחרת, להכין titrations בטיפול עם NTBC במרק LB. השתמש במגוון ראשוני 0-900 מיקרומטר טיפול עם NTBC מאז יש לי זנים שונים הבדלים ברגישות לטיפול עם NTBC.
   1. הוסף 1 מיליליטר מרק LB ל4 עד 5 מבחנות (16 x 150 מ"מ) לכל זן.
   2. מוסיף את פתרון הטיפול עם NTBC המניות (75.9 מ"מ) למבחנות (16 x 150 מ"מ) בטווח של ריכוזים. ראה טבלת 1 לריכוזי טיפול עם NTBC וכרכי המניה מקביל להוסיף 1 מיליליטר של מרק LB.
3. מדוד את OD ₆₀₀ של תרבויות הלילה. לשטוף תרבויות לפני נטילת OD ₆₀₀ קריאות לחיסול pyomelanin נוכחי בתקשורת.
   1. שטוף את התרבויות על ידי צנטריפוגה 1 מיליליטר של התרבות בmicrocentrifuge ב16,000 XG למשך 2 דקות. הסר את supernatant וכל תאים באופן רופף טבליות עםmicropipettor וresuspend תא גלולה המוצק ביטראות 1 מיליליטר
4. לחסן צינורות טיטרציה בOD ₆₀₀ 0.05. לחשב את הסכום של תרבות שטפה הדרוש כדי לחסן את הצינורות.
   הערה: השתמש בתרבויות נשטפו לחיסונים מאז pyomelanin לא צריך להיות נוכח.
5. דגירה צינורות טיטרציה לכ 24 שעות על 37 מעלות צלזיוס עם אוורור באמצעות מסובב תרבית רקמה בחממת אוויר.
6. לצלם את צינורות טיטרציה ולהשוות ייצור פיגמנט בתוך ובין הזנים לקבוע את הסכום בטיפול עם NTBC להשתמש עבור מבחני MIC וסטרס חמצונים. השתמש OD ₆₀₀ קריאות על מנת לקבוע את הסכום של pyomelanin בsupernatant התרבות החופשי תא ולקבוע צפיפות תאים.
   הערה: OD ₆₀₀ היחס של pyomelanin בsupernatant התרבות לתאים ניתן לחשב לכמת הבדלים בייצור pyomelanin לאחר טיפול בטיפול עם NTBC.

3. אנטיביוטיקה מינימאלית מעצוריםריכוז Assay הטורים (MIC) בצלחות 96-היטב

1. תרבויות לילה הוקמו של הזנים להיבדק בLB עם ובלי טיפול עם NTBC.
   הערה: פרוטוקול זה מתואר באמצעות רמת הנציג של 300 מיקרומטר טיפול עם NTBC. הרמה המתאימה של טיפול עם NTBC לשמש נקבעה בשלב 2.6.
   1. להוסיף 300 מיקרומטר טיפול עם NTBC 2 מיליליטר ליטראות הוסף נפח שווה ערך של רכב (DMSO) 2 מיליליטר LB למצב לא טיפול עם NTBC.
   2. שימוש בקיסמי סטרילי, לחסן צינורות עם מושבה מבודדת אחד של חיידקים. יהיה תרבות אחת עם טיפול עם NTBC ותרבות אחת ללא טיפול עם NTBC עבור כל זן. דגירה הלילה על 37 מעלות צלזיוס עם אוורור באמצעות מסובב תרבית רקמה בחממת אוויר.
2. למחרת, להפוך את LB + טיפול עם NTBC ופתרונות אדון LB + DMSO להקמת assay MIC. להוסיף טיפול עם NTBC בריכוז של 600 מיקרומטר כזה יהיה מדולל שני פי כאשר הבידוד נוסף, מניב ריכוז סופי של 300 מיקרומטר.
   1. כדי לבדוק antibi אחדotic לזן אחד, להוסיף 600 מיקרומטר טיפול עם NTBC 2 מיליליטר LB ולערבב כדי להפוך את פתרון אדון הטיפול עם NTBC. הוסף נפח שווה ערך של רכב (DMSO) 2 מיליליטר LB ולערבב כדי להפוך אין פתרון אדון טיפול עם NTBC. השתמש בפתרונות אלה ליצירת פתרונות מניות אנטיביוטיות, כמו גם להקמת סדרת הדילול ב96-גם צלחות.
      הערה: הניסוחים פתרון האדון יניבו פתרון נוסף כדי להסביר שגיאות pipetting. ניתן לשנות את פתרונות שהאדון למעלה או למטה, כנדרש בהתאם למספר של אנטיביוטיקה וזנים שנבדק.
3. הכן את הפתרונות אנטיביוטיים בפתרונות אדון LB + טיפול עם NTBC או LB + DMSO.
   הערה: ריכוז האנטיביוטיקה בפתרונות אלה צריך להיות כפולים הריכוז הרצוי הסופי. פתרון מספיק צריך להיעשות כדי להעביר 100 μl לארבע בארות בצלחת 96-היטב.
   1. הכן גנטמיצין +/- פתרון מניות בטיפול עם NTBC 64 מיקרוגרם / מיליליטר. כדי להפוך את הפתרון הזה, להוסיף 0.288 μl של מניית גנטמיצין (100 מ"ג / מיליליטר) עד 450μl LB + טיפול עם NTBC או פתרון אדון LB + DMSO.
      הערה: הריכוז המרבי של גנטמיצין לפ aeruginosa PAO1 הוא 32 מיקרוגרם / מיליליטר.
   2. הפוך kanamycin +/- פתרון מניות בטיפול עם NTBC 256 מיקרוגרם / מיליליטר. כדי להפוך את הפתרון הזה, להוסיף 3.84 μl של מניית kanamycin (30 מ"ג / מיליליטר) לפתרונות אדון 450 μl LB + טיפול עם NTBC או LB + DMSO.
      הערה: הריכוז המרבי של kanamycin לפ aeruginosa PAO1 הוא 128 מיקרוגרם / מיליליטר.
   3. הכן tobramycin +/- פתרון מניות בטיפול עם NTBC 8 מיקרוגרם / מיליליטר. כדי להפוך את הפתרון הזה, להוסיף 0.36 μl של מניית tobramycin (10 מ"ג / מיליליטר) לפתרונות אדון 450 μl LB + טיפול עם NTBC או LB + DMSO.
      הערה: לפ aeruginosa PAO1, את הריכוז המרבי של tobramycin הוא 4 מיקרוגרם / מיליליטר.
      הערה: ניתן להתאים האנטיביוטיקה והריכוזים לחיידקים להיבדק.
4. להוסיף לכל פתרון אנטיביוטי 2x 100 μl לארבע בארות בצלחת 96-היטב. מניחים את הפתרונים הללו בא השורה לexamplדואר, גנטמיצין צריך להיות ממוקם בA1 דרך A4, kanamycin צריך להיות ממוקם בA5 דרך A8, וtobramycin צריך להיות ממוקם בA9 דרך A12. ראה איור 1 א לתרשים של צלחת 96-היטב להגדיר.
   הערה: ניתן לבדוק אנטיביוטיקה מרובה בצלחת אחת, אבל רק אחת מתח צריך להיבדק לכל צלחת לחסל את הפוטנציאל לזיהום צולב מזנים אחרים.
5. הוסף 50 μl של פתרון אדון LB + הטיפול עם NTBC או LB + DMSO לשורות 'עד ח' לצלחת 96-היטב. ודא שצלחת אחת הוא LB + טיפול עם NTBC וצלחת אחת היא LB + DMSO. ראה איור 1 א.
   1. השתמש LB + טיפול עם NTBC לאנטיביוטיקה בLB + טיפול עם NTBC. השתמש LB + DMSO לאנטיביוטיקה בLB + DMSO.
6. שימוש micropipettor לבצע שני דילולים סדרתי של פי האנטיביוטיקה על ידי העברת 50 μl של הפתרון משורה לשורה ב מערבבים את הפתרון, לשנות את הטיפים pipet, ולהעביר 50 μl של הפתרון מהשורה B לחתור חזור ג ל remainiשורות ng. לאחר דילול השורה G, להסיר 50 μl של הפתרון שמהשורה ופסולה. השתמש H שורה כמו אין שליטת אנטיביוטיקה להתפתחות חיידקים. ראה איור 1.
   הערה: כל גם בשורות באמצעות G מכילה כעת 50 μl של אנטיביוטיקה בLB + טיפול עם NTBC או LB + DMSO ב2X הריכוז הרצוי הסופי. שורת H מכיל LB + טיפול עם NTBC או LB + DMSO ללא אנטיביוטיקה.
7. מדוד את OD ₆₀₀ של תרבויות הלילה. לשטוף את כל התרבויות לפני נטילת OD ₆₀₀ קריאות לחיסול pyomelanin הנוכחי בתקשורת.
   1. שטוף את התרבויות על ידי צנטריפוגה 1 מיליליטר של התרבות בmicrocentrifuge ב16,000 XG למשך 2 דקות. הסר את supernatant עם micropipettor וresuspend התא גלולה ביטראות 1 מיליליטר
8. לדלל את תרבויות הלילה ל2.75x10 ⁵ / מיליליטר CFU ביטראות
   הערה: תניח שיחידה אחת OD ₆₀₀ היא המקבילה של 1x10 ⁹ CFU / ml לפ aeruginosa. OD לCFU / המרות מיליליטר ניתן הייתifferent בחיידקים אחרים.
9. הוסף 50 μl של תרבות חיידקים בדילול ולמתאים.
   הערה: תרבויות גדלו בטיפול עם NTBC יש להוסיף לבארות המכילות טיפול עם NTBC ותרבויות גדלו בDMSO יש להוסיף לבארות המכילות DMSO. ראה איור 1.
   1. להוסיף חיידקים לשלוש בארות עבור כל זן וריכוז אנטיביוטיקה. הוסף 50 μl של LB ולרביעי לפעול כביקורת לזיהום חיידקים. ראה איור 1.
   2. השתמש micropipettor רב-ערוצים לחסן את הבארות. ודא שpipet טיפים הם קרובים לתחתית של הבארות בעת הוספת הבידוד על מנת למנוע זיהום של בארות הסמוכות.
      הערה: הוספת תרבית חיידקים לבארות יהיה לדלל את ריכוזי אנטיביוטיקה וטיפול עם NTBC שני קיפול.
10. מכסה את 96-גם הצלחות עם parafilm ודגירה כ 24 שעות על 37 מעלות צלזיוס. דגירה 96-גם צלחות באופן סטטי, בחממת אוויר.
11. בדוקהצלחות להתפתחות חיידקים בבארות. MIC הוא הריכוז הנמוך ביותר של אנטיביוטיקה שבאין צמיחת חיידקים נתפסת לכל שלושת משכפל של כל זן.
    1. מבחינה ויזואלית לבחון את הצלחת לצמיחה או לקרוא באמצעות קורא צלחת קבוצה לOD _600.

Assay פלייט 4. ספוט לתגובה לחץ חמצוני

1. תרבויות לילה הוקמו של הזנים להיבדק בLB עם ובלי טיפול עם NTBC כמתואר בשלב 3.1.
2. למחרת, להכין צלחות אגר LB המכילות H ₂ O ₂ כלחץ חמצוני. מגוון של H ₂ O ₂ ריכוזים 0-1 מ"מ הוא נקודת התחלה טובה.
   1. ממסים את צלוחיות אגר LB. תקשורת מגניב כ 50 מעלות צלזיוס בטמפרטורת חדר.
   2. להוסיף H ₂ O ₂ ישירות לתקשורת מקוררת בריכוזים הרצויים. צלוחיות מערבולת לערבב. ראה טבלה 2 לריכוזים של H ₂ O ₂וכרכים של H ₂ O ₂ המרוכז להוסיף. ערכים אלה מבוססים על של אגר LB 100 מיליליטר.
   3. יוצקים צלחות מייד לאחר הוספת H ₂ O ₂ ולהבת פני השטח כדי להסיר בועות. התשואה היא 4 צלחות לשל אגר LB 100 מיליליטר. סמן את הצלחות עם ריכוז H ₂ O _2.
   4. מקם את הצלחות שנחשפו בזרימה מכסה המנוע ביולוגי עם המאוורר פועל למשך 30 דקות כדי להסיר לחות עודפת מהצלחות.
      הערה: השתמש בצלחות באותו היום הם מוכנים. הימנעות מלעשות זאת עלולה לגרום לנתונים לא עקביים.
      הערה: לחץ חמצוני כגון paraquat ניתן להחליף לH ₂ O ₂ בassay זה. הריכוזים המשמשים לגורמי דחק חמצוני אחרים עשויים להיות שונים מאלה ששימשו לH ₂ O _2.
3. לשטוף ולמדוד את OD ₆₀₀ של תרבויות הלילה כמתואר בשלב 3.7.
4. לנרמל את OD ₆₀₀ של כל מ"ק הלילהltures לערך הנמוך ביותר לקבוצה של זנים שנבדק. פ aeruginosa בדרך כלל יש OD ₆₀₀ של כ 2.5 כאשר גדלו הלילה בLB + טיפול עם NTBC או LB + DMSO.
   1. לקבוע את עוצמת הקול של התרבות צריכה לדלל את התרבות לOD הנמוך ביותר ₆₀₀ בהיקף כולל של 1 מיליליטר. לדוגמא, אם יש תרבות OD ₆₀₀ של 3 וOD הנמוך ביותר ₆₀₀ לקבוצה של זנים הוא 2.5, לבצע את החישוב הבא: (2.5) (1 מיליליטר) = (3) (x). x = .833 מיליליטר. .833 מיליליטר של התרבות יוצב בצינור microfuge.
   2. לחשב את הסכום של LB + טיפול עם NTBC (300 מיקרומטר) או LB + DMSO צריך להביא את תרבות נפח 1 מיליליטר. לדוגמא בשלב 4.4.1, הסכום של LB + טיפול עם NTBC או LB + DMSO הוסיף לתרבות יהיה .167 מיליליטר (1 מיליליטר נפח כולל - .833 מיליליטר תרבות). הפוך פתרונות מניות של LB + טיפול עם NTBC וLB + DMSO לשימוש עבור דילולים אלה בהתבסס על הנפח הדרוש לדילול כל הזנים.
   3. מערבבים את התרבות וLB + NTBC או LB + DMSO ידי vortexing.
5. כדי לשמור על תרבויות בריכוז קבוע בטיפול עם NTBC או DMSO, לבצע עשרה דילולים סדרתי של פי תרבויות הלילה המנורמלת בPBS + טיפול עם NTBC או PBS + DMSO.
   1. הפוך פתרונות מניות של PBS + טיפול עם NTBC וPBS + DMSO. לקבוצה אחת של דילולים לזן אחד, לערבב טיפול עם NTBC מיקרומטר 300 או נפח שווה של DMSO עם PBS להניב בנפח כולל של 720 μl. קנה מידה של מניות אלה למעלה או למטה, תלוי כמה זנים נבדקים.
   2. צינורות microfuge תווית עבור 10 ^-1 בדילולים 10 ^-7 סידוריים. להוסיף 90 μl של PBS + טיפול עם NTBC או PBS + DMSO לצינורות המתאימים. השתמש PBS + טיפול עם NTBC לזנים גדלו בLB + טיפול עם NTBC ולהשתמש PBS + DMSO לזנים גדלו בLB + DMSO.
   3. הוסף 10 μl של תרבות לצינור הדילול המתאים 10 ^-1. מערבבים על ידי vortexing ולהעביר 10 μl של דילול 10 ^-1 לצינור דילול 10 ^-2. חזור על פעולה עד כל דילולים היו performed. לשנות טיפים pipet בין דילולים.
6. 5 μl ספוט של 10 ^-3 דרך 10 ^-7 דילולים על ₂ O ₂ צלחות LB + H בשני עותקים עבור כל זן. השתמש בקצה pipet אחד אם כתמים הם מצופים מרוב לדלל לדלל לפחות (10 ^-7 עד 10 ^-3). לא להטות או להטות את הצלחת עד שהנוזלים התייבשו לתוך הצלחת.
7. דגירה הצלחות במשך 24-48 שעות על 37 מעלות צלזיוס (חממת אוויר), בהתאם לזן.
   הערה: פ aeruginosa PAO1 תהיה מושבות בגודל טובות על LB לאחר 24 שעות של דגירה. דגירה זנים עד שיש להם מושבות בערך באותו הגודל כמו PAO1.
8. לצלם את הצלחות באמצעות מצלמת CCD מעל transluminator. לחלופין, לערוך את התמונות לניגוד ויבול באותו הגודל. לספור את מספר המושבות בכל מקום כדי לקבוע שינויים ברגישות ללחץ חמצוני.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

titrations טיפול עם NTBC

Titrations הטיפול עם NTBC שימש כדי לקבוע אם הטיפול עם NTBC היה מסוגל להפחית את ייצור pyomelanin בפ aeruginosa, וגם לזהות את הריכוז בטיפול עם NTBC שמבטל או מקטין pyomelanin ייצור לשימוש במבחנים נוספים. ייתכנו שינויים ברמות של pyomelanin מיו...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

The NTBC titration method described in this protocol will allow the user to determine if NTBC can reduce or eliminate pyomelanin production in bacteria, and determine the concentration of NTBC required. The most critical step in the NTBC titration assay is determining the range of NTBC concentrations to use in the assay. Different strains of P. aeruginosa have different sensitivities to NTBC, and laboratory strains may be more sensitive to NTBC than clinical isolates¹² (Figure 2). The...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC)	Sigma-Aldrich	SML0269-50mg	Also called nitisinone.  Soluble in DMSO.
H2O2	Sigma-Aldrich	216763-100ML	30 wt. % in H2O.  Stabilized.
Gentamicin	Gold Bio	G-400-100	Soluble in H2O.  Filter sterilize.
Kanamycin	Fisher Scientific	BP906-5	Soluble in H2O.  Filter sterilize.
Tobramycin	Sigma-Aldrich	T4014-100MG	Soluble in H2O.  Filter sterilize.