Métodos para inibir bacteriana Pyomelanin Produção e determinar o correspondente aumento de sensibilidade ao estresse oxidativo

Resumo

Bacterial pyomelanin production results in increased resistance to oxidative stress and virulence. We report on techniques that can be used to determine inhibition of pyomelanin production and assay the resulting increase in sensitivity to oxidative stress in bacteria, as well as determine antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC).

Resumo

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism pathway and contributes to increased oxidative stress resistance. Pyomelanin production in Pseudomonas aeruginosa is reduced in a dose dependent manner through treatment with 2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC). We describe a titration method using multiple concentrations of NTBC to determine the concentration of drug that will reduce or abolish pyomelanin production in bacteria. The titration method has an easily quantifiable outcome, a visible reduction in pigment production with increasing drug concentrations. We also describe a microtiter plate method to assay antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC) in bacteria. This method uses a minimum of resources and can easily be scaled up to test multiple antibiotics in one microtiter plate for one strain of bacteria. The MIC assay can be adapted to test the affects of non-antibiotic compounds on bacterial growth at specific concentrations. Finally, we describe a method for testing bacterial sensitivity to oxidative stress by incorporating H₂O₂ into agar plates and spotting multiple dilutions of bacteria onto the plates. Sensitivity to oxidative stress is indicated by reductions in colony number and size for the different dilutions on plates containing H₂O₂ compared to a no H₂O₂ control. The oxidative stress spot plate assay uses a minimum of resources and low concentrations of H₂O₂. Importantly, it also has good reproducibility. This spot plate assay could be adapted to test bacterial sensitivity to various compounds by incorporating the compounds in agar plates and characterizing the resulting bacterial growth.

Introdução

Pseudomonas aeruginosa is a Gram negative bacterium that produces a variety of pigments including pyomelanin, a red-brown pigment that helps provide protection from oxidative stress^1-4 and binds a variety of compounds, including aminoglycoside antibiotics^5-7. Pyomelanin production is caused by a defect in the tyrosine catabolism pathway^4,8, either through deletions or mutations of the gene encoding homogentisate 1,2-dioxygenase (HmgA)^1,9 or through imbalances in the various enzymes in the pathway¹⁰. Homogentisate accumulates due to inactivation of HmgA, and is secreted and oxidized to form pyomelanin¹¹. Production of pyomelanin can be abolished or reduced in a dose dependent manner through treatment with the herbicide 2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC)¹², which inhibits 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (Hpd) in the tyrosine catabolism pathway¹³. Hpd is required for the formation of homogentisate, and therefore pyomelanin¹¹.

We describe in detail three techniques that were important in our studies of NTBC treatment of pyomelanin producing strains of P. aeruginosa. These techniques include titration of NTBC to determine the concentrations that will abolish or reduce pyomelanin production in laboratory and clinical pyomelanin producing strains, determination of the minimum inhibitory concentration (MIC) of antibiotics when bacteria are treated with NTBC, and the resulting sensitivity to oxidative stress with NTBC treatment.

The titration assay we developed serves two purposes. First, the assay will allow the user to determine if NTBC can abolish or reduce pyomelanin production in the bacterium being studied and at which concentrations. This will allow the user to determine sensitivity to NTBC, since different strains of bacteria may have different sensitivities to this compound, as observed in P. aeruginosa¹². Second, the NTBC titration assay will allow the user to determine the appropriate concentration of NTBC to use in subsequent assays, such as antibiotic MIC and oxidative stress response assays, if the goal is to abolish or reduce pyomelanin production and determine the effects of pigment reduction.

The titration assay works because a visible difference in pyomelanin production can be seen in strains treated with NTBC and the differences in pyomelanin production are dose dependent¹². Additionally, this technique can be applied to the study of other compounds that may eliminate or enhance pigment production in bacteria.

Antibiotic MICs are used to determine the sensitivity of bacteria to antibiotics. There are several methods to determine MICs, including agar dilution plates and broth dilutions¹⁴. Broth dilutions can be performed in small test tubes or in a 96-well microtiter plate. The microtiter plate method of MIC determination described herein will allow the user to test a wide range of antibiotics using a minimum of resources. The assay provides reproducibility as well as flexibility in the number of antibiotics and strains tested by this method. Additionally, with the incorporation of NTBC in the assay, the user can determine if elimination or reduction of pyomelanin production alters antibiotic sensitivity in bacteria that produce pyomelanin.

Bacterial response to oxidative stress can be tested in several ways. The most common methods described are either viable counts of bacteria subjected to oxidative stress for a period of time¹, or oxidative stress disc diffusion assays¹⁵. These methods tend to use high concentrations of oxidative stressors to examine the effects of oxidative stress in bacteria and results can be quite variable between biological replicates. The viable count assay also tends to use more agar plates than the other methods. The spot plate assay we describe uses low concentrations of H₂O₂ and allows the user to test the oxidative stress response of multiple strains using a minimum of plates. The assay is also consistently reproducible between technical and biological replicates. As pyomelanin is involved in resistance to oxidative stress, the incorporation of NTBC in the assay allows the user to determine the effects of elimination of pyomelanin production on oxidative stress resistance.

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Protocolo

1. Preparação de Meios de Cultura, antibióticos e 2- [2-nitro-4- (trifluorometil) benzoil] -1,3-ciclo-hexanodiona (NTBC)

1. Adicione caldo LB (1% de triptona, 0,5% de extracto de levedura, 0,25% de NaCl _em H 2 O) e alíquota em volumes apropriados. Esterilizar em autoclave. Guarde-o em temperatura ambiente.
2. Adicione 100 ml de agar LB (1% de triptona, 0,5% de extracto de levedura, 0,25% de NaCl, 1,5% de agar _em H2O) em 250 ml de frascos. Esterilizar em autoclave e armazenar à temperatura ambiente. Certifique-se de que o agar é derretido antes de verter em placas.
   NOTA: Os frascos contendo 100 ml de LB agar irá originar 4 placas. A quantidade de agar LB pode ser alterada para corresponder ao número de placas necessárias para o ensaio.
3. Adicione PBS (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, 10 mM de Na ₂ HPO _4, KH 2 mM _{2 PO 4)} ^16. Esterilizar em autoclave ou filtração e armazenamento à temperatura ambiente.
4. Preparar as soluções de antibióticos para a gentamicina, a canamicina, umad tobramicina.
   1. Prepare concentrações banco de antibióticos apropriados para P. aeruginosa estirpes contendo 100 mg / ml de gentamicina, 30 mg / ml de canamicina, e 10 mg / ml de tobramicina. Dissolver os antibióticos em água, Esterilizar por filtração (0,2 mm), e armazenar a 4 ° C. Alterar os antibióticos e concentrações, dependendo da bactéria em estudo.
5. Prepare as soluções estoque NTBC. Dissolve-se 10 mg de NTBC em 400 ul de DMSO. Isto produz uma concentração de 75,9 mM NTBC. Loja soluções estoque NTBC a -20 ° C. Soluções descongelar à temperatura ambiente, conforme necessário.
   NOTA: Diferentes fontes de NTBC têm diferenças de solubilidade. Determinar o veículo apropriado em que para dissolver o NTBC com base nas recomendações do fabricante e ajustar Passo 1.5 em conformidade.

2. NTBC Titulações de Estirpes Bacterianas

1. Defina-se culturas nocturnas das estirpes a serem testadas. Adicionar 2 ml de caldo LB a 16 x 150 mm tubo de ensaios (um por cepa) e inocular com uma colônia isolada de cada estirpe. Incubar durante a noite a 37 ° C com arejamento num agitador rotativo de cultura de tecidos em uma incubadora de ar.
2. No dia seguinte, preparar titulações de NTBC em caldo LB. Use uma primeira série 0-900 mM NTBC uma vez que diferentes cepas têm diferenças na sensibilidade à NTBC.
   1. Adicionar 1 ml de caldo LB a 4 para 5 tubos de ensaio (16 x 150 mm) por estirpe.
   2. Adicionar a solução estoque NTBC (75,9 mM), para os tubos de ensaio (16 x 150 mm) numa gama de concentrações. Ver Tabela 1 para as concentrações e volumes NTBC imagens correspondentes a adicionar a 1 mL de caldo de LB.
3. Medir a OD ₆₀₀ das culturas durante a noite. Lave as culturas antes de tomar OD ₆₀₀ leituras para eliminar pyomelanin presente na mídia.
   1. Lavam-se as culturas por centrifugação de 1 ml de cultura em uma microcentrífuga a 16000 xg durante 2 min. Remover o sobrenadante e as células peletizadas com frouxamenteuma micropipeta e ressuspender o pellet celular sólido em 1 ml de LB.
4. Inocular tubos de titulação em OD ₆₀₀ de 0,05. Calcula-se a quantidade necessária da cultura lavou-se para inocular os tubos.
   NOTA: Use as culturas lavadas para inoculações desde pyomelanin não deve estar presente.
5. Incubar os tubos de titulação durante aproximadamente 24 horas a 37 ° C com arejamento usando um tecido rotador cultura numa incubadora de ar.
6. Fotografar os tubos de titulação e comparar a produção de pigmento dentro e entre as cepas para determinar a quantidade de NTBC de usar para MIC e estresse oxidativo ensaios. Use OD ₆₀₀ leituras para determinar a quantidade de pyomelanin na célula livre sobrenadante da cultura e para determinar a densidade celular.
   Observação: A razão OD ₆₀₀ de pyomelanin no sobrenadante da cultura de células pode ser calculada para quantificar as diferenças na produção pyomelanin após o tratamento com NTBC.

3. Antibiótico Inhibi mínimoConcentração (MIC) Ensaio tory em placas de 96 poços

1. Configure culturas durante a noite das estirpes a ser testado em LB com e sem NTBC.
   NOTA: Este protocolo é descrito usando o nível representante de 300? M NTBC. O nível apropriado de NTBC a ser utilizado é determinado no passo 2.6.
   1. Adicionar 300 ^ M a 2 ml NTBC LB. Adicionar um volume equivalente de veículo (DMSO) a 2 ml de LB para a condição não NTBC.
   2. Usando palitos estéreis, inocule os tubos com uma colônia de bactérias isoladas. Haverá uma cultura com NTBC e uma cultura sem NTBC para cada estirpe. Incubar durante a noite a 37 ° C com arejamento usando um tecido rotador cultura numa incubadora de ar.
2. No dia seguinte, fazer LB + NTBC e soluções mestre LB + DMSO para a criação do ensaio MIC. Adicionar NTBC a uma concentração de 600 uM como este será diluído duas vezes quando inoculo é adicionado, dando origem a uma concentração final de 300 uM.
   1. Para testar um antibiótica para uma estirpe, adicionar 600 | iM NTBC a 2 ml de LB e misturar para tornar a solução NTBC mestre. Adicionar um volume equivalente de veículo (DMSO) a 2 ml de LB e misturar para fazer a solução não NTBC mestre. Usar estas soluções para criar soluções-mãe de antibióticos, bem como para a criação de séries de diluição em placas de 96 poços.
      NOTA: As formulações de solução mestre trará solução extra para contabilizar erros de pipetagem. As soluções mestre pode ser escalada para cima ou para baixo, conforme necessário, dependendo do número de antibióticos e estirpes testadas.
3. Preparar as soluções de antibióticos nas soluções mestre LB + NTBC ou LB + DMSO.
   NOTA: A concentração do antibiótico na Estas soluções devem ser o dobro da concentração final desejada. Deve ser feita solução suficiente para transferir 100 ul de quatro poços de uma placa de 96 poços.
   1. Prepare gentamicina +/- solução estoque NTBC a 64 ug / ml. Para tornar esta solução, adicionar 0,288 ul de estoque de gentamicina (100 mg / mL) a 450jil de LB + NTBC ou mestre solução de LB + DMSO.
      NOTA: A concentração máxima de gentamicina para P. aeruginosa PAO1 é de 32 ug / ml.
   2. Faça a canamicina +/- solução estoque NTBC a 256 ug / ml. Para tornar esta solução, adicionar 3,84 l de estoque canamicina (30 mg / ml) a 450 ul soluções mestre LB + NTBC ou LB + DMSO.
      NOTA: A concentração máxima de canamicina para P. aeruginosa PAO1 é de 128 ug / ml.
   3. Prepare tobramicina +/- solução estoque NTBC a 8 ug / ml. Para tornar esta solução, adicionar 0,36 l de estoque tobramicina (10 mg / ml) a 450 ul soluções mestre LB + NTBC ou LB + DMSO.
      NOTA: Para P. aeruginosa PAO1, a concentração máxima de tobramicina é de 4 ug / ml.
      NOTA: As concentrações de antibióticos e pode ser regulado para as bactérias a serem testadas.
4. Adiciona-se 100 ul de cada solução de antibiótico 2x para poços quatro numa placa de 96 poços. Coloque essas soluções em linha A. Para example, a gentamicina, deve ser colocado em A1 a A4, canamicina devem ser colocados em A5 a A8 e tobramicina deve ser colocado em meio A9 A12. Ver Figura 1A um diagrama de uma placa de 96 poços configurado.
   NOTA: antibióticos múltiplos pode ser testado em um prato, mas apenas uma estirpe deve ser testado por placa para eliminar o potencial de contaminação cruzada de outras estirpes.
5. Adicionar 50 ul da solução de mestre de LB + NTBC ou LB + DMSO a linha B a H da placa de 96 poços. Certifique-se que uma placa é LB + NTBC e um prato é LB + DMSO. Veja a Figura 1A.
   1. Use de LB + NTBC para os antibióticos em LB + NTBC. Use de LB + DMSO para os antibióticos em LB + DMSO.
6. Usando uma micropipeta realizar diluições em série duas vezes dos antibióticos através da transferência de 50 mL da solução de linha A para a linha B. Misturar a solução, mudar as pontas de pipetas, e transferir 50 ul da solução a partir da linha B para a linha C para Repetir o remainilinhas GN. Depois de se diluir linha L, remover 50 ul da solução a partir dessa linha e descarte. Utilize linha H como um antibiótico sem controle para o crescimento bacteriano. Ver Figura 1B.
   NOTA: Cada poço nas filas A a G contém agora 50 uL de antibiótico em LB + NTBC ou LB + DMSO a 2X a concentração final desejada. Fila H contém LB + NTBC ou LB + DMSO sem antibióticos.
7. Medir a OD ₆₀₀ das culturas durante a noite. Lave todas as culturas antes de tomar OD ₆₀₀ leituras para eliminar pyomelanin presente na mídia.
   1. Lavam-se as culturas por centrifugação de 1 ml de cultura em uma microcentrífuga a 16000 xg durante 2 min. Remover o sobrenadante com uma micropipeta e ressuspender o pellet celular em 1 ml de LB.
8. Dilui-se as culturas durante a noite para 2.75x10 ^{5 ufc} / mL em LB.
   NOTA: Assume-se que uma unidade _DO600 é o equivalente de 1x10 ⁹ CFU / ml para P. aeruginosa. OD para as conversões de UFC / mL podem ser different em outras bactérias.
9. Adicionar 50 ul da cultura bacteriana diluído ao poço adequado.
   NOTA: As culturas são crescidas em NTBC deve ser adicionada aos poços contendo NTBC e culturas cultivadas em DMSO deve ser adicionado às cavidades contendo DMSO. Ver Figura 1B.
   1. Adicionar bactérias a três poços para cada estirpe e concentração do antibiótico. Adicionar 50 ul de LB para o quarto poço para actuar como um controlo para a contaminação bacteriana. Ver Figura 1B.
   2. Usar uma pipeta de multi-canal para inocular os poços. Assegurar que pipeta pontas estão perto do fundo dos poços, quando a adição de inoculo para evitar a contaminação de poços vizinhos.
      NOTA: A adição de cultura bacteriana aos poços irá diluir as concentrações de antibiótico e NTBC duas vezes.
10. Cobrir as placas de 96 poços com parafilme e incubar a cerca de 24 horas a 37 ° C. Incubar as placas de 96 poços estaticamente, numa incubadora de ar.
11. Examinaras placas para o crescimento bacteriano nas cavidades. A MIC é a concentração mais baixa de antibiótico em que nenhum crescimento bacteriano é visto para todas as três repetições de cada estirpe.
    1. Examine visualmente a placa de crescimento ou ler usando um conjunto leitor de placas de _DO600.

4. Ponto Ensaio Placa de resposta ao estresse oxidativo

1. Defina-se culturas nocturnas das estirpes a ser testado em meio LB com ou sem NTBC tal como descrito na etapa 3.1.
2. No dia seguinte, para preparar as placas de agar LB contendo H _{2 O 2} como um estressor oxidativo. Uma gama de H _{2 O} 2 concentrações de 0 a 1 mM é um bom ponto de partida.
   1. Derreter os frascos de LB-agar. Super meios para aproximadamente 50 ° C à temperatura ambiente.
   2. Adicionar H _{2 O 2} directamente sobre o suporte arrefecidos nas concentrações desejadas. Frascos agite para misturar. Ver Tabela 2 para as concentrações de H _{2 O 2}e volumes de concentrado H _{2 O 2} a acrescentar. Estes valores baseiam-se em 100 ml de LB com agar.
   3. Verter em placas imediatamente após a adição de H _{2 O 2 e} a superfície da chama para remover as bolhas. O rendimento é de 4 placas por 100 ml de LB com agar. Marcar as placas com a concentração de H _{2 O 2.}
   4. Colocar as placas descoberto numa câmara de fluxo biológico com o ventilador corrida durante 30 min para remover o excesso de humidade das placas.
      NOTA: Use as placas no mesmo dia em que são preparados. Não fazer isso pode resultar em dados inconsistentes.
      NOTA: factores de stress oxidativo, tais como o paraquat pode ser substituído por H _{2 O 2} neste ensaio. As concentrações utilizadas para outros factores de stress oxidativo pode ser diferente do que os usados ​​para a H _{2 O 2.}
3. Lavar e medir a DO ₆₀₀ das culturas durante a noite, tal como descrito na etapa 3.7.
4. Normalizar o OD ₆₀₀ de todo o cu durante a noiteltures para o menor valor para o conjunto de estirpes que está sendo testado. P. aeruginosa tem geralmente uma _DO600 de aproximadamente 2,5, quando crescidas durante a noite em LB ou LB + NTBC + DMSO.
   1. Determinar o volume de cultura necessárias para diluir a cultura para o menor OD ₆₀₀ num volume total de 1 ml. Por exemplo, se uma cultura tem um OD ₆₀₀ de 3 e menor do OD _{600 para} o conjunto de estirpes é de 2,5, executar o seguinte cálculo: (2,5) (1 ml) = (3) (X). x = 0.833 ml. 0,833 ml de cultura vai ser colocado num tubo de microcentrífuga.
   2. Calcular a quantidade de LB + NTBC (300 uM) ou DMSO de LB + necessária para trazer o volume de cultura para 1 ml. Para o exemplo no passo 4.4.1, a quantidade de LB + NTBC ou LB + DMSO adicionado à cultura seria 0.167 ml (1 ml de volume total de 0,833 ml - de cultura). Adicione as soluções concentradas de LB + NTBC e LB + DMSO para utilizar para estes diluições com base no volume necessário para diluir todas as estirpes.
   3. Misture a cultura e LB + NTBC ou LB + DMSO em vórtice.
5. Para manter as culturas numa concentração constante de NTBC ou DMSO, realizar diluições em série de dez vezes das culturas durante a noite em PBS + normalizados NTBC ou PBS + DMSO.
   1. Faça as soluções concentradas de PBS + NTBC e PBS + DMSO. Para um conjunto de diluições de uma estirpe, misturar 300 NTBC uM ou um volume equivalente de DMSO com PBS para se obter um volume total de 720 ul. Escalar esses stocks cima ou para baixo, dependendo de quantas cepas são testadas.
   2. Etiqueta para tubos de microcentrífuga através de diluições 10 ^-1 10 ^-7 série. Adicionar 90 ul de PBS + NTBC ou PBS + DMSO para os tubos apropriados. Use PBS + NTBC para as estirpes cultivadas em LB + NTBC e usar PBS + DMSO para as estirpes cultivadas em LB + DMSO.
   3. Adicionar 10 ul de cultura para o tubo 10 ^-1 de diluição apropriado. Misturar em vortex e transferir 10 ul da diluição 10 ^-1 para o tubo de diluição 10 ^-2. Repetir até que todas as diluições foram Performou. Alterar pontas de pipeta entre diluições.
6. Spot 5 ul de 10 ^-3 a 10 ^-7 através diluições em placas de LB + H _{2 O 2} placas em duplicado para cada estirpe. Use uma ponta de pipeta se manchas são banhados de mais diluída para menos diluído (10 ^{-7 a} 10 ^-3). Não ponta ou incline a placa até que o líquido tenha secado na placa.
7. Incubar as placas durante 24-48 horas a 37 ° C (incubadora de ar), dependendo da estirpe.
   NOTA: P. aeruginosa PAO1 terá bons colônias porte sobre LB após 24 horas de incubação. Incubar estirpes até que colónias têm aproximadamente o mesmo tamanho que PAO1.
8. Fotografar as placas usando uma câmera CCD acima de um transluminador. Opcionalmente, editar as fotos para o contraste e cultura para o mesmo tamanho. Contar o número de colónias em cada local para determinar alterações na sensibilidade ao estresse oxidativo.

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Resultados

Titulações NTBC

As titulações NTBC foram utilizados para determinar se NTBC foi capaz de reduzir a produção em P. pyomelanin aeruginosa, e também identificar a concentração de NTBC que elimina ou reduz a produção pyomelanin para utilização em ensaios adicionais. Pode haver variações nos níveis de pyomelanin produzida em diferentes repetições, mas as tendências gerais permanecer constante. O ensaio de titulação NTBC também poderia ser modificado para te...

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Discussão

The NTBC titration method described in this protocol will allow the user to determine if NTBC can reduce or eliminate pyomelanin production in bacteria, and determine the concentration of NTBC required. The most critical step in the NTBC titration assay is determining the range of NTBC concentrations to use in the assay. Different strains of P. aeruginosa have different sensitivities to NTBC, and laboratory strains may be more sensitive to NTBC than clinical isolates¹² (Figure 2). The...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC)	Sigma-Aldrich	SML0269-50mg	Also called nitisinone.  Soluble in DMSO.
H2O2	Sigma-Aldrich	216763-100ML	30 wt. % in H2O.  Stabilized.
Gentamicin	Gold Bio	G-400-100	Soluble in H2O.  Filter sterilize.
Kanamycin	Fisher Scientific	BP906-5	Soluble in H2O.  Filter sterilize.
Tobramycin	Sigma-Aldrich	T4014-100MG	Soluble in H2O.  Filter sterilize.