細菌Pyomelanin産生を阻害し、酸化ストレスに対する感受性の増加に対応を決定するための方法

要約

Bacterial pyomelanin production results in increased resistance to oxidative stress and virulence. We report on techniques that can be used to determine inhibition of pyomelanin production and assay the resulting increase in sensitivity to oxidative stress in bacteria, as well as determine antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC).

要約

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism pathway and contributes to increased oxidative stress resistance. Pyomelanin production in Pseudomonas aeruginosa is reduced in a dose dependent manner through treatment with 2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC). We describe a titration method using multiple concentrations of NTBC to determine the concentration of drug that will reduce or abolish pyomelanin production in bacteria. The titration method has an easily quantifiable outcome, a visible reduction in pigment production with increasing drug concentrations. We also describe a microtiter plate method to assay antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC) in bacteria. This method uses a minimum of resources and can easily be scaled up to test multiple antibiotics in one microtiter plate for one strain of bacteria. The MIC assay can be adapted to test the affects of non-antibiotic compounds on bacterial growth at specific concentrations. Finally, we describe a method for testing bacterial sensitivity to oxidative stress by incorporating H₂O₂ into agar plates and spotting multiple dilutions of bacteria onto the plates. Sensitivity to oxidative stress is indicated by reductions in colony number and size for the different dilutions on plates containing H₂O₂ compared to a no H₂O₂ control. The oxidative stress spot plate assay uses a minimum of resources and low concentrations of H₂O₂. Importantly, it also has good reproducibility. This spot plate assay could be adapted to test bacterial sensitivity to various compounds by incorporating the compounds in agar plates and characterizing the resulting bacterial growth.

概要

Pseudomonas aeruginosa is a Gram negative bacterium that produces a variety of pigments including pyomelanin, a red-brown pigment that helps provide protection from oxidative stress^1-4 and binds a variety of compounds, including aminoglycoside antibiotics^5-7. Pyomelanin production is caused by a defect in the tyrosine catabolism pathway^4,8, either through deletions or mutations of the gene encoding homogentisate 1,2-dioxygenase (HmgA)^1,9 or through imbalances in the various enzymes in the pathway¹⁰. Homogentisate accumulates due to inactivation of HmgA, and is secreted and oxidized to form pyomelanin¹¹. Production of pyomelanin can be abolished or reduced in a dose dependent manner through treatment with the herbicide 2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC)¹², which inhibits 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (Hpd) in the tyrosine catabolism pathway¹³. Hpd is required for the formation of homogentisate, and therefore pyomelanin¹¹.

We describe in detail three techniques that were important in our studies of NTBC treatment of pyomelanin producing strains of P. aeruginosa. These techniques include titration of NTBC to determine the concentrations that will abolish or reduce pyomelanin production in laboratory and clinical pyomelanin producing strains, determination of the minimum inhibitory concentration (MIC) of antibiotics when bacteria are treated with NTBC, and the resulting sensitivity to oxidative stress with NTBC treatment.

The titration assay we developed serves two purposes. First, the assay will allow the user to determine if NTBC can abolish or reduce pyomelanin production in the bacterium being studied and at which concentrations. This will allow the user to determine sensitivity to NTBC, since different strains of bacteria may have different sensitivities to this compound, as observed in P. aeruginosa¹². Second, the NTBC titration assay will allow the user to determine the appropriate concentration of NTBC to use in subsequent assays, such as antibiotic MIC and oxidative stress response assays, if the goal is to abolish or reduce pyomelanin production and determine the effects of pigment reduction.

The titration assay works because a visible difference in pyomelanin production can be seen in strains treated with NTBC and the differences in pyomelanin production are dose dependent¹². Additionally, this technique can be applied to the study of other compounds that may eliminate or enhance pigment production in bacteria.

Antibiotic MICs are used to determine the sensitivity of bacteria to antibiotics. There are several methods to determine MICs, including agar dilution plates and broth dilutions¹⁴. Broth dilutions can be performed in small test tubes or in a 96-well microtiter plate. The microtiter plate method of MIC determination described herein will allow the user to test a wide range of antibiotics using a minimum of resources. The assay provides reproducibility as well as flexibility in the number of antibiotics and strains tested by this method. Additionally, with the incorporation of NTBC in the assay, the user can determine if elimination or reduction of pyomelanin production alters antibiotic sensitivity in bacteria that produce pyomelanin.

Bacterial response to oxidative stress can be tested in several ways. The most common methods described are either viable counts of bacteria subjected to oxidative stress for a period of time¹, or oxidative stress disc diffusion assays¹⁵. These methods tend to use high concentrations of oxidative stressors to examine the effects of oxidative stress in bacteria and results can be quite variable between biological replicates. The viable count assay also tends to use more agar plates than the other methods. The spot plate assay we describe uses low concentrations of H₂O₂ and allows the user to test the oxidative stress response of multiple strains using a minimum of plates. The assay is also consistently reproducible between technical and biological replicates. As pyomelanin is involved in resistance to oxidative stress, the incorporation of NTBC in the assay allows the user to determine the effects of elimination of pyomelanin production on oxidative stress resistance.

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プロトコル

培養培地、抗生物質の調製、及び2- [2-ニトロ-4-（トリフルオロメチル）ベンゾイル] -1,3-シクロヘキサンジオン（NTBC）

1. 適切なボリュームにLBブロス（1％トリプトン、0.5％酵母エキス、H _{2 O中} 0.25％のNaCl）、アリコートを行います。オートクレーブにより滅菌します。室温で保管してください。
2. 250 mlのフラスコに100 mlのLB寒天培地（1％トリプトン、0.5％酵母エキス、0.25％のNaCl、H _{2 O}中の1.5％寒天）を作ります。室温でオートクレーブとストアによって滅菌します。寒天プレートに注ぐ前に溶けていることを確認します。
   注：LB寒天100mlを含有するフラスコを4板が得られます。 LB寒天培地の量は、アッセイに必要なプレートの数に対応するように変更することができます。
3. PBS（137mMの塩化ナトリウム、2.7のKCl、10mMの_の Na 2 HPO _4、2mMのKH ₂ PO ^_4）16ください。室温でオートクレーブまたは濾過し、ストアによって滅菌します。
4. ゲンタマイシンのための抗生物質のストック溶液を準備し、カナマイシン、Dトブラマイシン。
   1. Pの適切な抗生物質ストック濃度を準備100 mg / mlのゲンタマイシン、30 mg / mlのカナマイシン、および10mg / mlのトブラマイシンを含む緑膿菌菌株 。 4℃の水、フィルター滅菌し（0.2ミクロン）、および店舗での抗生物質を溶解します。研究細菌に応じて抗生物質および濃度を変更します。
5. NTBCストック溶液を準備します。 DMSOの400μlのNTBC 10mgを溶解します。これは、75.9 mMのNTBCの濃度が得られます。 -20℃で保存NTBC原液。必要に応じて室温でソリューションを解凍します。
   注：NTBCの異なるソースは、溶解度の差があります。メーカーの推奨に基づいて、NTBCを溶解し、それに応じてステップ1.5を調整するためにする適切な車両を決定します。

細菌株の2 NTBC滴定

1. テストされる株の一晩培養を設定します。 16×150 mmの試験管に2 mlのLBブロスを加えますS（1株あたり1）と、各株から1に単離したコロニーを接種します。空気インキュベーター中で組織培養回転子に通気しながら37℃で一晩インキュベートします。
2. 次の日は、LBブロス中でNTBCの滴定を準備します。異なる株がNTBCに対する感受性の違いを持っ​​ているので、0から900μMNTBCの初期範囲を使用してください。
   1. 1株あたり4〜5本の試験管（16×150ミリメートル）に1ミリリットルのLBブロスを追加します。
   2. 濃度の範囲内で試験管（16×150ミリメートル）にNTBC原液（75.9 mm）を追加します。 LBブロスの1mlに追加するには、NTBCの濃度とそれに対応する株式ボリュームについては、表1を参照してください。
3. 一晩培養物のOD _{600を測定します。}培地中に存在pyomelanin排除するためにOD ₆₀₀読み取りを行う前に、文化を洗ってください。
   1. 2分間16,000×gで微量に1mlの培養物を遠心分離することによって培養液を洗います。上清を除去し、持つ任意の緩くペレット化した細胞ピペットとは、1ミリリットルのLB固体細胞ペレットを再懸濁
4. OD ₆₀₀ 0.05で滴定チューブを接種します。チューブに接種するために必要な洗浄文化の量を計算します。
   注：pyomelaninが存在してはならないので、予防接種のための洗浄の文化を使用してください。
5. 空気インキュベーター中で組織培養回転子を用いて通気しながら37℃で約24時間滴定チューブをインキュベートします。
6. 滴定チューブを撮影し、MICおよび酸化ストレスアッセイのために使用するNTBCの量を決定するために、内および系統間で色素産生を比較します。無細胞培養上清中pyomelaninの量を決定し、細胞密度を決定するために、OD ₆₀₀測定値を使用します。
   注：細胞の培養上清中のpyomelaninのOD ₆₀₀比は、NTBCで処理した後pyomelanin生産の違いを定量化するために計算することができます。

3.抗生物質の最小Inhibi96ウェルプレートでトリー濃度（MIC）アッセイ

1. し、NTBCないLBにテストされる株の一晩培養を設定します。
   注：このプロトコルは、300μMのNTBCの代表レベルを用いて説明します。使用されるNTBCの適切なレベルは、ステップ2.6で決定されます。
   1. 2ミリリットルのLBに300μMのNTBCを追加無NTBC条件の2ミリリットルのLBにビヒクル（DMSO）の同等のボリュームを追加します。
   2. 滅菌爪楊枝を使用して、細菌のつの単離されたコロニーをチューブに接種。 NTBCと1つの培養し、各株についてNTBCせずに1つの培養があります。空気インキュベーター中で組織培養回転子を用いて通気しながら37℃で一晩インキュベートします。
2. 次の日、MICアッセイを設定するためのLB + NTBCし、LB + DMSOマスターソリューションを作ります。接種物は、300μMの最終濃度を得、追加されたときに、これは2倍に希釈されるように、600μMの濃度でNTBCを追加します。
   1. 1 antibiをテストするには1株について、耳、2ミリリットルのLBに600μMのNTBCを追加し、NTBCマスター溶液を作製するために混ぜます。 2ミリリットルのLBにビヒクル（DMSO）の等量を追加し、何のNTBCマスター溶液を作成しないように混ぜます。抗生物質の原液を作成するだけでなく、96ウェルプレート中の希釈系列を設定するため、これらのソリューションを使用してください。
      注：マスター溶液製剤は、ピペッティングの誤差を考慮して余分な溶液が得られます。試験した抗生物質および株の数に応じて必要に応じてマスターソリューションは拡大または縮小することができます。
3. LB + NTBCまたはLB + DMSOマスターソリューションの抗生物質溶液を調製します。
   注：これらの溶液中の抗生物質濃度は、二重の最終的な所望の濃度にする必要があります。十分な溶液を、96ウェルプレートの4ウェルに100μlのを転送するようになされるべきです。
   1. 64μgの/ mlのゲンタマイシン+/- NTBC原液を準備します。この溶液を作製するために、450にゲンタマイシン株式（100 mg / mlの）の0.288μlを添加しますμlのLB + NTBCまたはLB + DMSOマスターソリューション。
      注：Pのゲンタマイシンの最大濃度緑膿菌 PAO1は、32μgの/ mlです。
   2. カナマイシン+/- 256 / mlのでNTBC原液を作ります。この溶液を作製するために、450μlのLB + NTBCまたはLB + DMSOマスターソリューションにカナマイシンストック（30 mg / mlの）の3.84μlを添加します。
      注：Pのカナマイシンの最大濃度緑膿菌 PAO1は、128μgの/ mlです。
   3. トブラマイシン+/- 8 / mlのでNTBC原液を準備します。この溶液を作製するために、450μlのLB + NTBCまたはLB + DMSOマスターソリューションにトブラマイシンストック（10mg / ml）の0.36μlを添加します。
      注：Pの緑膿菌 PAO1、トブラマイシンの最大濃度は、4 / mlのです。
      注：細菌を試験するために、抗生物質との濃度を調整することができます。
4. 96ウェルプレートの4つのウェルにそれぞれ2倍の抗生物質溶液100μlを追加します。 examplの行Aにこれらのソリューションを配置しますeは、ゲンタマイシンがA4を通じてA1に配置する必要があり、カナマイシンはA8を通じてA5に配置する必要があり、およびトブラマイシンはA12を通じてA9に配置する必要があります。セットアップ、96ウェルプレートの図については、図1Aを参照してください。
   注：複数の抗生物質は、一枚のプレートで試験することができるが、唯一の1株は他の株からの交差汚染の可能性を排除するために、プレートごとにテストする必要があります。
5. 96ウェルプレートのHを通じて行BにLB + NTBCまたはLB + DMSOマスター溶液50μlを追加します。一方のプレートは、LB + NTBCであることを確認し、一方のプレートは、LB + DMSOです。 図1Aを参照してください。
   1. LB + NTBCにおける抗生物質のためのLB + NTBCを使用してください。 LB + DMSO中の抗生物質のためのLB + DMSOを使用してください。
6. マイクロピペットを使用すると、ピペットチップを変更、Bのミックスにソリューションを行ごとにAから溶液50μlを転送することにより、抗生物質の2倍連続希釈を行い、のためのC.繰り返しを行ごとにBから溶液50μlを転送remainingの行。行Gを希釈した後、その行から溶液50μlを除去し、廃棄します。細菌の増殖のための抗生物質のないコントロールとしてH列を使用してください。 図1Bを参照してください 。
   注：Gを通じて行Aの各ウェルは現在の2倍でLB + NTBCまたはLB + DMSO中の抗生物質、50μlの最終的な所望の濃度が含まれています。 H列は、抗生物質なしでLB + NTBCまたはLB + DMSOが含まれています。
7. 一晩培養物のOD _{600を測定します。}培地中に存在pyomelaninを排除するためにOD ₆₀₀読み取りを行う前に、すべての文化を洗ってください。
   1. 2分間16,000×gで微量に1mlの培養物を遠心分離することによって培養液を洗います。ピペットで上清を除去し、1mlのLBに細胞ペレットを再懸濁
8. LBの中で2.75x10 ⁵ CFU / mlに一晩培養を希釈
   注：1 OD ₆₀₀ユニットは、Pの 1×10 ⁹ CFU / mlと同等であると仮定緑膿菌 。 CFU / mlの変換へのODは、Dすることができます他の細菌でifferent。
9. 適切なウェルに希釈した細菌培養物の50μlのを追加します。
   注：NTBCで増殖させた培養物は、DMSO中で増殖させ、培養物NTBCを含むウェルに添加されるべきではDMSOを含有するウェルに添加されるべきです。 図1Bを参照してください 。
   1. 各菌株と抗生物質濃度のための3つのウェルに細菌を追加します。細菌汚染のための対照として機能する第四ウェルにLB50μlのを追加します。 図1Bを参照してください 。
   2. 井戸を接種するために、マルチチャンネルピペットを使用してください。近隣の井戸の汚染を防止するために、接種材料を追加する際にピペットチップは、ウェルの底近くにあることを確認してください。
      注：ウェルに細菌培養を追加すると、抗生物質とNTBC濃度2倍に希釈します。
10. パラフィルムを有する96ウェルプレートを覆い、37℃で約24時間インキュベートします。空気インキュベーター中、静的96ウェルプレートをインキュベートします。
11. 調べウェル中の細菌増殖のためのプレート。 MICには、細菌の増殖を、各株のすべての3つの複製のために見ていないされている抗生物質の最低濃度です。
    1. 視覚的な成長のためにプレートを調べたり、OD ₆₀₀に設定し、プレートリーダーを用いて読み取ります。

酸化ストレス応答4.スポットプレートアッセイ

1. ステップ3.1で説明したようにNTBCとないLB中でテストされる株の一晩培養を設定します。
2. 翌日、酸化的ストレッサーとしてH _{2 O 2を含有する} LB寒天プレートを調製します。 0〜1 mMのからのH ₂ O ₂濃度の範囲は、良い出発点です。
   1. LB寒天フラスコを溶かします。室温で約50℃に冷却するメディア。
   2. 所望の濃度の冷却媒体に直接_H 2 O 2 _{を追加します} 。スワールフラスコを混合します。 H ₂ O ₂の濃度は 、表2を参照そして濃縮し、H ₂ O ₂のボリュームが追加されます。これらの値は、LB寒天100mlのに基づいています。
   3. すぐにH ₂ O _{2を添加した後} 、プレートを注ぎ、気泡を除去するために表面を火炎。収率はLB寒天の100ミリリットル当たり4板です。マーク・H _{2 O 2濃度}でプレート。
   4. プレートから余分な水分を除去するために、30分間実行しているファンとの生物学的な流フードで明らかになったプレートを置きます。
      注：プレート、それらが用意されている同じ日に使用します。そうしないと、一貫性のないデータになることがあります。
      注：例えば、パラコートなどの酸化ストレスは、このアッセイにおける_H 2 O ₂の代わりに用いることができます。他の酸化ストレスのために使用される濃度は、H _{2 O 2}のために使用されるものと異なってもよいです。
3. 洗浄ステップ3.7で説明したように一晩培養のOD _{600を測定します} 。
4. すべて一晩のcuのOD _{600を正規化}テストされている株のセットの最低値にltures。P.緑膿菌は、一般的に 、LB + NTBCまたはLB + DMSO中で一晩増殖させ、約2.5のOD _{600を持っています。}
   1. 1ミリリットルの全容量で最低のOD ₆₀₀に文化を希釈するために必要な培養物の容量を決定します。例えば、培養物がOD 3の_{600を有しており、}株のセットのための最小のOD _600が 2.5であり、次の計算実行する場合：（2.5）（1ミリリットル）=（3）（X）。 X = 0.833ミリリットル。文化の0.833ミリリットルをマイクロチューブ内に配置されます。
   2. 1mlに培養容量をもたらすために必要なLB + NTBC（300μM）またはLB + DMSOの量を計算します。ステップ4.4.1の例では、LB + NTBCまたはLB + DMSOの量は0.167ミリリットル（ - 0.833ミリリットル文化1ミリリットル総容量）になる培養液に添加。 LB + NTBCし、LB + DMSOのストック溶液は、すべての株を希釈するために必要な量に基づいて、これらの希釈液に使用するようにしてください。
   3. 文化とLB + Nを混ぜますボルテックスによってTBCまたはLB + DMSO。
5. NTBCまたはDMSOの一定濃度で培養を維持するために、PBS + NTBCまたはPBS + DMSO中の正規化された一晩培養の10倍連続希釈を行います。
   1. PBS + NTBCし、PBS + DMSOのストック溶液を作ります。 1株についての希釈液の1セットでは、720μLの総容量を得るために、PBSで300μMのNTBCまたはDMSOの等量を混ぜます。テストされてどのように多くの株に応じて上下にこれらの株式をスケール。
   2. 10 ^-7の連続希釈^10〜-1のラベルマイクロチューブ。適切なチューブにPBS + NTBCまたはPBS + DMSO90μlのを追加します。 LB + NTBCで成長した株について、PBS + NTBCを使用し、LB + DMSO中で成長した株をPBS + DMSOを使用しています。
   3. 適切な10 ^-1希釈チューブに文化の10μlのを追加します。ボルテックスで混合し、10 ^-2希釈チューブに10 ^-1希釈液10μlを移します。すべての希釈はperfoされるまで繰り返しますrmed。希釈液の間にピペットチップを変更します。
6. 各株の重複でLB + H _{2 O 2}のプレートに10 ^-7希釈液を^10〜-3のスポット5μlの。スポットがメッキされている場合は、ほとんどが少なくとも希（10 ^{-7〜10 -3）}に希釈から1ピペットチップを使用してください。液体がプレートに乾燥するまでプレートを傾けたり、傾けたりしないでください。
7. 歪みに応じて、37℃（空気インキュベーター）で24〜48時間、プレートをインキュベートします。
   注：P。緑膿菌 PAO1は、インキュベーションの24時間後に、LBの良いサイズのコロニーを持つことになります。それらがコロニーをPAO1とほぼ同じ大きさになるまで株を培養します。
8. transluminator上にCCDカメラを用いてプレートを撮影。必要に応じて、同じサイズとは対照的と作物のために写真を編集します。酸化ストレスに対する感受性の変化を決定するために各スポットにコロニー数をカウントします。

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結果

NTBC滴定

NTBCはP.でpyomelanin産生を減少させることができた場合にNTBC滴定を決定するために使用されました緑膿菌 、また、追加のアッセイにおける使用のためのpyomelanin生産性を排除または低減されるNTBCの濃度を特定します。そこ異なる複製で生産pyo​​melaninのレベルの変化であるが、一般的な傾向は一定のままであってもよいです。 NTBC滴定アッセイはまた?...

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ディスカッション

The NTBC titration method described in this protocol will allow the user to determine if NTBC can reduce or eliminate pyomelanin production in bacteria, and determine the concentration of NTBC required. The most critical step in the NTBC titration assay is determining the range of NTBC concentrations to use in the assay. Different strains of P. aeruginosa have different sensitivities to NTBC, and laboratory strains may be more sensitive to NTBC than clinical isolates¹² (Figure 2). The...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC)	Sigma-Aldrich	SML0269-50mg	Also called nitisinone.  Soluble in DMSO.
H2O2	Sigma-Aldrich	216763-100ML	30 wt. % in H2O.  Stabilized.
Gentamicin	Gold Bio	G-400-100	Soluble in H2O.  Filter sterilize.
Kanamycin	Fisher Scientific	BP906-5	Soluble in H2O.  Filter sterilize.
Tobramycin	Sigma-Aldrich	T4014-100MG	Soluble in H2O.  Filter sterilize.