Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) and molecular techniques (16S rRNA gene sequencing) permit the identification of rare bacterial pathogens in routine diagnostics. The goal of this protocol lies in the combination of both techniques which leads to more accurate and reliable data.

Abstract

ישנם מספר ונדיר, ולכן, מספיק תיאר חיידקים פתוגנים אשר דיווחו לגרום זיהומים קשים במיוחד בחולים מדוכאי חיסון. ברוב המקרים רק כמה נתונים, בעיקר כפי שפורסם דיווחי מקרים, זמינים אשר לחקור את תפקיד פתוגנים כגון סוכן זיהומיות. לכן, על מנת להבהיר את אופי פתוגניים של מיקרואורגניזמים כאלה, יש צורך לערוך מחקרים אפידמיולוגיים הכוללים מספר רב של חיידקים אלה. השיטות ששימשו במחקר מעקב כזה צריך לעמוד בקריטריונים הבאים: זיהוי של זנים יש לדייק על פי המינוח תקף, הם צריכים להיות קל לטפל (חוסנו), חסכוני אבחון שגרתי והם צריכים ליצור השוואה תוצאות בין מעבדות שונות. באופן כללי, ישנם שלוש אסטרטגיות לזיהוי זני חיידקים בסביבה שיגרתית: 1) זיהוי פנוטיפי המאפיין את biochemical ומטבוליות המאפיינים של חיידקים, 2) בטכניקות מולקולריות כגון רצף הגן 16S rRNA ו -3) ספקטרומטריית מסה כגישה מבוססת proteome הרומן. מאז ספקטרומטריית מסה גישות מולקולריות הם הכלים המבטיחים ביותר לזיהוי מגוון גדול של מינים של חיידקים, שתי השיטות המתוארות. מקדמות, מגבלות ובעיות פוטנציאליות בעת שימוש בטכניקות אלה נדונים.

Introduction

זיהוי מאובטח של פתוגנים נדירים אבחון שיגרתי הקשה על ידי העובדה כי שיטות תרבותיות ביוכימיים קלסית הם מסורבלות לפעמים בספק. יתר על כן, מעבדה למיקרוביולוגיה אבחון יש לעבד מספר רב של פתוגנים, הנעים בין כמה מאות לכמה אלפי, יומי, אשר מחייב שימוש במערכות אוטומטיות. בנוסף לניהול של תפוקה יומית גבוהה, זיהוי המדויק של מינים של חיידקים הוא זקוק. זה הוא מוצדק שכן הם נבדלים דפוס הרגישות מיקרוביאלית שלהם ולכן זיהוי נכון מספק למטפל עם מידע חיוני לבחור אנטיביוטיקה מתאימה (למשל, אנטרוקוקוס spp., Acinetobacter spp.) 12,43.

מערכות זיהוי חיידקים אוטומטיים (Amis) להחיל ערכות סטנדרטיות של תגובות אנזימטיות לאפיין את התכונות מטבוליות של בידודים חיידקי 13,15,16,26,27. למרות המחסניות בשימוש במערכות האלה לנצל מספר רב של תגובות ביוכימיות שונות, למשל, 47 בכרטיס GN של איימיס השתמש במחקר זה 52, זיהוי מאובטח היתרי אסטרטגיה זו רק עבור מספר מוגבל של חיידקים. יתר על כן, מאגר המידע, מערכת מומחה מתקדמת, מתמקד בבירור על זיהוי של חיידקים רלוונטיים מאוד רלוונטיים של חשיבות רפואית 13,15,16,36. שתי מערכות נוספות, בשימוש נרחב במעבדות, גם ליישם גישה ביוכימית זו לזיהוי חיידקים. מחקרים שנעשו לאחרונה מדגימים דיוק זיהוי להשוות בין איימיס השתמשו במחקר זה ואחד המתחרים (93.7% ו 93.0% בהתאמה), בעוד ש -3 rd איימיס יש דיוק הזיהוי של 82.4% בלבד על מינים לרמה 35. פערים אלה עשויים להיות מוסברים על ידי איכות אזכור נתוני זיהוי הבסיסי, הגירסות של ערכות ותוכנה, הבדלי METABOlism ומיומנות של כוח אדם טכני 35,36.

שתי מערכות MALDI-TOF MS אוטומטית (MALDI-TOF חיידקי מערכת זיהוי, mMIS) משמשות בעיקר. מערכות אלו מאפשרות זיהוי של מספר רב של מינים של חיידקים מבוססים על ספקטרה המונית טביעת אצבע החלבון שלהם. לדוגמה, מסד הנתונים של mMIS המשמש מכיל 6,000 ספקטרה התייחסות. מערכות זיהוי המבוססות על ספקטרומטריית מסה להציע זיהוי מהיר ואמין של מגוון גדול של מיקרואורגניזמים כולל 11,48,51 פתוגנים נדירים. עד כה רק כמה השוואות ישירות זמינות בין mMIS השתמש במחקר זה והמתחרה שלה 19,33. לדברי Daek et al. שתי המערכות לספק שיעור גבוה דומה של דיוק זיהוי, אבל mMIS השתמשו במחקר זה נראה אמין יותר להציג תעודה מזהה עם מינים 19.

באופן דומה, בטכניקות מולקולריות פונות נשמרות היטב, אלא גם גנים נפרדים ( למשל, 16S rDNA או rpoB) להתיר זיהוי מינים ברור 3,22,61. בין אלה, rDNA 16S הוא גן המשק הנפוץ ביותר בגלל נוכחותה כל החיידקים 34. תפקידה נשאר ללא שינוי ולבסוף, עם בערך 1,500 נ"ב, זה מספיק זמן כדי להיות מתאים-אינפורמטיקה ביו 14,34. חוקרים רבים רואים בניתוח גנטי 16S rRNA בתור "תקן הזהב" לזיהוי חיידקים 21. זאת בשל העובדה כי כמה מעבדות להשתמש בטכניקות כלת DNA-DNA עד כה לזיהוי החיידקים נדירים או חדשים 14,34. בנוסף, יותר ויותר מסדי נתונים זמינים אשר ניתן להשתמש בהם לצורך ניתוח גנטי 16S rRNA 50. עם זאת, יש לקחת בחשבון כי 16S rDNA מבוסס מערכות גילוי יש רגישות מוגבלת לעומת פרוטוקולי PCR סטנדרטיים. יתר על כן, הגישה המולקולרית היא מתוחכמת, זמן רב ודורשת צוות מקצועי מהשורה הראשונה, כמו גםמתקני מעבדה ייעודיים, אם כן, לא מיושמים בקלות לתוך אבחון שגרתי 55. יתר על כן, הוכיח כי השילוב של לפחות שתי שיטות שונות של זיהוי חיידקי מוביל זיהוי זן מאוד מדויק. השילוב של MALDI-TOF MS ו 16S rDNA רצף מאפשר זיהוי של מספרים גדולים של מיני חיידקים שונים ברמת דיוק גבוהה. לאחרונה השילוב של MALDI-TOF MS ו 16S rRNA בניתוח גנטי הוצג לזיהוי חיידקים לומדים שאלות אפידמיולוגיים ופתוגנים נדירים 56.

Protocol

1. הפקת DNA בקטריאלי

  1. הכנת פתרון PBS
    1. לשקול 1.65 g Na 2 HPO 4 x 2H 2 O, 0.22 גרם לאא 2 PO 4 x 2H 2 O ו 8.80 גרם NaCl בבקבוק וממלאים במים מזוקקים לנפח סופי של 1,000 מ"ל. התאם את ה- pH ל -7.4. לשימוש סופי לסנן את הפתרון באמצעות הוכחת חיידקים (0.22 מיקרומטר) מסנן.
  2. חיידקים DNA הפקת גראם שליליים
    1. Streak החומר המטופל על התקשורת והתרבות מתאימה (למשל, קולומביה דם אגר), לזהות ולבודד פתוגנים פוטנציאליים.
    2. הכן תרבות טהורה ולבצע גראם מכתים על מנת לקבוע morphotype וכדי לאשר טוהר של התרבות 49.
    3. פיק מושבת חיידקים בודד ולהעביר אותו עם לולאת חיסון 1 μl לשימוש חד לתוך צינור 2.0 מיליליטר תגובה סטרילי המכיל 1 מיליליטר פתרון PBS.
    4. דגירת השעיה זה בתוך Thermomixאה ב 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר דגירה, לתת תמצית חיידקים (המכיל את ה- DNA המומס) להתקרר לטמפרטורת חדר ואו להשתמש בו ישירות על הגברה או בחנות ב -20 ° C לשימוש נוסף (איור 1 א).
  3. חיידקים DNA הפקת גראם חיוביים
    1. Streak החומר המטופל על התקשורת והתרבות מתאימה (למשל, קולומביה דם אגר), לזהות ולבודד פתוגנים פוטנציאליים. בצע-צביעת גראם כדי לאשר morphotype של התרבות.
    2. הכן תרבות טהורה ולבצע גראם מכתים על מנת לקבוע morphotype וכדי לאשר טוהר התרבות.
    3. פיק מושבת חיידקים בודד עם לולאת 1 μl חיסון סטרילית להתלותו ב 500 פתרון μl PBS בצינור 2.0 מיליליטר תגובה.
    4. הוספת 500 זכוכית חרוזי μl ולהעביר את הצינור אל homogenizer נדנוד, פעל תדירות אמפליטודה מקסימלית (50 הרץ), במשך 5 דקות. השתמש זכוכית חרוזים בקוטר 1.0 מ"מלשבש את קירות תא החיידק.
    5. דגירה הצינור הזה במשך 10 דקות ב 95 מעלות צלזיוס ו להתקרר לטמפרטורת החדר. השתמש לחלץ במישרין עבור התגובה או חנות PCR ב -20 ° C לשימוש נוסף.

2. 16S rDNA PCR

  1. הכנת Primers הגברה
    1. השתמש TPU1 פריימרים (5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3 '[M = A / C]) כמו פריימר קדימה RTU4 (5'-TAC CAG GGT ATC TAA TCC TGT T-3') כמו פריימר הפוכה 25. הכן פתרון מניות פריימר עם DNAse ומים חינם RNAse, שיש ריכוז של 100 pmol / μl (100 מיקרומטר) ו לדלל אותו עוד יותר כדי פתרון עובד ב 10 pmol / μl. אחסן את מניית פריימר פתרון עובד ב -20 ° C או להשתמש ישירות.
  2. הכנת תערובת תגובת PCR
    1. פיפטה 1 μl של כל צבע יסוד, 1 μl לערבב dNTP (100 מ"מ), 2.5 μl של תמצית ה- DNA, 5 μl חיץ PCR 10x (המכיל 25 מ"מ MgCl 2), 0.25 μl-פולימראז תקי (5 יחידות / μl) ו 39.25 μl DNAse- ו RNAse מים PCR חופשי לתוך צינור התגובה סטרילי 200 μl.
  3. PCR פרוטוקול
    1. הפעל את תכנית ה- PCR הבנויה כדלקמן: ראשית, צעד דגירה ראשוני ב 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות אשר יש צורך להפעיל את-פולימראז תקי. שנית, 35 מחזורי הגברה, המכילים דקות 1. צעד denaturation על 95 מעלות צלזיוס, דק 1. צעד חישול פריימר על 50 מעלות צלזיוס, וצעד הארכה יחל 1.5 דקות ב 72 מעלות צלזיוס. שלישית, סיומת סופית במשך 10 דקות ב 72 מעלות צלזיוס. לבסוף, תגובת PCR הוא מקורר עד 4 ° C.
      הערה: Staphylococcus aureus ו- H 2 O לשמש שליטה חיובית ושלילית (איור 1b).
    2. מניחים את הצינור המכיל את תערובת התגובה PCR ב thermocycler ולהתחיל את התוכנית.
  4. טיהור של המוצר PCR
    הערה: כדי לטהר את מוצר ה- PCR, כמה פרוטוקולים אואנזים מבוסס או עם מטריצת ספיחת סיליקה ניתן להשתמש. על מלאכת ניקוי PCR בשלב יחיד משמש כאן מנצל שתי תגובות אנזימטיות hydrolytic. בעוד exonuclease אני (Exo I) מסיר גדילי הדנ"א אחד, phosphatase אלקליין שרימפס (SAP) הידרוליזה dNTPs מאוגדים. הנוהל השני מבוסס על טכניקת ספיחת סיליקה הממברנה עם מלח גבוה מהר מחייב - לשטוף - מחזור elution מלח נמוך.
    1. הוסף 1.5 μl של תמהיל אנזימטי המכיל גם Exo I ו- SAP ל -25 μl מוצר ה- PCR, ומערבב היטב ומעביר thermocycler החלת פרוטוקול פשוט של 15 דקות הראשונות ב 37 ° C ואחריו 15 דקות ב 80 מעלות צלזיוס. אחסן את מוצר PCR המטוהר או ב -20 ° C או להשתמש בו ישירות כיעד תיוג PCR.

3. DNA Agarose ג'ל אלקטרופורזה

  1. הכנה של הצפת אלקטרופורזה (TBE-חיץ)
    1. לכייל 54.0 גרם (445 מ"מ) בסיס טריס, 27.5 גרם (445 מ"מ) חומצה בורה ו -20 מיליליטר של 0.5 מ 'EDTA (108.0 מ"מ) פתרון ב- pH עם NaOH בבקבוק ולמלא אותו במים מזוקקים כדי בהיקף כולל של 1,000 מ"ל. ואז לדלל חיץ 5x זה 1:10 עם מים מזוקקים (0.5x TBE) אלקטרופורזה.
  2. הכנה של ההצפה טוען
    1. מערבבים 250 מ"ג bromophenol כחול, 250 מ"ג FF קסילן cyanol ו -15 גרם של polysucrose (לוח חומרים) לתוך בקבוק. ואז למלא אותו עם חיץ TBE 0.5x כדי בהיקף כולל של 100 מ"ל. Aliquot לצבוע הטעינה עד 1 מיליליטר חלק ולאחסן ב -20 ° C לשימוש נוסף.
  3. יציקה של ג'ל Agarose
    1. לשקול 6 גרם אלקטרופורזה תקן agarose 300 מ"ל חיץ 0.5x TBE (ראה סעיף 3.1.1) בבקבוק, להכין% 2 (w / v) agarose ג'ל. ואז לשים את תערובת agarose במיקרוגל, לחמם אותו כמעט רותחת נקודה עד agarose נמס לגמרי והפתרון נראה ברור ומובן.
    2. תנו agarose מותכת לקרר מספיק ולהוסיף 10 μl של 1% (w / v) ethidium solu המניות ברומידtion. יוצקים את הפתרון לתוך הגבס ומניחים מסרק ג'ל (המאפשר 30 בארות) בצוות. הסר את המסרק כאשר הג'ל הוא הקרושה לגמרי ולשים את הג'ל לתוך תא אלקטרופורזה המכיל חיץ 0.5x TBE.
      הערה: ברומיד Ethidium רעיל מוטגנים. לכן זה צריך להיות מטופל בזהירות. מומלץ להשתמש בכפפות ניטריל. ישנם כתמי חומצת אלטרנטיבת intercalating גרעין אשר יכול לשמש כחלופה רעילה.
  4. Agarose ג'ל אלקטרופורזה של מוצרי ה- PCR
    הערה: כדי לאמת את הגודל הנכון של amplicons PCR וכדי להעריך את ריכוז ה- DNA המוצר המטוהר PCR מופרד ב ג'ל agarose.
    1. פיפטה 2 μl של חיץ הטעינה לתוך צינור תגובת PCR ולהוסיף 8 μl של מוצר ה- PCR. פיפטה תערובת זו לתוך הבארות של ג'ל. הוסף 8 μl של סמן גודל משקל מולקולרי (סולם DNA) בבאר נפרדת להעריך את גודל מוצר PCR.
    2. להגיש מועמדותמתח קבוע ב 10 V / ס"מ ולעצור את אלקטרופורזה בהקדם הסימן הכחול bromophenol הגיע על ¾ של האורך הכולל של ג'ל. דמיינו את שברי PCR מופרדים באמצעות UV-transilluminator (אורך גל 302 ננומטר) ולתעד אותם באמצעות מערכת ג'ל-תיעוד. להעריך את כמות ה- DNA על ידי השוואה ויזואלית עם סולם DNA. השתמשו כ -10 ננוגרם כיעד עבור תיוג PCR.

4. רצף סנגר

  1. מחזור רצף PCR
    הערה: בצע את תיוג PCR בריאקצית 10 μl באמצעות ערכה מסחרית (חומרי טבלה).
    1. הוסף 2 μl של mastermix תגובה 5x, 2 μl של הכנת ה- DNA, 1.5 μl של פתרון עובד TPU1 או RTU4 (10 pmol / μl) ו -4.5 μl של DNAse ומים חינם RNAse.
    2. שים תערובת התגובה רצף זה ב thermocycler ולהפעיל אחר PCR. בסך הכל, מחזורי תהליך 25 מורכב צעד denaturation (96 מעלות צלזיוס,10 שניות), צעד חישול (45-60 מעלות צלזיוס, 5 שניות) אשר היוו צעד ארכה (60 ° C, 2 דקות). לבסוף, לקרר את התגובה עד 4 מעלות צלזיוס.
  2. טיהור של תגובת הסידור
    1. לטהר את תערובת תגובת תיוג באמצעות עמודות ספין מסחריות לטיהור PCR (לוח חומרים).
    2. טען 10 μl של התגובה סידור על מטריקס ג'ל-סינון מראש hydrated ולבצע צעד צנטריפוגה ב 750 XG במשך 3 דקות.
      הערה: על ידי השימוש בהליך זה terminators לצבוע שאינו שייך לגורם הרשמי נשמר במטריצת ג'ל.
    3. לאחר מכן לייבש את eluate המימי בתוך concentrator ואקום. צנטריפוגה ב 2500 XG במשך 20 עד 30 דקות ב 40 מעלות צלזיוס עד שהיא יבשה לחלוטין.
    4. הוסף 10 μl של לפוראמיד deionized מאוד אז לפגל על ​​90 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות ו לקרר את התערובת על קרח. פיפטה 10 μl של הדגימות המפוגלות על צלחת μl 96 באר. אחסן את מוצר PCR היבש וניקה ב -20 ° C. אם הניתוח הואלהתבצע במועד מאוחר יותר.
  3. 16S rRNA ג'ין רצף וניתוח של רצף DNA
    הערה: ביצוע ניתוח רצף על ברצף מתקדם (לוח חומרים). ברצף משמש כאן הוא מערכת אלקטרופורזה נימי קרינה המבוססת אוטומטית המנתחת 4 דגימות בו זמנית (50 סנטימטרי מערך 4-נימים) עם (איור 1 ג ') נוזל פולימר 67.
    1. מניחים את הצלחת microtiter ב ברצף. כתוב גיליון מדגם (שיא צלחת) כפי שהותווה ב 2, ולשמור אותו ולהתחיל ניתוח רצף הריצה / ביצוע השלבים הנתונים 1.
      הערה: משך ריצה ברצף הוא 2 שעות ומספק נתונים מ -800 ל -1,000 נקודות בסיס.
    2. פתח את תוכנת ניתוח רצף (לוח חומרים). נתוני רצף ניתנים כקובץ טקסט (.seq) ואת קובץ המכיל את electropherogram כולל ערכי איכות (ע"ע) (.ab1).
      הערה: קורא הבסיס הוא אוטומטי לכלנוצר על ידי התוכנה לניתוח רצפי ואת electropherogram הבסיסית נבדקת חזותי (למשל, גובה שיא, פרדת שיא) לפני הרצף משמש ליישומים נוספים.
    3. השווה את קובץ רצף DNA מאוחסן על מסד נתונים ע"נ צמח שדה באמצעות האלגוריתם יפציץ (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide).

5. MALDI-TOF MS

הערה: ספקטרומטר מסה נעשה שימוש בלייזר 337 ננומטר N 2, והוא מופעל על ידי תוכנות שליטה ספציפיים (חומרי טבלה). ספקטרה נרשמת במצב ליניארי ומגוון המוני בין 2,000 ל -20,000 Da מכוסה. פרשנות נתונים והקצאת עשרות דגימות מתבצעת בזמן אמת על ידי תוכנת ניתוח (לוח חומרים) (איור 1D).

  1. הכנת חיידקים עבור MALDI-TOF MS ניתוח
    1. לגדל את החיידקים של עניין (למשל, Myroides odoratimimus) על Colאגר דם umbia המכיל סוס דם 5% ב 37 מעלות צלזיוס למשך 18 עד 24 שעות, תלוי זן החיידקים (איור 2 א). בצע-צביעת גראם לאמת את morphotype של האורגניזם תחת חקירה וכן טוהר התרבות.
    2. השתמש קיסם עץ להעברת מושבת חיידקים יחידה באר מטרת פלדת 96-היטב (איור 2b ו 2c). ספוט 1 μl של 70% חומצה פורמית על גבי האורגניזם האוויר היבש על יעד הפלדה ולהשאיר לייבוש למשך כ 2-3 דקות.
    3. לאחר מכן, מכסים את המקום עם פתרון מטריקס 1 μl, המכיל 50 מ"ג / מ"ל CHCA (α-Cyano-4-hydroxycinnamic חומצה) ב ממיס אורגני (50% אצטוניטריל, 2.5% חומצה trifluoroacetic, 47.5% H 2 O).
      הערה: שיטת כיסוי החומצה (על שיטת הכנת צלחת) ניתן להשתמש כדי לשפר את איכות ספקטרה ההמונית. הוכח כי לחיידקים חיוביים-גראם כגון "התקפת חומצה" מגדילה את תוצאת vaלוקים של הספקטרום הנמדד 45.
      הערה: לחלופין מערכת הכנת מדגם מתקדמת (לוח חומרים) ניתן להשתמש בו כתמי קשר חופשי של 1 μl 70% תמיסת חומצה פורמית, לאחר מחזור ייבוש ראשון, 1 μl פתרון מטריקס מוחלים על כתם החיידקים. הדגימות מיובשות אז בתנאים סטנדרטיים ב- 60% לחות יחסית והם מוכנים לשימוש עבור ניתוח.
    4. תנו למרוח עם מטריקס מעולף-אוויר יבש שוב למשך כ -5 דקות במנדף. למרוח חיידקים זה עם מטריקס להחיל כעת יציב במשך שעות רבות.
      הערה: מריחות בקטריאלי ללא מטריקס יכול להוות את הבעיה עקב פירוק חלבונים.
  2. ביצוע ניתוח MS MALDI-TOF
    1. מבוא של דגימות
      1. פתח את תוכנת השליטה mMIS שלנו (לוח חומרים).
      2. לאורר בנמל הטעינה מדגם של ספקטרומטר מסה על ידי לחיצה על כפתור IN / OUT של המכשיר.
      3. פתח בנמל הטעינה אחרי קליק והכנס את צלחת היעד MALDI-TOF MS עם הכתם חיידקים יבשים בתוספת מטריקס.
      4. סגור את היציאה ולפנות שוב. שים ואקום כאשר הוא מגיע 4.5 x 10 -6 mbar להתחיל מדידה.
    2. ניתוח מדגם
      1. פתח את תוכנת ניתוח mMIS שלנו (לוח חומרים) ולחץ על תפריט "קובץ". בחר "סיווג חדש" וחלון חדש "אשף הסיווג בזמן אמת MALDI biotyper" נפתח. הקלד את שם הפרויקט, למשל "project_1 המדידה Myroides, בתחום" שם הפרויקט "ולחץ על כפתור" חדש ". תחת בתיבת הדו-שיח חדש בשם" פרוייקט חדש "שם בדיקת הפרויקט להמשיך ידי לחיצה על כפתור" אישור ".
      2. ב "אשף הסיווג בזמן אמת MALDI biotyper" להתבונן בחלון "מיקום אנליטי" פתוח. עמדות יעד בחרו (למשל, A1, A2, A3 ...), ימני CLIck כל עמדה נבחרת (המסומן בריבוע כחול) ובחרו באפשרות "הוסף דגימות". בסוג תצוגת הטבלה הנפתח באופן אוטומטי שם מדגם, מזהה מדגם ישן אפשרות להוסיף תגובה. לחץ על הכפתור "הבא" כדי להמשיך.
      3. ב "אשף הסיווג בזמן אמת MALDI biotyper" להתבונן בחלון "בחירת MALDI שיטות biotyper" פתוח. בחר "טקסונומיה Bruker" מ "MSPs מעצים הטקסונומיה" ולחץ על "הבא" כדי להמשיך.
      4. ב "אשף הסיווג בזמן אמת MALDI biotyper" להתבונן בחלון "סיכום פרויקט" פתוח. בדקו את הערכים המוכנסים שניתנו לעיל על פרויקט הסיווג בפועל. התחל בסיווג מנוהל על ידי לחיצה על הכפתור "סיום" (איור 2 - ו). מדידה מתחילה באופן אוטומטי כאשר הוא הגיע הוואקום המתאים.
      5. עקוב בטווח הסיווג עד המדידה תושלם בהצלחה. הצג את טבלת התוצאות ב tהוא "פרויקט סיווג MALDI Biotyper זמן אמת Myroides המדידה project_1" לפתוח את התפריט "תצוגה" ולחץ על "תוצאות".
      6. לראות את הקובץ "תוצאות סיווג Bruker Daltonics MALDI Biotyper" כמו HTML בדפדפן האינטרנט המוגדר כברירת מחדל. הדפס ולשמור את התוצאות.
    3. מדוד תקן בדיקה יומית לפני לדגום ניתוח לכייל את המכשיר ולבצע שבועי אימות מכשיר (בדיקה עצמית מכשיר).
      הערה: במהלך ספקטרה המדידה MALDI-TOF מנותחים בזמן אמת על ידי תוכנת ניתוח (לוח חומרים). רשימת עשרה מינים עם הציונים שלהם ניתנת מוזן לתוך מערכת מידע מעבדה (LIS) לדיווח.
    4. האנושות להעריך את תוצאות MS MALDI-TOF (ראה תוצאות נציג), ואם תימצא מתאים, כוללות בדיקות אחרות, כגון פרופילים רגישים biochemical- ו אנטיביוטיים או רצף גן 16S rRNA, ואם-צביעת גראם הכרחית עבורהקצאת זן חיידקי דיווח המיקרוביולוגית.

תוצאות

MALDI-TOF MS הוא רומן, שיטה מהירה וזולה לאבחון שגרתי מיקרוביולוגית. זיהוי מיני חיידקים ידי MALDI-TOF MS מייצר ספקטרום המורכב בעיקר של חלבונים ריבוזומלי אלא גם "חלבונים נשמרים מאוד עם פונקציות-שמירה על הבית המושפע במידה מועטת על ידי תנאים סביבתיים" אחרים <...

Discussion

שניהם MALDI-TOF MS וסדר הגן 16S rRNA להציע את האפשרות לזהות מספר רב של חיידקים שונים. MALDI-TOF MS היא שיטה מהירה וזולה, אשר קל להתמודד ומסדי נתונים גדולים של ספקטרה ההמונית חיידקים זמינים. מסיבה זו, MALDI-TOF MS היא שיטה מהירה, עלות אפקטיבית אמינה לערוך מחקרי הקרנה התמקדו חיידקים פתוגנים...

Disclosures

The authors declare that they have no competing financial interests.

Acknowledgements

The authors would like to thank Prof. Enno Jacobs for his continuing support.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
CHROMASOLV, HPLC grade water, 1 LSigma-Aldrich Chemie, München, Germany270733
Tissue Lyser LTQiagen, Hilden, Germany85600Oscillating Homogenizer
Glass-beads 1,0mmVWR International, Darmstadt, Germany412-2917
Thermomixer 5436Eppendorf, Hamburg, Germany2050-100-05
QIAamp DNA Mini Kit (250)Qiagen, Hilden, Germany51306
Taq PCR Core Kit (1000 U)Qiagen, Hilden, Germany201225
Forward Primer TPU1 (5´-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’)biomers.net GmbH, Ulm, Germany -
Reverse Primer RTU4 (5´-TAC CAG GGT ATC TAA TCC TGT T-3´)biomers.net GmbH, Ulm, Germany -
Mastercycler Eppendorf, Hamburg, Germany- Thermocylcer
Reaction tube 1.5 mLSARSTEDT, Nümbrecht, Germany72,692
Reaction tube 2 mLSARSTEDT, Nümbrecht, Germany72,693,005
PCR 8er-CapStripsBiozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany711040X
PCR 8er-SoftStripsBiozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany711030X
Sharp R-ZV11 Sharp Electronics, Hamburg, Germany-Microwave
Titriplex III (EDTA Na2-salt dehydrate; 1 kg)Merck, Darmstadt, Germany1084211000
SeaKem LE AgaroseBiozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany849006
(2 x 500 g)
SmartLadder SF - 100 to 1000 bpEurogentec, Lüttich, BelgiumMW-1800-04
Bromphenol blue (25 g)Sigma-Aldrich Chemie, München, GermanyB0126
Xylene cyanol FF (10 g)Sigma-Aldrich Chemie, München, GermanyX4126
ComPhor L Maxi Biozym, Hessisch Oldendorf, Germany-
Ethidium bromide solution 1 %(10 mL)Carl Roth, Karlsruhe, Germany2218.1
Gel Doc 2000Bio-Rad Laboratories, München, Germany-Gel-documentation system 
ExoSAP-IT (500 reactions)Affymetrix UK, Wooburn Green, High Wycombe, United Kingdom78201
Buffer (10 x) with EDTA Life Technologies, Darmstadt, Germany402824
BigDye Terminator Kit v1.1Life Technologies, Darmstadt, Germany4337450
Hi-Di formamide (25 mL)Life Technologies, Darmstadt, Germany4311320
DyeEx 2.0 Spin Kit (250)Qiagen, Hilden, Germany63206
3130 Genetic AnalyzerLife Technologies, Darmstadt, Germany-Sequenzer
MicroAmp optical 96-well reaction plate with barcodeLife Technologies, Darmstadt, Germany4306737
3130 Genetic Analyzer, plate base 96-wellLife Technologies, Darmstadt, Germany4317237
3130 Genetic Analyzer, plate retainer 96-wellLife Technologies, Darmstadt, Germany4317241
3130 Genetic Analyzer, well plate septaLife Technologies, Darmstadt, Germany4315933
3130 Genetic Analyzer, POP-7 Polymer, 7 mLLife Technologies, Darmstadt, Germany4352759
3130 Genetic Analyzer, 4-Capillary Array, 50 cmLife Technologies, Darmstadt, Germany4333466
Sequencing Analysis Software 5.4Life Technologies, Darmstadt, Germany-
microflex (the MALDI TOF MS maschine)Bruker Daltonik, Bremen, Germany-
MALDI Biotyper (the MALDI TOF MS system)Bruker Daltonik, Bremen, Germany-our mMIS
VITEK MS bioMérieux, Nürtingen, Germany 2nd mMis 
flexControl 3.4 (control software)Bruker Daltonik, Bremen, Germany-
Biotyper Realtime Classification 3.1 (RTC), (analysis software)Bruker Daltonik, Bremen, Germany-
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, HCCA, 1 gBruker Daltonik, Bremen, Germany201344
Peptide Calibration Standard IIBruker Daltonik, Bremen, Germany222570
MSP 96 target polished steelBruker Daltonik, Bremen, Germany8224989
peqgreen peqlab 37-5010
MALDI Biotyper Galaxy Bruker Daltonik, Bremen, GermanyPart No. 1836007 
Vitek 2 bioMérieux, Nürtingen, Germany our aMis 
MicroScan Beckman Coulter 2nd aMis 
BD Phoenix™ Automated Microbiology SystemBD3rd aMis 
Staphylococcus aureus subsp. aureus Rosenbach (ATCC® 25923™)ATCC postive control for PCR 

References

  1. . . Applied Biosystems 3130/3130xl Genetic Analyzers - Getting Started Guide. , (2010).
  2. . Ch. 5. Applied Biosystems 3130/3130xl Genetic Analyzers - Getting Started Guide. , 81-104 (2010).
  3. Adekambi, T., Drancourt, M., Raoult, D. The rpoB gene as a tool for clinical microbiologists. Trends Microbiol. 17 (1), 37-45 (2009).
  4. Almuzara, M. N., et al. First case of fulminant sepsis due to Wohlfahrtiimonas chitiniclastica. J.Clin.Microbiol. 49 (6), 2333-2335 (2011).
  5. Areekul, S., Vongsthongsri, U., Mookto, T., Chettanadee, S., Wilairatana, P. Sphingobacterium multivorum septicemia: a case report. J.Med.Assoc.Thai. 79 (6), 395-398 (1996).
  6. Aydin, T. T., et al. Chryseobacterium indologenes Septicemia in an Infant. Case Rep.Infect.Dis. 2014, 270521 (2014).
  7. Baillie, S., Ireland, K., Warwick, S., Wareham, D., Wilks, M. Matrix-assisted laser desorption/ionisation-time of flight mass spectrometry: rapid identification of bacteria isolated from patients with cystic fibrosis. Br.J.Biomed.Sci. 70 (4), 144-148 (2013).
  8. Benedetti, P., Rassu, M., Pavan, G., Sefton, A., Pellizzer, G. Septic shock, pneumonia, and soft tissue infection due to Myroides odoratimimus: report of a case and review of Myroides infections. Infection. 39 (2), 161-165 (2011).
  9. Bertelli, C., Greub, G. Rapid bacterial genome sequencing: methods and applications in clinical microbiology. Clin.Microbiol.Infect. 19 (9), 803-813 (2013).
  10. Bhuyar, G., Jain, S., Shah, H., Mehta, V. K. Urinary tract infection by Chryseobacterium indologenes. Indian J.Med.Microbiol. 30 (3), 370-372 (2012).
  11. Buchan, B. W., Ledeboer, N. A. Emerging technologies for the clinical microbiology laboratory. Clin.Microbiol.Rev. 27 (4), 783-822 (2014).
  12. Castillo-Rojas, G., et al. Comparison of Enterococcus faecium and Enterococcus faecalis Strains isolated from water and clinical samples: antimicrobial susceptibility and genetic relationships. PLoS ONE. 8 (4), e59491 (2013).
  13. Chatzigeorgiou, K. S., Sergentanis, T. N., Tsiodras, S., Hamodrakas, S. J., Bagos, P. G. Phoenix 100 versus Vitek 2 in the identification of gram-positive and gram-negative bacteria: a comprehensive meta-analysis. J.Clin.Microbiol. 49 (9), 3284-3291 (2011).
  14. Clarridge, J. E. Impact of 16S rRNA gene sequence analysis for identification of bacteria on clinical microbiology and infectious diseases. Clin.Microbiol.Rev. 17 (4), 840-862 (2004).
  15. Crowley, E., et al. Evaluation of the VITEK 2 Gram-negative (GN) microbial identification test card: collaborative study. J.AOAC Int. 95 (3), 778-785 (2012).
  16. Crowley, E., et al. Evaluation of the VITEK 2 gram positive (GP) microbial identification test card: collaborative study. J.AOAC Int. 95 (5), 1425-1432 (2012).
  17. Croxatto, A., Prod'hom, G., Greub, G. Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology. FEMS Microbiol.Rev. 36 (2), 380-407 (2012).
  18. Crum-Cianflone, N. F., Matson, R. W., Ballon-Landa, G. Fatal case of necrotizing fasciitis due to Myroides odoratus. Infection. 42 (5), 931-935 (2014).
  19. Deak, E., et al. Comparison of the Vitek MS and Bruker Microflex LT MALDI-TOF MS platforms for routine identification of commonly isolated bacteria and yeast in the clinical microbiology laboratory. Diagn.Microbiol.Infect.Dis. 81 (1), 27-33 (2015).
  20. DeMarco, M. L., Ford, B. A. Beyond identification: emerging and future uses for MALDI-TOF mass spectrometry in the clinical microbiology laboratory. Clin.Lab.Med. 33 (3), 611-628 (2013).
  21. Deng, J., et al. Comparison of MALDI-TOF MS, gene sequencing and the Vitek 2 for identification of seventy-three clinical isolates of enteropathogens. J.Thorac.Dis. 6 (5), 539-544 (2014).
  22. Drancourt, M., Berger, P., Raoult, D. Systematic 16S rRNA gene sequencing of atypical clinical isolates identified 27 new bacterial species associated with humans. J.Clin.Microbiol. 42 (5), 2197-2202 (2004).
  23. Fenselau, C., Demirev, P. A. Characterization of intact microorganisms by MALDI mass spectrometry. Mass Spectrom.Rev. 20 (4), 157-171 (2001).
  24. Freney, J., et al. Septicemia caused by Sphingobacterium multivorum. J.Clin.Microbiol. 25 (6), 1126-1128 (1987).
  25. Funke, G., Frodl, R., Sommer, H. First comprehensively documented case of Paracoccus yeei infection in a human. J.Clin.Microbiol. 42 (7), 3366-3368 (2004).
  26. Funke, G., Funke-Kissling, P. Evaluation of the new VITEK 2 card for identification of clinically relevant gram-negative rods. J.Clin.Microbiol. 42 (9), 4067-4071 (2004).
  27. Funke, G., Funke-Kissling, P. Performance of the new VITEK 2 GP card for identification of medically relevant gram-positive cocci in a routine clinical laboratory. J.Clin.Microbiol. 43 (1), 84-88 (2005).
  28. Gaillot, O., et al. Cost-effectiveness of switch to matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for routine bacterial identification. J.Clin.Microbiol. 49 (12), 4412 (2011).
  29. Gilchrist, C. A., Turner, S. D., Riley, M. F., Petri, W. A., Hewlett, E. L. Whole-genome sequencing in outbreak analysis. Clin.Microbiol.Rev. 28 (3), 541-563 (2015).
  30. Holland, R. D., et al. Rapid identification of intact whole bacteria based on spectral patterns using matrix-assisted laser desorption/ionization with time-of-flight mass spectrometry. Rapid Commun.Mass Spectrom. 10 (10), 1227-1232 (1996).
  31. Holmes, B., Owen, R. J., Hollis, D. G. Flavobacterium spiritivorum, a new species isolated from human clinical specimens. Int.J.Syst.Bacteriol. 32 (2), 157-165 (1982).
  32. Holmes, B., Owen, R. J., Weaver, R. E. Flavobacterium multivorum, a new species isolated from human clinical specimens and previously known as group IIk, biotype 2. Int.J.Syst.Bacteriol. 31 (1), 21-34 (1981).
  33. Jamal, W., Albert, M., Rotimi, V. O. Real-time comparative evaluation of bioMerieux VITEK MS versus Bruker Microflex MS, two matrix-assisted laser desorption-ionization time-of-flight mass spectrometry systems, for identification of clinically significant bacteria. BMC Microbiol. 14 (1), 289 (2014).
  34. Janda, J. M., Abbott, S. L. 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: pluses, perils, and pitfalls. J.Clin.Microbiol. 45 (9), 2761-2764 (2007).
  35. Jin, W. Y., et al. Evaluation of VITEK 2, MicroScan, and Phoenix for identification of clinical isolates and reference strains. Diagn.Microbiol.Infect.Dis. 70 (4), 442-447 (2011).
  36. Jossart, M. F., Courcol, R. J. Evaluation of an automated system for identification of Enterobacteriaceae and nonfermenting bacilli. Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis. 18 (12), 902-907 (1999).
  37. Karas, M., Hillenkamp, F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Anal.Chem. 60 (20), 2299-2301 (1988).
  38. Koh, Y. R., et al. The first Korean case of Sphingobacterium spiritivorum bacteremia in a patient with acute myeloid leukemia. Ann.Lab.Med. 33 (4), 283-287 (2013).
  39. Kok, J., Chen, S. C., Dwyer, D. E., Iredell, J. R. Current status of matrix-assisted laser desorption ionisation-time of flight mass spectrometry in the clinical microbiology laboratory. Pathology. 45 (1), 4-17 (2013).
  40. Koljalg, S., et al. First report of Wohlfahrtiimonas chitiniclastica from soft tissue and bone infection at an unusually high northern latitude. Folia Microbiol.(Praha). , (2014).
  41. Krishnamurthy, T., Ross, P. L. Rapid identification of bacteria by direct matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric analysis of whole cells. Rapid Commun.Mass Spectrom. 10 (15), 1992-1996 (1996).
  42. Ktari, S., et al. Nosocomial outbreak of Myroides odoratimimus urinary tract infection in a Tunisian hospital. J.Hosp.Infect. 80 (1), 77-81 (2012).
  43. Lim, Y. M., Shin, K. S., Kim, J. Distinct antimicrobial resistance patterns and antimicrobial resistance-harboring genes according to genomic species of Acinetobacter isolates. J.Clin.Microbiol. 45 (3), 902-905 (2007).
  44. Marinella, M. A. Cellulitis and sepsis due to sphingobacterium. JAMA. 288 (16), 1985 (2002).
  45. McElvania, T. E., Shuey, S., Winkler, D. W., Butler, M. A., Burnham, C. A. Optimizing identification of clinically relevant Gram-positive organisms by use of the Bruker Biotyper matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system. J Clin.Microbiol. 51 (5), 1421-1427 (2013).
  46. Mellmann, A., et al. Evaluation of matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight mass spectrometry in comparison to 16S rRNA gene sequencing for species identification of nonfermenting bacteria. J.Clin.Microbiol. 46 (6), 1946-1954 (2008).
  47. Mignard, S., Flandrois, J. P. 16S rRNA sequencing in routine bacterial identification: a 30-month experiment. J.Microbiol.Methods. 67 (3), 574-581 (2006).
  48. Nomura, F. Proteome-based bacterial identification using matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS): A revolutionary shift in clinical diagnostic microbiology. Biochim.Biophys.Acta. , (2014).
  49. Opota, O., Croxatto, A., Prod'hom, G., Greub, G. Blood culture-based diagnosis of bacteraemia: state of the art. Clin.Microbiol.Infect. 21 (4), 313-322 (2015).
  50. Patel, J. B. 16S rRNA gene sequencing for bacterial pathogen identification in the clinical laboratory. Mol.Diagn. 6 (4), 313-321 (2001).
  51. Patel, R. MALDI-TOF MS for the Diagnosis of Infectious Diseases. Clin.Chem. , (2014).
  52. Pincus, D. H., Miller, M. J. Ch. 1. Encyclopedia of Rapid Microbiological Methods. , 1-32 (2005).
  53. Potvliege, C., et al. Flavobacterium multivorum septicemia in a hemodialyzed patient. J.Clin.Microbiol. 19 (4), 568-569 (1984).
  54. Rebaudet, S., Genot, S., Renvoise, A., Fournier, P. E., Stein, A. Wohlfahrtiimonas chitiniclastica bacteremia in homeless woman. Emerg.Infect.Dis. 15 (6), 985-987 (2009).
  55. Risch, M., et al. Comparison of MALDI TOF with conventional identification of clinically relevant bacteria. Swiss Med.Wkly. 140, 13095 (2010).
  56. Schröttner, P., Rudolph, W. W., Eing, B. R., Bertram, S., Gunzer, F. Comparison of VITEK2, MALDI-TOF MS, and 16S rDNA sequencing for identification of Myroides odoratus and Myroides odoratimimus. Diagn.Microbiol.Infect.Dis. 79 (2), 155-159 (2014).
  57. Schröttner, P., Rudolph, W. W., Taube, F., Gunzer, F. First report on the isolation of Aureimonas altamirensis from a patient with peritonitis. Int.J.Infect.Dis. 29, 71-73 (2014).
  58. Schröttner, P., et al. Actinobacillus equuli ssp. haemolyticus in a semi-occlusively treated horse bite wound in a 2-year-old girl. Ger.Med.Sci. 11, (2013).
  59. Seng, P., et al. Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin.Infect.Dis. 49 (4), 543-551 (2009).
  60. Shahul, H. A., Manu, M. K., Mohapatra, A. K., Chawla, K. Chryseobacterium indologenes pneumonia in a patient with non-Hodgkin's lymphoma. BMJ Case.Rep. 2014, (2014).
  61. Stackebrandt, E., Göbel, B. M. Taxonomic note: a place for DNA-DNA reassociation and 16S rRNA sequence analysis in the present species definition in bacteriology. Int.J.Syst.Bacteriol. 44, 846-849 (1994).
  62. Tan, K. E., et al. Prospective evaluation of a matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system in a hospital clinical microbiology laboratory for identification of bacteria and yeasts: a bench-by-bench study for assessing the impact on time to identification and cost-effectiveness. J.Clin.Microbiol. 50 (10), 3301-3308 (2012).
  63. Tanaka, K. The origin of macromolecule ionization by laser irradiation (Nobel lecture). Angew.Chem.Int.Ed.Engl. 42 (33), 3860-3870 (2003).
  64. Thaiwong, T., Kettler, N. M., Lim, A., Dirkse, H., Kiupel, M. First report of emerging zoonotic pathogen Wohlfahrtiimonas chitiniclastica in the United States. J.Clin.Microbiol. 52 (6), 2245-2247 (2014).
  65. Török, M. E., Peacock, S. J. Rapid whole-genome sequencing of bacterial pathogens in the clinical microbiology laboratory--pipe dream or reality. J.Antimicrob.Chemother. 67 (10), 2307-2308 (2012).
  66. Toth, E. M., et al. Wohlfahrtiimonas chitiniclastica gen. nov., sp. nov., a new gammaproteobacterium isolated from Wohlfahrtia magnifica (Diptera: Sarcophagidae). Int.J.Syst.Evol.Microbiol. 58, 976-981 (2008).
  67. Tristezza, M., Gerardi, C., Logrieco, A., Grieco, F. An optimized protocol for the production of interdelta markers in Saccharomyces cerevisiae by using capillary electrophoresis. J.Microbiol.Methods. 78 (3), 286-291 (2009).
  68. Valentine, N. B., Wahl, J. H., Kingsley, M. T., Wahl, K. L. Direct surface analysis of fungal species by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. Rapid Commun.Mass Spectrom. 16 (14), 1352-1357 (2002).
  69. van Veen, S. Q., Claas, E. C., Kuijper, E. J. High-throughput identification of bacteria and yeast by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry in conventional medical microbiology laboratories. J.Clin.Microbiol. 48 (3), 900-907 (2010).
  70. Verma, R. K., Rawat, R., Singh, A., Singh, D. P., Verma, V. Sphingobacterium multivorum causing fatal meningoencephalitis: a rare case report. Int.J.Res.Med.Sci. 2 (4), 1710-1712 (2014).
  71. Yabuuchi, E., Kaneko, T., Yano, I., Moss, C. W., Miyoshi, N. Sphingobacterium gen. nov., Sphingobacterium spiritivorum comb. nov., Sphingobacterium multivorum comb. nov., Sphingobacterium mizutae sp. nov., and Flavobacterium indologenes sp. nov.: Glucose-nonfermenting Gram-negative rods in CDC groups IIK-2 and IIb. Int.J.Syst.Bacteriol. 33 (3), 580-598 (1983).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

11316S rRNAMALDI TOF MS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved