Identifizierung von Rare bakteriellen Erregern von 16S rRNA-Gen-Sequenzierung und MALDI-TOF-MS

Zusammenfassung

Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) and molecular techniques (16S rRNA gene sequencing) permit the identification of rare bacterial pathogens in routine diagnostics. The goal of this protocol lies in the combination of both techniques which leads to more accurate and reliable data.

Zusammenfassung

Es gibt eine Reihe von seltenen und daher unzureichend bakterielle Pathogene beschrieben, die schwere Infektionen berichtet werden insbesondere bei immunsupprimierten Patienten zu verursachen. In den meisten Fällen nur wenige Daten, meist als Fallberichte veröffentlicht, zur Verfügung, die die Rolle solcher Krankheitserreger wie ein infektiöses Agens untersuchen. Daher wird, um die pathogene Charakter solcher Mikroorganismen zu klären, ist es notwendig, epidemiologische Studien durchzuführen, die eine große Anzahl dieser Bakterien umfassen. Die verwendeten Methoden in einer solchen Überwachung Studie haben die folgenden Kriterien erfüllen: die Identifizierung der Stämme hat genau zu sein nach der gültigen Nomenklatur, sollten sie leicht sein (Robustheit), sparsam in der Routinediagnostik zu handhaben, und sie haben zu erzeugen, vergleichbar Ergebnisse unter verschiedenen Labors. Im Allgemeinen gibt es drei Strategien für die Bakterienstämme in einer Routineeinstellung identifiziert: 1) phänotypische Identifizierung der BioChemica charakterisierendenl und metabolischen Eigenschaften der Bakterien, 2) Molekulartechniken wie 16S rRNA-Gen-Sequenzierung und 3) Massenspektrometrie als neuartige Proteom basierten Ansatz. Da Massenspektrometrie und molekularen Ansätzen die vielversprechendsten Mittel zur Identifizierung einer Vielzahl von Bakterienarten sind, sind diese beiden Methoden beschrieben. Die Fortschritte, Grenzen und mögliche Probleme bei der Anwendung dieser Techniken werden diskutiert.

Einleitung

Sichere Identifizierung von seltenen Krankheitserregern in der Routinediagnostik wird durch die Tatsache erschwert, dass die klassische kulturelle und biochemische Methoden sind umständlich und manchmal fragwürdig. Darüber hinaus hat ein diagnostisches mikrobiologischen Labor eine große Anzahl von Krankheitserregern zu verarbeiten, von ein paar hundert bis zu mehreren tausend hin, täglich, die die Verwendung von automatisierten Systemen erfordert. Zusätzlich zu der Verwaltung eines hohen Tagesdurchsatz, die genaue Identifizierung von Bakterienspezies erforderlich. Dies ist gerechtfertigt , da sie in ihrer antimikrobiellen Empfindlichkeitsmuster unterscheiden und damit die korrekte Identifizierung liefert dem Arzt wichtige Informationen geeigneten Antibiotika zu wählen (zB Enterococcus spp., Acinetobacter spp.) ^12,43.

Automatisierte mikrobiellen Identifizierungssysteme (AMIS) gelten standardisierte Sätze von enzymatischen Reaktionen, die metabolischen Eigenschaften von bakteriellen Isolate zu charakterisieren ^{13,15,16,26,27. Obwohl die in diesen Systemen verwendeten Patronen verwenden , um eine große Anzahl von verschiedenen biochemischen Reaktionen, zum Beispiel 47 in der GN - Karte der AMIS in dieser Studie verwendeten 52, diese Strategie erlaubt eine sichere Identifikation nur für eine begrenzte Anzahl von Bakterien. Weiterhin wird die Datenbank, ein fortschrittliches Expertensystem fokussiert klar auf der Erfassung der relevanten und hoch relevanten Bakterien von medizinischer Bedeutung 13,15,16,36. Zwei weitere Systeme, die weithin in Laboratorien verwendet werden, gelten auch für diese biochemische Ansatz zur Identifizierung von Bakterien. Jüngste Studien zeigen eine vergleichbare Identifikationsgenauigkeit zwischen den Amis in dieser Studie und einer der Wettbewerber verwendet (93,7% bzw. 93,0%), während die 3. AMIS eine Identifikationsgenauigkeit von nur 82,4% hat auf Art 35 nivellieren. Solche Abweichungen können von der Qualität der zugrunde liegenden Identifikationsdatenreferenzen, die Versionen von Kits und Software, Unterschiede in metabo erklärt werdenlism und Kenntnisse des technischen Personals 35,36.}

Zwei automatisierte MALDI-TOF-MS-Systeme (MALDI-TOF mikrobiellen Identifizierungssystem, MMIS) werden hauptsächlich verwendet. Diese Systeme ermöglichen die Erfassung einer großen Anzahl von Bakterienspezies auf der Grundlage ihrer Protein Fingerabdruck-Massenspektren. Zum Beispiel verwendet die Datenbank des MMIs enthält 6,000 Referenzspektren. Identifikationssysteme basierend auf Massenspektrometrie bieten schnelle und zuverlässige Detektion einer Vielzahl von Mikroorganismen , einschließlich seltene Erreger ^11,48,51. Bis heute sind nur wenige direkte Vergleiche zwischen den verfügbaren MMIS in dieser Studie und der Wettbewerber verwendet ^19,33. Gemäß Daek et al. Beide Systeme bieten eine ähnlich hohe Rate der Identifikationsgenauigkeit, aber die in dieser Studie verwendet MMIs scheint in Speziesidentifizierung ¹⁹ zuverlässiger zu sein.

In ähnlicher Weise Adressieren molekulare Techniken gut konserviert, sondern auch verschiedene Gene ( zB 16S rDNA oder rpoB) ermöglichen eine eindeutige Identifizierung von Arten ^3,22,61. Unter diesen ist die 16S - rDNA der am häufigsten verwendete Housekeeping - Gen wegen seiner Präsenz in allen ³⁴ Bakterien. Seine Funktion unverändert bleibt und schließlich mit etwa 1500 bp, das lang genug ist , für Bio-Informatik ^14,34 eignen. Viele Forscher betrachten 16S rRNA - Gen - Analyse als "Gold-Standard" für die Identifizierung von Bakterien ^21. Dies ist aufgrund der Tatsache , dass nur wenige Laboratorien DNA-DNA - Hybridisierungstechniken bisher zur Identifizierung von seltenen oder neue Bakterien ^14,34 verwenden. Darüber hinaus werden immer mehr Datenbanken verfügbar , die für die 16S - rRNA - Gen - Analyse ⁵⁰ verwendet werden kann. Sie hat jedoch berücksichtigt werden, dass 16S rDNA basierten Detektionssystemen haben eine begrenzte Empfindlichkeit gegenüber Standard-PCR-Protokolle. Darüber hinaus ist die molekulare Ansatz anspruchsvoll, zeitaufwendig und erfordert gut ausgebildetes Personal sowiegewidmet Laboreinrichtungen und ist daher nicht so leicht in die Routinediagnostik implementiert ^55. Darüber hinaus hat es sich gezeigt, dass die Kombination von mindestens zwei verschiedenen Methoden der Bakterienidentifikation zur hochgenauen Dehnungs Identifizierung führt. Die Kombination von MALDI-TOF MS und 16S-rDNA-Sequenzierung erlaubt die Identifizierung einer großen Anzahl von verschiedenen Bakterienspezies mit hoher Genauigkeit. Vor kurzem hat die Kombination von MALDI-TOF - MS und 16S rRNA - Gen - Analyse wurde ⁵⁶ zur Identifizierung von Bakterien studieren epidemiologische Fragestellungen und seltene Krankheitserreger vorgestellt.

Protokoll

1. Extraktion von Bakterien-DNA

1. Herstellung der PBS-Lösung
   1. Wiegen 1,65 g Na ₂ HPO ₄ x 2H ₂ O, 0,22 g NaH ₂ PO ₄ x 2H ₂ O und 8,80 g NaCl in einem Kolben und füllt mit destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 1000 ml. Den pH-Wert auf 7,4. Für die endgültige Verwendung filtern Sie die Lösung durch eine bakteriendichte (0,22 & mgr; m-Filter).
2. DNA Extraction of Gram-negative Bacteria
   1. Streak das Patientenmaterial auf geeigneten Kulturmedien (zB Columbia - Blut - Agar), zu identifizieren und potenzielle Krankheitserreger zu isolieren.
   2. Bereiten Reinkultur und führen Gram-Färbung , um Morphotyp zu bestimmen und Reinheit zu bestätigen und der Kultur ^49.
   3. Wählen Sie eine einzelne Bakterienkolonie und übertragen es mit einem 1 ul einmaligen Gebrauch Impföse in eine sterile 2,0 ml Reaktionsröhrchen, die 1 ml PBS-Lösung enthält.
   4. Inkubieren diese Suspension in einem thermomixer bei 95 ° C für 10 min. Nach der Inkubation ließ den Bakterienextrakt auf Raumtemperatur abkühlen (die gelöste DNA enthält) und entweder zur Verstärkung oder bei -20 ° C zur weiteren Verwendung (Abbildung 1a) direkt verwenden.
3. DNA Extraction of Gram-positive Bakterien
   1. Streak das Patientenmaterial auf geeigneten Kulturmedien (zB Columbia - Blut - Agar), zu identifizieren und potenzielle Krankheitserreger zu isolieren. Führen Gram-Färbung, um Morphotyp der Kultur zu bestätigen.
   2. Bereiten Reinkultur und führen Gram-Färbung, um Morphotyp zu bestimmen und die Reinheit der Kultur zu bestätigen.
   3. Wählen Sie eine einzelne Bakterienkolonie mit einer sterilen 1 & mgr; l-Impföse und suspendieren es in 500 ul PBS-Lösung in einem 2,0 ml Reaktionsgefäß.
   4. Hinzufügen, 500 & mgr; l Glaskügelchen und übertragen die Röhre zu einer oszillierenden Homogenisators bei maximaler Frequenz betrieben und Amplitude (50 Hz) für 5 min. Verwenden Sie Glasperlen von 1,0 mm Durchmesserdie Bakterienzellwände zu zerstören.
   5. Inkubieren dieses Röhrchen 10 min bei 95 ° C und auf Raumtemperatur abkühlen. Verwenden Sie den Extrakt entweder direkt für die PCR-Reaktion oder bei -20 ° C zur weiteren Verwendung.

2. 16S rDNA-PCR

1. Herstellung von Amplifikationsprimern
   1. Verwenden Sie den Primer TPU1 (5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3 '[M = A / C]) als Vorwärtsprimer und RTU4 (5'-TAC CAG GGT ATC TAA TCC TGT T-3') als Reverse-Primer ^25. Bereiten Sie eine Grundierung Stammlösung mit DNAse und RNAse freies Wasser, um eine Konzentration von 100 pmol / ul (100 & mgr; M) und verdünnen Sie es weiter zu einer Arbeitslösung bei 10 pmol / ul. Bewahren Sie die Grundierung Lager und Arbeitslösung bei -20 ° C oder direkt verwendet werden.
2. Herstellung der PCR-Reaktionsmischung
   1. Pipette 1 & mgr; l jedes Primers, 1 & mgr; l dNTP-Mix (100 mM), 2,5 ul der DNA-Extrakt, 5 & mgr; l 10x PCR-Puffer (enthaltend 25 mM MgCl _2), 0,25 ul Taq-Polymerase (5 Einheiten / ul) und 39,25 ul DNase- und RNase - frei PCR Wasser in einen sterilen 200 ul Reaktionsröhrchen.
3. PCR-Protokoll
   1. Starten Sie die PCR-Programm wie folgt aufgebaut: Zunächst wird ein anfängliches Inkubationsschritt bei 95 ° C für 5 min, die notwendig ist, die Taq-Polymerase zu aktivieren. Zweitens 35 Amplifikationszyklen, enthaltend eine 1 min. Denaturierungsschritt bei 95 ° C, einer 1 min. Primer Temperschritt bei 50 ° C und einem 1,5 min Primerverlängerungsschritt bei 72 ° C. Drittens wird eine abschließende Extension für 10 min bei 72 ° C. Schließlich wird die PCR-Reaktion auf 4 ° C abgekühlt.
      HINWEIS: Staphylococcus aureus und H ₂ O dienen als positive und negative Kontrolle (Abbildung 1b).
   2. Das Röhrchen wird die PCR-Reaktionsmischung in den Thermocycler enthält, und das Programm starten.
4. Reinigung des PCR-Produkts
   HINWEIS: Um das PCR-Produkt, mehrere Protokolle zu reinigen, entwederEnzymbasis oder mit einem Siliciumdioxid Adsorptionsmatrix verwendet werden. Der einstufige verwendet PCR-Reinigung hier verwendet zwei hydrolytische enzymatische Reaktionen. Während Exonuclease I (Exo I) einzelsträngige DNA entfernt, Garnelen alkalische Phosphatase (SAP) hydrolisiert unincorporated dNTPs. Das zweite Verfahren basiert auf einer Silica-Membran-Adsorptionstechnik mit einem hohen Salz schnelle Bindung - waschen - niedrige Elution Zyklus Salz.
   1. In 1,5 ul einer Enzymmischung, die sowohl Exo I und SAP bis 25 & mgr; l PCR-Produkt, gut mischen und in ein Thermocycler ein einfaches Protokoll der ersten 15 min bei 37 ° C, gefolgt von 15 min bei 80 ° C anwenden. Lagern Sie das gereinigte PCR-Produkt entweder bei -20 ° C oder verwenden Sie es direkt als Ziel für die PCR-Markierung.

3. DNA Agarose-Gelelektrophorese

1. Herstellung des Elektrophorese-Puffer (TBE-Puffer)
   1. Titrieren 54,0 g (445 mM), Tris-Base, 27,5 g (445 mM) Borsäure und 20 ml einer 0,5 M EDTA (10mM) Lösung bei pH 8,0 mit NaOH in einem Kolben und füllt mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 1000 ml. Dann verdünnen diese 5x Puffer 1:10 mit destilliertem Wasser (0,5x TBE) für die Elektrophorese.
2. Herstellung des Loading Buffer
   1. Mischen Sie 250 mg Bromphenolblau, 250 mg Xylolcyanol FF und 15 g Polysucrose (Werkstoff - Tabelle) in einen Kolben. Dann füllen Sie es mit 0,5x TBE-Puffer auf ein Gesamtvolumen von 100 ml. Aliquot der Lade Farbstoff zu 1 ml-Portionen und bei -20 ° C für die weitere Verwendung.
3. Gießen des Agarosegels
   1. Wiegen 6 g Standard Elektrophorese Agarose zu 300 ml 0,5x TBE-Puffer (siehe Abschnitt 3.1.1) in einen Kolben, eine 2% (w / v) Agarose-Gel herzustellen. Dann legen Sie die Agarose-Gemisch in einem Mikrowellenofen, erhitzen Sie es in der Nähe von Siedepunkt, bis die Agarose vollständig gelöst ist und die Lösung klar erscheint.
   2. Lassen Sie die geschmolzene Agarose abkühlen ausreichend und fügen Sie 10 ul einer 1% (w / v) Ethidiumbromid Lager solution. Füllen Sie die Lösung in eine gegossene und legen Sie eine Gelkamm (unter Berücksichtigung von 30 Brunnen) in der Besetzung. Nehmen Sie den Kamm, wenn das Gel vollständig erstarrt ist und setzen Sie das Gel in die Elektrophoresekammer 0,5x TBE-Puffer enthält.
      HINWEIS: Ethidiumbromid ist toxisch und mutagen. Daher sollten Sie sie mit Vorsicht behandelt werden. Es ist ratsam, Nitril-Handschuhe zu benutzen. Es gibt alternative interkalierende Nukleinsäure Flecken, die als nicht-toxische Alternative verwendet werden kann.
4. Agarose-Gelelektrophorese der PCR-Produkte
   ANMERKUNG: Um die richtige Größe der PCR-Amplikons zu überprüfen und die DNA-Konzentration das gereinigte PCR-Produkt in einem Agarosegel aufgetrennt wird zu schätzen.
   1. Pipette 2 ul des Beladungspuffers in ein Reaktionsrohr PCR und aus 8 & mgr; l des PCR-Produktes. Pipettieren diese Mischung in die Vertiefungen des Gels. In 8 ul einer molekularen Größe Marker (DNA-Leiter) in einem separaten gut die Größe des PCR-Produkts zu schätzen.
   2. anwendeneine konstante Spannung bei 10 V / cm und sobald der Bromphenolblau-Marker über die Elektrophorese stoppen ¾ der Gesamtlänge des Gels erreicht hat. Visualisieren Sie die getrennten PCR-Fragmente unter Verwendung eines UV-Transilluminator (Wellenlänge 302 nm) und dokumentieren sie ein Gel-Dokumentationssystem verwendet wird. Schätzen Sie die DNA-Menge durch einen visuellen Vergleich mit der DNA-Leiter. Verwenden Sie ca. 10 ng als Ziel für die Kennzeichnung PCR.

4. Sanger-Sequenzierung

1. Cycle Sequencing PCR
   HINWEIS: Führen Sie die PCR - Markierung in einer 10 ul Reaktion eines kommerziellen Kits (Werkstoff - Tabelle) verwendet wird .
   1. In 2 ul 5x Reaktion Mastermix, 2 ul der DNA-Präparation wurden 1,5 ul TPU1 oder RTU4 Arbeitslösung (10 pmol / ul) und 4,5 ul DNAse und RNAse freies Wasser.
   2. Setzen Sie diese Sequenzierungsreaktionsmischung in einem Thermocycler und führen Sie eine weitere PCR. Insgesamt bestehend Prozess 25 Zyklen eines Denaturierungsschritt (96 ° C,10 sec), einem Glühschritt (45-60 ° C, 5 sek) und einen Verlängerungsschritt (60 ° C, 2 min). Schließlich Abkühlen der Reaktion auf 4 ° C.
2. Reinigung der Sequenzierungsreaktion
   1. Reinige die Markierungsreaktion Mix mit kommerziellen Spin - Säulen für die PCR - Reinigung (Werkstoff - Tabelle).
   2. Last 10 ul der Sequenzierungsreaktion auf die vorge hydratisierte Gel-Filtrationsmatrix und führen einen Zentrifugationsschritt bei 750 × g für 3 min.
      Hinweis: Durch die Verwendung dieses Verfahrens nicht eingetragene Farbstoffterminatoren in der Gelmatrix zurückgehalten werden.
   3. Dann trocknen die wässrige Eluat in einem Vakuum-Konzentrator. Zentrifuge bei 2.500 xg für 20 bis 30 min bei 40 ° C zur Vervollständigung Trockenheit.
   4. Zugabe von 10 & mgr; l stark entionisierte Formamid dann 2 min bei 90 ° C denaturieren und die Mischung auf Eis kühlen. Je 10 ul der denaturierten Proben auf einer 96-Well-Platte ul. Das getrocknete und gereinigte PCR-Produkt bei -20 ° C, wenn die Analysewerden zu einem späteren Zeitpunkt durchgeführt.
3. 16S-rRNA-Gen-Sequenzierung und Analyse der DNA-Sequenz
   ANMERKUNG: Führen Sie Analysesequenz auf einem automatischen Sequenzer (Werkstoff - Tabelle). Der Sequenzer hier ist ein automatisiertes Fluoreszenz-basierten Kapillar - Elektrophorese - System , das gleichzeitig vier Proben analysiert (50 cm 4-Kapillar - Array) mit einem flüssigen Polymer ⁶⁷ (Abbildung 1c).
   1. Legen Sie die Mikrotiterplatte im Sequenzer. Schreibe eine Probenblatt (Plattensatz) wie in ² gelegt, speichern und starten Sie die Sequenzierung run / Analyse im Anschluss an die angegebenen Schritte in ^1.
      HINWEIS: Die Dauer einer Sequenz Lauf ist 2 Stunden und liefert Daten von 800 bis 1.000 bp.
   2. Öffnen Sie die Sequenzanalyse - Software (Werkstoff - Tabelle). Die Sequenzdaten werden als Textdatei (.seq) und eine Datei mit dem Elektropherogramm einschließlich Qualitätswerte (QV) (.ab1) gegeben.
      HINWEIS: Basistelefonie ist automatisch perdurch die Sequenzanalyse - Software gebildet und die darunter liegende Elektropherogramm wird visuell überprüft (beispielsweise die Peakhöhe, Peaktrennung) vor der Sequenz wird für weitere Anwendungen eingesetzt.
   3. Vergleichen Sie die gespeicherten DNA-Sequenz-Datei in der NCBI-nr Datenbank mit BLAST-Algorithmus (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide).

5. MALDI-TOF MS

HINWEIS: Das Massenspektrometer verwendet eine 337 nm N & _sub2 ; -Laser und wird durch eine spezifische Steuerungssoftware (Materials Table) betrieben. Spektren werden im linearen Modus und einen Massenbereich zwischen 2.000 bis 20.000 aufgezeichnet Da bedeckt ist. Dateninterpretation und Zuteilung von Noten zu den Proben wird in Echtzeit durch eine Analyse - Software (Materials Table) (1d) durchgeführt.

1. Herstellung von Bakterien für MALDI-TOF-MS-Analyse
   1. Wachsen die Bakterien von Interesse (zB Myroides odoratimimus) auf dem Columbia Blutagar mit 5% Pferdeblut bei 37 ° C für 18 bis 24 h, je nach Bakterienstamm (Abbildung 2a). Führen Gram-Färbung der Morphotyp des Organismus unter Untersuchung sowie Reinheit der Kultur zu überprüfen.
   2. Verwenden Sie einen Zahnstocher für eine einzelne Bakterienkolonie zu einer Vertiefung einer 96-Well - Stahl Ziel übertragen (Abbildung 2b und 2c). Spot 1 ul 70% iger Ameisensäure auf der Oberseite der Luft getrocknet Organismus auf dem Stahl Ziel und nach etwa 2-3 min trocknen.
   3. Dann überlagert die Stelle mit 1 & mgr; l Matrix - Lösung, enthaltend 50 mg / ml CHCA (α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure) in einem organischen Lösungsmittel (50% Acetonitril, 2,5% Trifluoressigsäure, 47,5% H ₂ O).
      HINWEIS: Die Säure-Overlay-Verfahren (auf Plattenherstellungsverfahren) kann die Qualität der Massenspektren zu verbessern verwendet werden. Es hat sich für Gram-positive Bakterien, wie eine "Säureangriff" erhöht sich die Punktzahl va gezeigtLues der gemessenen Spektren ^45.
      HINWEIS: Alternativ kann ein automatisiertes Probenvorbereitungssystem (Materials Table) kann in dem kontaktlos spots von 1 & mgr; l 70% -iger Ameisensäure - Lösung und nach einem ersten Trocknungszyklus, 1 ul Matrixlösung auf dem Bakterien smear angewendet werden. Die Proben werden dann unter standardisierten Bedingungen bei 60% relativer Luftfeuchtigkeit getrocknet und sind bereit für die Analyse zu verwenden.
   4. Lassen Sie den Abstrich mit Matrix der Luft trocknen wieder für ca. 5 min in einer Haube überlagert. Diese bakterielle Abstrich mit der Matrix aufgebracht ist jetzt stabil für viele Stunden.
      HINWEIS: Bakterielle schmiert ohne Matrix nicht stabil sein kann aufgrund von Proteinabbau.
2. Die Durchführung der MALDI-TOF-MS-Analyse
   1. Einführung von Proben
      1. Öffnen Sie die Steuerungssoftware unserer MMIS (Werkstoff - Tabelle).
      2. Belüften der Probenladeöffnung des Massenspektrometers durch Drücken der IN / OUT-Taste des Gerätes.
      3. Öffnen Sie die Ladeöffnung nach einem Klick und legen Sie die MALDI-TOF-MS-Zielplatte mit dem getrockneten bakteriellen Abstrich und Matrix.
      4. Schließen Sie den Hafen und evakuieren wieder. Beachten Sie Vakuum und bei Erreichen des 4,5 x 10 ^-6 mbar Messung starten.
   2. Probenanalyse
      1. Öffnen Sie die Analysesoftware unserer MMIS (Werkstoff - Tabelle) und klicken Sie auf das Menü "Datei". Wählen Sie "Neu-Klassifizierung" und ein neues Fenster "MALDI Biotyper Klassifikation Assistent Echtzeit" wird geöffnet. Geben Sie den Namen des Projekts, zum Beispiel "Myroides Messung project_1, im Bereich" Projektname "und drücken Sie die Schaltfläche" Neu ". Unter dem neuen Dialogfeld mit dem Namen" Neues Projekt "Check Projektnamen und gehen Sie durch Drücken der Taste" OK ".
      2. In der "MALDI Biotyper-Klassifikation Assistent Echtzeit" beachten Sie die "Analyte Platzierung" Fenster geöffnet. Wählen Sie Zielpositionen (zB A1, A2, A3 ...) mit der rechten click jede gewählte Position (mit einem blauen Quadrat gekennzeichnet) und wählen Sie "Proben". In der automatisch geöffnet Tabellenansicht Art der Probenname, Proben-ID und optional einen Kommentar. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Weiter", um fortzufahren.
      3. In der "MALDI Biotyper-Klassifikation Assistent Echtzeit" beachten Sie die "Auswahl der MALDI Biotyper-Methoden" Fenster zu öffnen. Wählen Sie "Bruker Taxonomy" von "MSPs von Taxonomie Bäume" und klicken Sie auf "Weiter", um fortzufahren.
      4. In der "MALDI Biotyper-Klassifikation Assistent Echtzeit" beachten Sie die "Projektübersicht" Fenster zu öffnen. Überprüfen Sie die Einträge eingefügt oben für die eigentliche Klassifizierung Projekt. Starten Sie die Klassifizierung laufen durch Drücken der Taste "Finish" (2d - f). Die Messung wird automatisch gestartet, wenn das entsprechende Vakuum erreicht ist.
      5. Folgen Sie der Klassifizierung laufen, bis die Messung erfolgreich abgeschlossen. Sehen Sie sich die Ergebnistabelle in ter "MALDI Biotyper Realtime Klassifizierung Projekt Myroides Messung project_1" öffnen Sie das Menü "Ansicht" und klicken Sie auf "Ergebnisse".
      6. Sehen Sie sich die "Bruker Daltonics MALDI Biotyper Klassifikation Ergebnisse" als HTML-Datei im Standard-Web-Browser. Drucken und die Ergebnisse speichern.
   3. Messen Sie einen Teststandard täglich vor Analyse zu probieren das Gerät zu kalibrieren und Gerätevalidierung wöchentlich durchführen (Geräteselbsttest).
      HINWEIS: Bei der Messung MALDI-TOF - Spektren werden in Echtzeit durch die Analysesoftware (Materials Table) analysiert. Eine Liste von zehn Arten mit ihren jeweiligen Noten gegeben und wird in das Laborinformationssystem (LIS) für die Berichterstattung eingespeist.
   4. Kritisch zu bewerten die MALDI-TOF MS-Ergebnisse (siehe repräsentative Ergebnisse) und gegebenenfalls auch andere Tests, wie biochemical- und Antibiotikaempfindlichkeitsprofile oder 16S-rRNA-Gen-Sequenzierung und, falls erforderlich, Gram-Färbung füreiner Bakterienart auf die mikrobiologische Bericht zuordnen.

Ergebnisse

MALDI-TOF-MS ist eine neue, schnelle und kostengünstige Methode für die mikrobiologische Routinediagnostik. Bakterielle Artbestimmung durch MALDI-TOF - MS - Spektren produziert hauptsächlich aus ribosomalen Proteinen zusammengesetzt , sondern auch andere "sehr konservierten Proteinen mit Housekeeping Funktionen beeinträchtigt in geringem Umfang durch die Umgebungsbedingungen" ¹⁷ .Die Datenbank dieser MMIS enthält eine große Menge von Referenzspektren und sogar ...

Diskussion

Sowohl MALDI-TOF MS und 16S-rRNA-Gen-Sequenzierung bieten die Möglichkeit, eine große Anzahl von verschiedenen Bakterien zu identifizieren. MALDI-TOF-MS ist eine schnelle und kostengünstige Methode, die leicht zu handhaben und große Datenbanken von bakteriellen Massenspektren zur Verfügung. Aus diesem Grund ist MALDI-TOF MS eine schnelle, kostengünstige und zuverlässige Methode zum Screening Studien konzentrierten sich auf seltene bakterielle Pathogene ^17,20,39,51 zuführen. In einer prospektiven Studi...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
CHROMASOLV, HPLC grade water, 1 L	Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany	270733
Tissue Lyser LT	Qiagen, Hilden, Germany	85600	Oscillating Homogenizer
Glass-beads 1,0mm	VWR International, Darmstadt, Germany	412-2917
Thermomixer 5436	Eppendorf, Hamburg, Germany	2050-100-05
QIAamp DNA Mini Kit (250)	Qiagen, Hilden, Germany	51306
Taq PCR Core Kit (1000 U)	Qiagen, Hilden, Germany	201225
Forward Primer TPU1 (5´-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’)	biomers.net GmbH, Ulm, Germany	-
Reverse Primer RTU4 (5´-TAC CAG GGT ATC TAA TCC TGT T-3´)	biomers.net GmbH, Ulm, Germany	-
Mastercycler	Eppendorf, Hamburg, Germany	-	Thermocylcer
Reaction tube 1.5 mL	SARSTEDT, Nümbrecht, Germany	72,692
Reaction tube 2 mL	SARSTEDT, Nümbrecht, Germany	72,693,005
PCR 8er-CapStrips	Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany	711040X
PCR 8er-SoftStrips	Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany	711030X
Sharp R-ZV11	Sharp Electronics, Hamburg, Germany	-	Microwave
Titriplex III (EDTA Na2-salt dehydrate; 1 kg)	Merck, Darmstadt, Germany	1084211000
SeaKem LE Agarose	Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany	849006
(2 x 500 g)
SmartLadder SF - 100 to 1000 bp	Eurogentec, Lüttich, Belgium	MW-1800-04
Bromphenol blue (25 g)	Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany	B0126
Xylene cyanol FF (10 g)	Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany	X4126
ComPhor L Maxi	Biozym, Hessisch Oldendorf, Germany	-
Ethidium bromide solution 1 %(10 mL)	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	2218.1
Gel Doc 2000	Bio-Rad Laboratories, München, Germany	-	Gel-documentation system
ExoSAP-IT (500 reactions)	Affymetrix UK, Wooburn Green, High Wycombe, United Kingdom	78201
Buffer (10 x) with EDTA	Life Technologies, Darmstadt, Germany	402824
BigDye Terminator Kit v1.1	Life Technologies, Darmstadt, Germany	4337450
Hi-Di formamide (25 mL)	Life Technologies, Darmstadt, Germany	4311320
DyeEx 2.0 Spin Kit (250)	Qiagen, Hilden, Germany	63206
3130 Genetic Analyzer	Life Technologies, Darmstadt, Germany	-	Sequenzer
MicroAmp optical 96-well reaction plate with barcode	Life Technologies, Darmstadt, Germany	4306737
3130 Genetic Analyzer, plate base 96-well	Life Technologies, Darmstadt, Germany	4317237
3130 Genetic Analyzer, plate retainer 96-well	Life Technologies, Darmstadt, Germany	4317241
3130 Genetic Analyzer, well plate septa	Life Technologies, Darmstadt, Germany	4315933
3130 Genetic Analyzer, POP-7 Polymer, 7 mL	Life Technologies, Darmstadt, Germany	4352759
3130 Genetic Analyzer, 4-Capillary Array, 50 cm	Life Technologies, Darmstadt, Germany	4333466
Sequencing Analysis Software 5.4	Life Technologies, Darmstadt, Germany	-
microflex (the MALDI TOF MS maschine)	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	-
MALDI Biotyper (the MALDI TOF MS system)	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	-	our mMIS
VITEK MS	bioMérieux, Nürtingen, Germany		2nd mMis
flexControl 3.4 (control software)	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	-
Biotyper Realtime Classification 3.1 (RTC), (analysis software)	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	-
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, HCCA, 1 g	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	201344
Peptide Calibration Standard II	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	222570
MSP 96 target polished steel	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	8224989
peqgreen	peqlab	37-5010
MALDI Biotyper Galaxy	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	Part No. 1836007
Vitek 2	bioMérieux, Nürtingen, Germany		our aMis
MicroScan	Beckman Coulter		2nd aMis
BD Phoenix™ Automated Microbiology System	BD		3rd aMis
Staphylococcus aureus subsp. aureus Rosenbach (ATCC® 25923™)	ATCC		postive control for PCR