Identificazione di batteri patogeni rari da 16S rRNA sequenziamento del gene e MALDI-TOF MS

Riepilogo

Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) and molecular techniques (16S rRNA gene sequencing) permit the identification of rare bacterial pathogens in routine diagnostics. The goal of this protocol lies in the combination of both techniques which leads to more accurate and reliable data.

Abstract

Ci sono un certo numero di batteri patogeni rare e, quindi, non sufficientemente descritto che sono riportati per causare infezioni gravi specialmente nei pazienti immunocompromessi. Nella maggior parte dei casi solo pochi dati, per lo più pubblicati come case report, sono disponibili che indagare il ruolo di tali agenti patogeni come un agente infettivo. Pertanto, al fine di chiarire il carattere patogeno di tali microrganismi, è necessario condurre studi epidemiologici che comprendono un gran numero di questi batteri. I metodi utilizzati in uno studio tale sorveglianza devono soddisfare i seguenti criteri: l'identificazione dei ceppi deve essere accurata secondo la nomenclatura valida, dovrebbero essere facili da maneggiare (robustezza), economico nella diagnostica di routine e devono generare comparabili risultati tra i diversi laboratori. In generale, ci sono tre strategie per l'identificazione di ceppi batterici in un ambiente di routine: 1) Identificazione fenotipica che caratterizza la BioChemicaL e metaboliche proprietà dei batteri, 2) tecniche di biologia molecolare, come 16S rRNA sequenziamento del gene e 3) spettrometria di massa come un approccio basato romanzo proteoma. Poiché spettrometria di massa e approcci molecolari sono gli strumenti più promettenti per identificare una grande varietà di specie batteriche, sono descritti questi due metodi. I progressi, limitazioni e potenziali problemi quando si utilizzano queste tecniche sono discusse.

Introduzione

l'identificazione sicura dei patogeni rari nella diagnostica di routine è ostacolata dal fatto che i metodi culturali e biochimici classici sono ingombranti e talvolta discutibili. Inoltre, un laboratorio di microbiologia diagnostica deve elaborare un gran numero di agenti patogeni, che vanno da poche centinaia a diverse migliaia, giornaliero, che richiede l'uso di sistemi automatizzati. Oltre alla gestione di una elevata produttività giornaliera, è necessaria la precisa identificazione di specie batteriche. Questo è giustificato dal momento che si differenziano per il loro modello di sensibilità agli antibiotici e, pertanto, la corretta identificazione fornisce al clinico informazioni essenziali per scegliere antibiotici appropriati (per esempio, Enterococcus spp., Acinetobacter spp.) ^12,43.

sistemi di identificazione microbici automatizzati (AMIS) si applicano insiemi standard di reazioni enzimatiche per caratterizzare le proprietà metaboliche di isolati batterici ^{13,15,16,26,27. Sebbene le cartucce utilizzate in questi sistemi utilizzano un gran numero di diverse reazioni biochimiche, ad esempio, 47 nella scheda GN del AMIS utilizzato in questo studio 52, questo permette strategia identificazione sicura solo per un numero limitato di batteri. Inoltre, la banca dati, un sistema esperto avanzata, è chiaramente focalizzata sulla rilevazione di batteri pertinenti e altamente rilevanti di importanza medica 13,15,16,36. Due ulteriori sistemi, ampiamente utilizzati nei laboratori, si applicano anche questo approccio biochimico per l'identificazione batterica. Recenti studi dimostrano una precisione di identificazione comparabili tra Amis utilizzati in questo studio e uno dei concorrenti (93,7% e 93,0%, rispettivamente), mentre il 3 ° AMIS ha una precisione di identificazione del solo 82,4% sulle specie di livello 35. Tali discrepanze possono essere spiegate dalla qualità dei riferimenti ai dati di identificazione sottostanti, le versioni di kit e software, differenze di metaboLISM e la competenza del personale tecnico 35,36.}

Due sistemi MALDI-TOF MS automatizzati (sistema di identificazione microbica MALDI-TOF, MMI) sono usati principalmente. Questi sistemi consentono il rilevamento di un gran numero di specie batteriche sulla base della loro proteina spettri di massa di impronte digitali. Ad esempio, il database delle MMIS utilizzati contiene 6.000 spettri di riferimento. Sistemi di identificazione basati sulla spettrometria di massa offrono il rilevamento veloce e affidabile di una grande varietà di microrganismi patogeni tra cui rari ^11,48,51. Fino ad oggi solo pochi confronti diretti sono disponibili tra i MMI utilizzati in questo studio e il suo concorrente ^19,33. Secondo dæk et al. Entrambi i sistemi forniscono un alto tasso di accuratezza analoga identificazione, ma le MMI utilizzati in questo studio sembra essere più affidabile nell'identificazione delle specie ^19.

Allo stesso modo, le tecniche molecolari indirizzamento ben conservato, ma anche geni distinti ( ad esempio, 16S rDNA o rpoB) permettono una chiara identificazione delle specie ^3,22,61. Tra questi, il 16S rDNA è il gene housekeeping più utilizzato per la sua presenza in tutti i batteri ^34. La sua funzione rimane invariato e, infine, con circa 1500 bp, è abbastanza lungo per essere adatto per bioinformatica ^14,34. Molti ricercatori considerano l'analisi del gene 16S rRNA come il "gold standard" per l'identificazione batterica ^21. Ciò è dovuto al fatto che alcuni laboratori utilizzano tecniche di ibridazione DNA-DNA alla data di identificazione di rare o nuovi batteri ^14,34. Inoltre, sempre più banche dati sono disponibili che possono essere utilizzati per 16S rRNA analisi del gene ^50. Tuttavia, si deve tenere conto che i sistemi di rilevamento basati 16S rDNA hanno una sensibilità limitata rispetto ai protocolli PCR standard. Inoltre, l'approccio molecolare è sofisticato, tempo e richiede personale altamente qualificato estrutture di laboratorio dedicate e, quindi, non facilmente implementato in diagnostica di routine ^55. Inoltre, è stato dimostrato che la combinazione di almeno due diversi metodi di identificazione batterica conduce ad altamente accurata identificazione del ceppo. La combinazione di MALDI-TOF MS e sequenziamento del 16S rDNA consente l'identificazione di un gran numero di differenti specie batteriche con elevata precisione. Recentemente la combinazione di analisi del gene MALDI-TOF MS e 16S rRNA è stata presentata per l'identificazione batterica studiare domande epidemiologici e agenti patogeni rari ^56.

Protocollo

1. Estrazione del DNA batterico

1. Preparazione della Soluzione PBS
   1. Pesare 1,65 g di Na ₂ HPO ₄ x 2H ₂ O, 0,22 g di NaH ₂ PO ₄ x 2H ₂ O e 8,80 g di NaCl in un pallone e riempire con acqua distillata fino ad un volume finale di 1000 ml. Regolare il pH a 7,4. Per l'uso finale filtrare la soluzione attraverso un batterio a prova (0,22 micron) Filtro.
2. I batteri DNA Estrazione di Gram-negativi
   1. Streak il materiale del paziente su terreni di coltura appropriato (ad esempio, Columbia agar sangue), identificare ed isolare potenziali patogeni.
   2. Preparare coltura pura ed eseguire Gram-colorazione per determinare somatipo e per confermare la purezza e della cultura ^49.
   3. Scegli una singola colonia batterica e trasferirlo con un uso singolo ciclo inoculo 1 ml in una provetta 2,0 ml reazione sterile che contiene 1 ml di soluzione PBS.
   4. Incubare questa sospensione in un Bimbyer a 95 ° C per 10 min. Dopo l'incubazione, lasciare che l'estratto batterico (contenente il DNA disciolto) raffreddare a temperatura ambiente e utilizzare direttamente per l'amplificazione o conservare a -20 ° C per un ulteriore uso (Figura 1a).
3. I batteri DNA Estrazione di Gram-positivi
   1. Streak il materiale del paziente su terreni di coltura appropriato (ad esempio, Columbia agar sangue), identificare ed isolare potenziali patogeni. Eseguire Gram-colorazione per confermare somatipo della cultura.
   2. Preparare coltura pura ed eseguire Gram-colorazione per determinare somatipo e per confermare la purezza della cultura.
   3. Scegli una singola colonia batterica con una sterile 1 ml ciclo inoculazione e sospenderlo in 500 l di PBS soluzione in un tubo di 2,0 ml di reazione.
   4. Aggiungere 500 microlitri di vetro perline e trasferire il tubo ad un omogeneizzatore oscillante, azionato alla massima frequenza e ampiezza (50 Hz), per 5 min. Utilizzare vetro perle del diametro di 1,0 millimetriperturbare le pareti cellulari batteriche.
   5. Incubare la provetta per 10 min a 95 ° C e raffreddare a temperatura ambiente. Utilizzare l'estratto direttamente per la reazione PCR o conservare a -20 ° C per un ulteriore uso.

2. 16S rDNA PCR

1. Preparazione di primer di amplificazione
   1. Utilizzare il TPU1 primer (5'-AGA GTT TGA MTC TGG CTC AG-3 '[M = A / C]) come fondo in avanti e RTU4 (5'-TAC CAG GGT ATC TAA TCC TGT T-3') come primer reverse ^25. Preparare una soluzione di primer magazzino con DNAsi e acqua libera RNAsi, avente una concentrazione di 100 pmol / ml (100 mM) e diluire ulteriormente ad una soluzione di lavoro a 10 pmol / ml. Conservare il magazzino primer e soluzione di lavoro a -20 ° C o utilizzare direttamente.
2. Preparazione della miscela di reazione PCR
   1. Pipettare 1 ml di ciascun primer, 1 ml dNTP-mix (100 mm), 2,5 ml di estratto di DNA, 5 ml 10x PCR tampone (contenente 25 mM MgCl _2), 0,25 ml Taq-polimerasi (5 unità / ml) e 39.25 ml DNAse- e RNasi acqua libera PCR in un tubo da 200 ml reazione sterile.
3. protocollo di PCR
   1. Avviare il programma PCR costruito come segue: In primo luogo, una fase di incubazione iniziale a 95 ° C per 5 min, che è necessaria per attivare la Taq-polimerasi. In secondo luogo, 35 cicli di amplificazione, contenente 1 min. fase di denaturazione a 95 ° C, a 1 min. step Primer annealing a 50 ° C, ed una fase di primer extension 1,5 min a 72 ° C. Terzo, una estensione finale per 10 minuti a 72 ° C. Infine, la reazione PCR viene raffreddata a 4 ° C.
      NOTA: Staphylococcus aureus e H ₂ O servire come controllo positivo e negativo (Figura 1b).
   2. Collocare la provetta contenente la miscela di reazione PCR nel termociclatore e avviare il programma.
4. Purificazione del prodotto PCR
   NOTA: Al fine di purificare il prodotto di PCR, diversi protocolli siapossono essere utilizzati enzimi base o con una matrice di adsorbimento silice. Il single-step PCR pulizia usato qui utilizza due reazioni enzimatiche idrolitici. Mentre esonucleasi I (Exo I) rimuove DNA a singolo filamento, fosfatasi alcalina gamberetti (SAP) idrolizza dNTP prive di personalità giuridica. La seconda procedura è basata su una tecnica di adsorbimento membrana di silice con un sale alta veloce vincolante - lavare - sale basso ciclo di eluizione.
   1. Aggiungere 1,5 ml di una miscela enzimatica contenente sia Exo I e SAP a 25 microlitri prodotto di PCR, mescolare bene e versare in un termociclatore applicando un semplice protocollo di primi 15 min a 37 ° C seguito da 15 minuti a 80 ° C. Conservare il prodotto di PCR purificato sia a -20 ° C o utilizzarlo direttamente come bersaglio per l'etichettatura di PCR.

3. DNA Gel di Agarosio

1. Preparazione del Tampone per elettroforesi (TBE-buffer)
   1. Titolare 54,0 g (445 mM) di base TRIS, 27,5 g (445 mM) di acido borico e 20 ml di una M EDTA 0,5 (10mM) soluzione a pH 8,0 con NaOH in un pallone e riempire con acqua distillata fino ad un volume totale di 1000 ml. Poi diluire questo buffer 5x 1:10 con acqua distillata (0,5x TBE) per elettroforesi.
2. Preparazione del tampone di caricamento
   1. Mescolare 250 mg bromofenolo blu, 250 mg xilene cianolo FF e 15 g di polysucrose (Materials Table) in un pallone. Poi riempire con tampone 0,5x TBE per un volume totale di 100 ml. Aliquota il colorante di carico di 1 ml porzioni e conservare a -20 ° C per un ulteriore utilizzo.
3. Casting del gel
   1. Pesare 6 g elettroforesi standard di agarosio a 300 ml di tampone 0,5x TBE (vedi paragrafo 3.1.1) in un pallone, per preparare un 2% (w / v) gel. Poi mettere il composto agarosio in un forno a microonde, riscaldare punto quasi di ebollizione fino a quando l'agarosio è completamente sciolto e la soluzione appare chiara.
   2. Lasciate che i agarosio fuso raffreddare sufficientemente e aggiungere 10 ml di un 1% (w / v) bromuro di etidio magazzino Soluzione. Versare la soluzione in uno stampo e posizionare un pettine gel (consentendo 30 pozzi) nel cast. Rimuovere il pettine quando il gel è completamente solidificato e mettere il gel nella camera di elettroforesi contenente tampone TBE 0.5x.
      NOTA: il bromuro di etidio è tossico e mutageno. Pertanto, deve essere maneggiato con cautela. Si consiglia di usare guanti di nitrile. Ci sono macchie acidi nucleici intercalante alternativi che possono essere utilizzati come alternativa non tossica.
4. Gel di Agarosio dei prodotti di PCR
   NOTA: Al fine di verificare la dimensione corretta degli amplificati PCR e di stimare la concentrazione di DNA prodotto di PCR purificato viene separato su gel di agarosio.
   1. Pipettare 2 ml di tampone di caricamento in un tubo di reazione PCR e aggiungere 8 ml di prodotto di PCR. Pipettare questo mix nei pozzetti del gel. Aggiungere 8 ml di un marcatore di formato peso molecolare (ladder DNA) in un pozzo separato per stimare la dimensione del prodotto PCR.
   2. Applicareuna tensione costante a 10 V / cm e fermare l'elettroforesi appena il bromofenolo indicatore blu ha raggiunto circa ¾ della lunghezza totale del gel. Visualizzare i frammenti di PCR separazione tramite un UV-transilluminatore (lunghezza d'onda 302 nm) e documentare utilizzando un sistema di gel-documentazione. Stimare la quantità di DNA da confronto visivo con la scala del DNA. Utilizzare circa 10 ng come bersaglio per l'etichettatura PCR.

4. Il sequenziamento Sanger

1. Cycle Sequencing PCR
   NOTA: eseguire l'etichettatura PCR in una reazione 10 microlitri utilizzando un kit commerciale (Materials Table).
   1. Aggiungere 2 ml di Mastermix reazione 5x, 2 ml di preparazione del DNA, 1,5 ml di soluzione di TPU1 o RTU4 di lavoro (10 pmol / ml) e 4,5 ml di DNAsi e acqua libera RNAsi.
   2. Metti questa miscela di reazione di sequenziamento in un termociclatore ed eseguire un altro PCR. In totale, 25 cicli di processo costituito da una fase di denaturazione (96 ° C,10 sec), una fase di ricottura (45-60 ° C, 5 sec) ed una fase di estensione (60 ° C, 2 min). Infine, raffreddare la reazione a 4 ° C.
2. Purificazione della reazione di sequenziamento
   1. Purificare il mix di reazione di marcatura utilizzando le colonne di spin commerciali per la PCR purificazione (Materials Table).
   2. Carico 10 ml di reazione di sequenziamento sulla matrice di gel-filtrazione pre-idratata ed eseguire una fase di centrifugazione a 750 xg per 3 min.
      NOTA: l'uso di questa procedura terminatori coloranti non incorporate vengono mantenuti nella matrice gel.
   3. Poi asciugare l'eluato acquosa in un concentratore a vuoto. Centrifugare a 2500 xg per 20 a 30 min a 40 ° C per completare secchezza.
   4. Aggiungere 10 ml di formammide altamente deionizzata poi denaturare a 90 ° C per 2 minuti e raffreddare la miscela in ghiaccio. Pipettare 10 ml di campioni denaturati su un piatto ben 96 ml. Conservare il prodotto PCR essiccati e puliti a -20 ° C se l'analisi èessere effettuata in un momento successivo.
3. 16S rRNA sequenziamento del gene e l'analisi della sequenza DNA
   NOTA: eseguire analisi di sequenza su un sequenziatore automatico (Materials Table). Il sequencer qui utilizzato è un sistema di elettroforesi capillare basato sulla fluorescenza automatizzato che analizza 4 campioni contemporaneamente (matrice 50 cm 4-capillare) con un liquido polimerico ⁶⁷ (figura 1c).
   1. Posizionare la micropiastra nel sequencer. Scrivi un foglio campione (record di targa) come stabilito nella ^2, salvare e avviare la sequenza di esecuzione / analisi seguendo la procedura di cui al ^1.
      NOTA: Durata di una corsa sequenza è 2 ore e fornisce dati da 800 a 1000 bp.
   2. Aprire il software di analisi di sequenziamento (Materials Table). dati della sequenza sono dati come file di testo (.seq) e un file contenente l'elettroferogramma inclusi i valori di qualità (QV) (.ab1).
      NOTA: la chiamata di base è automaticamente performata dal software di analisi di sequenziamento e l'elettroferogramma sottostante viene controllato visivamente (ad esempio, l'altezza del picco, separazione dei picchi) prima che la sequenza è utilizzato per ulteriori applicazioni.
   3. Confrontare il file di sequenza del DNA memorizzato l'algoritmo BLAST NCBI database di nr usando (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide).

5. MALDI-TOF MS

NOTA: Lo spettrometro di massa utilizza 337 nm N ₂ laser ed è gestito da uno specifico software di controllo (materiali Tabella). Gli spettri sono registrati in modalità lineare e una serie di massa tra 2.000 a 20.000 Da è coperto. Interpretazione dei dati e l'assegnazione dei punteggi ai campioni viene effettuata in tempo reale da un software di analisi (Materials Table) (Figura 1d).

1. Preparazione di batteri per MALDI-TOF MS Analysis
   1. Crescere i batteri di interesse (ad esempio, Myroides odoratimimus) sul Columbia agar sangue contenente sangue di cavallo 5% a 37 ° C per 18 a 24 ore, a seconda del ceppo batterico (Figura 2a). Eseguire Gram-colorazione per verificare la morfotipo dell'organismo in esame e la purezza della cultura.
   2. Usare uno stuzzicadenti di legno per il trasferimento di una singola colonia batterica ad un pozzo di un obiettivo di acciaio a 96 pozzetti (Figura 2b e 2c). Spot 1 ml di acido formico al 70% sulla parte superiore dell'organismo secca dell'aria sul bersaglio in acciaio e lasciare asciugare per circa 2-3 minuti.
   3. Poi, sovrapporre la macchia con soluzione di matrice 1 ml, contenente 50 mg / ml CHCA (α-ciano-4-idrossicinnamico acid) in un solvente organico (50% acetonitrile, acido trifluoroacetico 2,5%, 47,5% H ₂ O).
      NOTA: Il metodo overlay acido (sul metodo di preparazione plate) può essere utilizzata per migliorare la qualità degli spettri di massa. E 'stato dimostrato che per i batteri Gram-positivi, un "attacco acido" aumenta il punteggio values degli spettri misurati ^45.
      NOTA: in alternativa un sistema di preparazione automatizzata dei campioni (Materials Table) può essere usato in cui i punti di contatto libero di 1 ml 70% soluzione di acido formico e, dopo un primo ciclo di asciugatura, soluzione matrice 1 ml, sono applicati in striscio batterico. I campioni vengono poi essiccati in condizioni standardizzate al 60% di umidità relativa e sono pronti per l'uso per l'analisi.
   4. Lasciare lo striscio con una matrice sovrapposti asciugare ancora per circa 5 minuti in una cappa. Questo striscio batterico con la matrice applicata è ora stabile per molte ore.
      NOTA: sbavature batteriche senza matrice potrebbe non essere stabile a causa di degradazione delle proteine.
2. Esecuzione della MALDI-TOF MS Analysis
   1. Introduzione dei campioni
      1. Aprire il software di controllo dei nostri MMIS (Materiali tabella).
      2. Aerare il porto caricamento del campione dello spettrometro di massa premendo il tasto IN / OUT dello strumento.
      3. Aprire la porta di carico dopo un clic e inserire la piastra segnale MALDI-TOF MS con lo striscio batterico secca, più di matrice.
      4. Chiudere la porta ed evacuare di nuovo. Osservare vuoto e quando raggiunge 4,5 x 10 ^-6 mbar avviare la misurazione.
   2. Analisi dei campioni
      1. Aprire il software di analisi dei nostri MMIS (Materiali tavolo) e fare clic sul menu "File". Selezionare "nuova classificazione" e un nuovo "wizard di classificazione in tempo reale MALDI biotyper" finestra si apre. Digitare il nome del progetto, ad esempio "Progetto_1 misura Myroides, nel campo" Nome del progetto "e premere il pulsante" Nuovo ". Sotto la nuova finestra di dialogo denominata" Nuovo progetto "nome del progetto di controllo e procedere premendo il tasto" OK ".
      2. Nella "mago di classificazione in tempo reale MALDI biotyper" osservare la finestra "posizionamento Analita" aperto. Selezionare le posizioni di destinazione (ad esempio, A1, A2, A3 ...), fare click qualsiasi posizione selezionata (indicata da un quadrato blu) e selezionare "Aggiungi campioni". Nella tabella visualizzazione tipo aperto automaticamente nome del campione, ID campione e opzionalmente un commento. Fare clic sul pulsante "Avanti" per procedere.
      3. Nella "mago di classificazione in tempo reale MALDI biotyper" osservare la finestra "Selezione di MALDI metodi biotyper" aperto. Selezionare "Bruker Tassonomia" da "MSP da alberi tassonomia" e fare clic su "Avanti" per continuare.
      4. Nella "mago di classificazione in tempo reale MALDI biotyper" osservare la finestra "Sintesi del progetto" aperto. Controllare le voci inserite sopra indicate per il progetto di classificazione attuale. Avviare la classificazione eseguire premendo il pulsante "Fine" (Figura 2d - f). Misurazione avvia automaticamente quando viene raggiunto il vuoto appropriata.
      5. Seguire il percorso di classificazione fino a quando la misura è completata con successo. Visualizzare la tabella dei risultati in tegli "MALDI Biotyper tempo reale classificazione dei progetti Myroides misura Progetto_1" aprire il menu "Visualizza" e fare clic su "Risultati".
      6. Visualizzare l'argomento "Bruker Daltonics MALDI Biotyper classificazione Risultati" come file HTML nel browser Web predefinito. Stampare e salvare i risultati.
   3. Misurare uno standard di prova ogni giorno prima di campione di analisi per calibrare lo strumento ed effettuare strumento settimanale convalida (strumento di auto-test).
      NOTA: Durante la misurazione MALDI-TOF spettri sono analizzati in tempo reale dal software di analisi (materiali Tabella). Un elenco delle dieci specie con i rispettivi punteggi è dato ed è alimentato nel sistema di informazioni di laboratorio (LIS) per la segnalazione.
   4. Valutare criticamente i risultati MALDI-TOF MS (vedere i risultati rappresentativi) e, se del caso, sono gli altri test, come i profili biochemical- e antibiotici suscettibilità o 16S rRNA sequenziamento del gene e, se necessario, Gram-colorazione perl'assegnazione di una specie batterica alla relazione microbiologica.

Risultati

MALDI-TOF MS è un romanzo, metodo veloce ed economico per la diagnostica di routine microbiologici. Batterica identificazione della specie da MALDI-TOF MS produce spettri principalmente composto da proteine ​​ribosomali, ma anche altri "proteine ​​molto conservato con funzioni di house-keeping colpite in misura minima dalle condizioni ambientali" ¹⁷ banca dati .La di questa MMIS contiene un grande insieme di spettri di riferimento e anche i batteri, che rara...

Discussione

Entrambi MALDI-TOF MS e 16S rRNA gene sequenziamento offrono la possibilità di individuare un gran numero di batteri diversi. MALDI-TOF MS è un metodo veloce ed economico, che è facile da maneggiare e grandi database di spettri di massa batterica sono disponibili. Per questo motivo, MALDI-TOF MS è un metodo efficace e affidabile rapida costo per condurre studi di screening focalizzati in rare batteri patogeni ^17,20,39,51. In uno studio prospettico confrontando MALDI-TOF MS con altri metodi di identificazi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
CHROMASOLV, HPLC grade water, 1 L	Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany	270733
Tissue Lyser LT	Qiagen, Hilden, Germany	85600	Oscillating Homogenizer
Glass-beads 1,0mm	VWR International, Darmstadt, Germany	412-2917
Thermomixer 5436	Eppendorf, Hamburg, Germany	2050-100-05
QIAamp DNA Mini Kit (250)	Qiagen, Hilden, Germany	51306
Taq PCR Core Kit (1000 U)	Qiagen, Hilden, Germany	201225
Forward Primer TPU1 (5´-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’)	biomers.net GmbH, Ulm, Germany	-
Reverse Primer RTU4 (5´-TAC CAG GGT ATC TAA TCC TGT T-3´)	biomers.net GmbH, Ulm, Germany	-
Mastercycler	Eppendorf, Hamburg, Germany	-	Thermocylcer
Reaction tube 1.5 mL	SARSTEDT, Nümbrecht, Germany	72,692
Reaction tube 2 mL	SARSTEDT, Nümbrecht, Germany	72,693,005
PCR 8er-CapStrips	Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany	711040X
PCR 8er-SoftStrips	Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany	711030X
Sharp R-ZV11	Sharp Electronics, Hamburg, Germany	-	Microwave
Titriplex III (EDTA Na2-salt dehydrate; 1 kg)	Merck, Darmstadt, Germany	1084211000
SeaKem LE Agarose	Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany	849006
(2 x 500 g)
SmartLadder SF - 100 to 1000 bp	Eurogentec, Lüttich, Belgium	MW-1800-04
Bromphenol blue (25 g)	Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany	B0126
Xylene cyanol FF (10 g)	Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany	X4126
ComPhor L Maxi	Biozym, Hessisch Oldendorf, Germany	-
Ethidium bromide solution 1 %(10 mL)	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	2218.1
Gel Doc 2000	Bio-Rad Laboratories, München, Germany	-	Gel-documentation system
ExoSAP-IT (500 reactions)	Affymetrix UK, Wooburn Green, High Wycombe, United Kingdom	78201
Buffer (10 x) with EDTA	Life Technologies, Darmstadt, Germany	402824
BigDye Terminator Kit v1.1	Life Technologies, Darmstadt, Germany	4337450
Hi-Di formamide (25 mL)	Life Technologies, Darmstadt, Germany	4311320
DyeEx 2.0 Spin Kit (250)	Qiagen, Hilden, Germany	63206
3130 Genetic Analyzer	Life Technologies, Darmstadt, Germany	-	Sequenzer
MicroAmp optical 96-well reaction plate with barcode	Life Technologies, Darmstadt, Germany	4306737
3130 Genetic Analyzer, plate base 96-well	Life Technologies, Darmstadt, Germany	4317237
3130 Genetic Analyzer, plate retainer 96-well	Life Technologies, Darmstadt, Germany	4317241
3130 Genetic Analyzer, well plate septa	Life Technologies, Darmstadt, Germany	4315933
3130 Genetic Analyzer, POP-7 Polymer, 7 mL	Life Technologies, Darmstadt, Germany	4352759
3130 Genetic Analyzer, 4-Capillary Array, 50 cm	Life Technologies, Darmstadt, Germany	4333466
Sequencing Analysis Software 5.4	Life Technologies, Darmstadt, Germany	-
microflex (the MALDI TOF MS maschine)	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	-
MALDI Biotyper (the MALDI TOF MS system)	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	-	our mMIS
VITEK MS	bioMérieux, Nürtingen, Germany		2nd mMis
flexControl 3.4 (control software)	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	-
Biotyper Realtime Classification 3.1 (RTC), (analysis software)	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	-
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, HCCA, 1 g	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	201344
Peptide Calibration Standard II	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	222570
MSP 96 target polished steel	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	8224989
peqgreen	peqlab	37-5010
MALDI Biotyper Galaxy	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	Part No. 1836007
Vitek 2	bioMérieux, Nürtingen, Germany		our aMis
MicroScan	Beckman Coulter		2nd aMis
BD Phoenix™ Automated Microbiology System	BD		3rd aMis
Staphylococcus aureus subsp. aureus Rosenbach (ATCC® 25923™)	ATCC		postive control for PCR