הערכה של הפעלת תא Perigenital רגישות וערמונית תורן במודל עכבר של הפרדה אימהית עובריים

Summary

אנו מודדים הפעלת perigenital מכאנית רגישות ותורן תא בערמונית של C57BL / 6 עכברי זכרים שעברו הפרדיגמה מתח בתחילת חיים - הפרדה אימהית יילודים, על מנת לגרום למודל פרה-קליני של תסמונת ערמונית כרונית / כרוני כאבים באגן.

Abstract

ערמונית כרונית / תסמונת כאב כרונית באגן (CP / CPPS) יש שכיחות לאורך חיים של 14%, והוא אבחון האורולוגים הנפוץ ביותר עבור גברים מתחת לגיל 50, ובכל זאת היא הפרעת כאבי אגן לפחות הבינה ולמד כרונית. משנה משמעותי של חולים עם כאבי אגן כרוני דו"ח שחווה מתח מוקדם חיים או התעללות, אשר במידה ניכרת יכול להשפיע על התפקוד והרגולציה של ציר ההיפותלמוס בלוטת יותרת המוח-יותרת הכליה (HPA). הפעלת תא פיטום, שהוכחה להיות מוגבר בשני השתן והביעה הפרשות של הערמונית של חולים / CPPS CP, מוסדרת באופן חלקי על ידי הפעלה במורד הזרם של ציר HPA. הפרדה אימהית יילודים (NMS) הייתה בשימוש כבר למעלה משני עשורים ללמוד את התוצאות של מתח בתחילת חיים במודלים של מכרסמים, לרבות שינויים בציר HPA והרגישות קרביים. כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט לשימוש בNMS כמודל פרה-קליני של CP / CPPS בC57BL / 6 עכברי זכרים. אנו מתארים את המתודולוגיהלביצוע NMS, הערכת אלודיניה perigenital המכנית, וראיות היסטולוגית של הפעלת תא פיטום. כמו כן אנו מספקים ראיות לכך שלחץ פסיכולוגי מוקדם יכול להיות השפעות ארוכות טווח על המערכת ואברי המין הגברית בעכברים.

Introduction

כאבי אגן כרוניים הוא לא בעצמו מחלה, אלא לטווח הקשורים לכאב המתמשך הספונטני ו / או עורר של חולים שאובחנו עם תסמונת מעי רגיז (IBS), דלקת שלפוחית ​​השתן / תסמונת שלפוחית ​​השתן כואבת ביניים (IC / PBS), vulvodynia, או ערמונית כרונית / תסמונת כאב כרונית באגן (CP / CPPS). תסמונות אלה לעתים קרובות נלווים וחולקים מאפיינים רבים שבאין להם פתולוגיה קשורה או אטיולוגיה הבסיסית מזוהה, למרות בעיות בתפקוד במערכת החיסונית, מערכת עצבים מרכזית, ומערכת עצבים היקפית הוכחו לתרום לתחזוקה וההתקדמות של הפרעות אלה ^{1 -3.} חולים עם כאבי אגן כרוניים נוטים יותר להציג עם סימפטומים של נוסף, הפרעות תפקודיות כאב והפרעות במצב רוח, כולל חרדה, דיכאון, והפרעת פאניקה ^4-6, אשר נקשרה עם תפקוד שינה של hypothalamic- שאינו קשור-אגן- pituitary-ציר יותרת הכליה (HPA) ^7-10. חשיפה ללחץ חיים מוקדם או טראומה מהווה גורם סיכון משמעותי לפיתוח הפרעות HPA ותסמונות כאב כרוניים קשורות ^10,11 ו, כאמורים, משנה משמעותי של חולים עם הפרעות כאבי אגן פונקציונליות מדווח על אירועי ילדות שליליים כגון התעללות או הזנחה חווה ^12-14.

מודלים של מכרסמים של הפרדת ילוד אימהית (NMS), הכולל הסרת הגורים מסכרם לתקופה קצובה של זמן במהלך תקופת preweaning, שימשו במשך שני העשורים האחרונים כדי ללמוד את התוצאות של מתח בתחילת חיים. באופן כללי, NMS הוכח להגדיל הפעלת HPA ציר, והתנהגויות כמו חרדה-תוצאה, ישירות על ידי המשפיע על ביטוי גנים בהיפותלמוס, כמו גם שיבוש רגולציה במורד הזרם ממבנים הלימבית ^15-18. שיבוש תפקוד ציר HPA הנכון הוכח לתרום למעי גס עלה ^19-22 ונרתיק ¹⁶ רגישות המוצגת על ידי מודלים NMS מכרסמים, אך למרות אפיון נרחב של ההשפעה לטווח הארוך של דלקת בשלפוחית ​​השתן לאחר לידה ^23-25, את ההשפעה של לחץ בתחילת חיים במידה רבה הלכה לא נחקרה באיברים ואברי המין. לכן, המחקר הבא יתאר כיצד לבצע NMS בעכברים, ולאחר מכן להעריך רגישות perigenital מכאנית וחדירת תא תורן / הפעלה בערמונית כדי לאמת את השימוש בעכברי NMS גבריים כמודל פרה-קליני עבור CP / CPPS.

של כל הפרעות כאבי אגן אובחנו כרוניות, CP / CPPS היא אולי תסמונת לפחות מוכרת היטב ומאופיינת, למרות שיש שכיחות לאורך חיים של כ 14% ^-26 ועלויות מטופל שנתיות נאמדו ב$ 4400 (כפול מזו של כאב גב תחתון או שגרונית דלקת פרקים ^27). חולים עם CP כאב דו"ח / CPPS בחיץ הנקבים, רקטום, ערמונית, איבר מין, אשכים, ו / או ²⁸ בטן, לחוות הייתוארן גר בלחץ פסיכולוגי בהשוואה לחולי שליטת ^29, ובהווה נפוץ עם סימפטומים של או אובחן עם הפרעות נלוות כרוניות אגן כאב או מצב רוח ^5,29-31. זיהום חוזר ונשנה, האפיתל הדולף, דלקת עצבית, ואוטואימוניות יש כל שיערו כגורמים אפשריים הבסיסיים של CP / CPPS ^2,32,33, כמו גם הפעלת תא פיטום וdegranulation ^34. הפרשות של הערמונית הביעו מהגברים עם CP / CPPS עלו רמות tryptase תא פיטום וגורם גדילה עצבית (NGF) ^34, ומחקר מאוחר יותר אישר כי tryptase וקרבוקסיפפטידאז (CPA3), סמן של הפעלת תא פיטום, גם הוגדלו ב שתן של חולי CP / CPPS ^35. התפקיד הפוטנציאלי לתאי פיטום בתחילה והתחזוקה של CP / CPPS היה מוקד עיקרי של מחקר בבעלי חיים בתסמונת זו עד כה. המודל המכרסם הנפוצה ביותר מועסק בשימוש ללמוד CP / CPPS הוא ערמונית אוטואימוניות ניסיונית (EAP) המודל generated על ידי הזרקה תת עורית של אנטיגן הערמונית באדג'ובנט של פרוינד המלא, מה שגורם בדרגות שונות של דלקת ערמונית תלוי במין וזן המשמש ^34,36-39. חדירת תא פיטום והפעלה / degranulation הוכח להגדיל אינדוקציה של EAP ^34,35,40 הבאה. עכברים מהונדסים חסרים או תאי פיטום ³⁴ או קולט tryptase ³⁵ PAR2 לא לפתח רגישות ערמונית טקטיקה הבאה EAP, בניגוד לעכברי EAP wildtype. בעוד מודל פרה-קליני זה משכפל רב של המאפיינים של CP האדם / CPPS, פרוטוקול האינדוקציה הוא לא מעיד על מצבו של האדם, שבו יש אטיולוגיה מגוונת ולעתים קרובות אינו כרוכות דלקת ישירה, זיהום או פציעה של הערמונית.

ההשפעה של מתח בתחילת חיים על התפתחות CP / CPPS בבני אדם במידה רבה הלכו נחקרת; עם זאת, מחקר על ידי הו, et al. ^41, הוכיח כיn שדיווח על היסטוריה של ילדות פיזית, רגשי, ו / או התעללות מינית היתה באופן משמעותי סיכוי גבוה יותר לחוות סימפטומים המעידים על CP / CPPS. יתר על כן, הם הראו כי הן כאב ועשרות שתן היו גבוהים יותר בחולים עם היסטוריה של התעללות פיזית ורגשית. אנחנו הוכחנו בעבר כי באותו הפרדיגמה NMS בC57BL / 6 נקבות עכברים מייצרת רגישות יתר בנרתיק וביטוי גנים לא תקין בשני נרתיק ושלפוחית ​​שתן מרמז על תפוקת ציר HPA מתפקד ^16. עדות זו בשילוב עם השכיחות הגבוהה של CP חולים / CPPS הצגה עם מחלות רקע אחרים ^42, כוללים IC / PBS והפרעות במצב רוח, שברורים יותר הוכחו להיות מקושר עם חשיפת מתח חיים המוקדמים ^12-14, מספקת רציונל לשימוש ב מודל NMS לחקור CP / CPPS בעכברים.

Protocol

כל הניסויים שתוארו בפרוטוקול זה תואמים את הנחיות NIH בהתאם להנחיות שצוינו על ידי המרכז הרפואי של אוניברסיטת קנזס מוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש הוועדה.

1. הפרדת ילודים אימהית (NMS)

1. צג סכרים בהריון יומי ללידות המלטה.
   הערה: יום ההמלטה נולדה נחשבת P0.
2. על P1, להסיר את הסכר מהכלוב בבית ואת המקום לתוך מיכל המשני נקי.
3. לשפשף את קומץ המצעים בין ידיים בכפפות נקיות כדי לשמור על ריח של הכלוב בבית.
4. להוסיף עומק של 1 - 2 סנטימטר של מצעי כלוב בבית לנקי, כראוי שכותרת 2 כוס זכוכית L. להוסיף כמחצית מכל חומר נוסף להעשרת מצעים שנמצא בכלוב בבית, למשל, נייר nestlet, להתקמט, לכוס הזכוכית.
5. מניח בעדינות את כל הגורים מהמלטה אחת, בנפרד, באותו הכוס.
6. מייד למקוםהכוס בחממה שנערכה בלחות 33 ^מעלות צלסיוס ו -50% עבור 180 דקות.
7. הסר את הסכר מיכל המשני ולהחזיר אותה לכלוב בבית. להחזיר את הכלוב בבית למיקום הדיור המתאים בתוך ביבר.
8. חזור על תהליך זה עבור כל המלטה עוברת NMS, באמצעות כפפות נקיות ומכולות המשניות עבור כל המלטה / סכר.
9. בסוף תקופת ההפרדה 180 דקות, להחזיר את ההמלטות לכלובים בביתם באותו סדר כפי שהם הוסרו.
10. אחזר את הכלוב בבית של ההמלטה הראשונה שהופרדה מוקדם יותר ביום. הסר את הסכר מהכלוב בבית ואת המקום לתוך מיכל המשני נקי.
11. הסר את הכוס הראשונה מהחממה ולשפשף קומץ של מצעים בין ידיים בכפפות נקיות כדי לשמור על ריח של הכלוב בבית בזמן טיפול הגורים.
12. בעדינות להזיז את הגורים, בנפרד, מהכוס לכלוב בבית.
13. לחזור כל העשרה ומצעים שנותר בכוס להכלוב בבית.
14. להחזיר את הסכר מיכל המשני לכלוב בבית ולהחזיר אותו למיקום הדיור המתאים בתוך ביבר.
15. יש לשטוף את הכוס עם מים ולהחזיר אותו לחממה. השתמש באותה כוס לכל המלטה לאורך כל הליך ההפרדה.
16. חזור על תהליך זה עבור כל המלטה עוברת NMS באותו סדר כפי שהם הושמו באינקובטור.
17. חזור על הליך כל זה עבור כולם מצויה המלטה NMS כל יום דרך P21.
18. לגמול את גורי NMS ונאיביים על P22 על ידי הצבת המלטה מאותו המין יחד בכלובים נקיים מלאים במזון ובמים. צריכים להיוולד גורים נאיביים ושוכנו באותם תנאים כמו עכברי NMS, אבל לא לעבור טיפול נוסף מחוץ למשימות גידול בעלי חיים נורמלים.

2. Perigenital מכאני רגישות

1. התקנת מכשירי פון פריי
   1. להביא את העכברים לחדר הבדיקות ולאפשר להם להסתגל ל30דקות בעוד שנותרו בכלובים בביתם.
   2. הכן את אזור הבדיקה על ידי הצבת underpad סופג מתחת שולחן מוגבה רשת תיל העליון (79 סנטימטרים X 28 סנטימטרים) שמספק מספיק מקום על מנת לאפשר לחוקר להתקרב מן החלק התחתון בלי להבהיל את העכברים, כ 55 סנטימטר בגובה.
   3. הנח עד 12 עכברים, בנפרד, תחת תאי פלסטיק שקופים, מחוררים (11 סנטימטרים X 5 סנטימטרים X 3.5 סנטימטרים) בחלק העליון של טבלת רשת תיל. מניחים חפץ כבד על גבי התאים כדי למנוע עכברים לברוח.
   4. להסתגל לעכברים 30 דקות נוספות על המסך לפני הערכת סף נסיגה.
2. הערכת Perigenital מכאנית רגישות
   1. בצע את השיטה למעלה למטה באמצעות סט סטנדרטי של monofilaments פון פריי המדורג ^43. השתמש בmonofilaments הבא: 1.65 גר ', 2.36 גר', 2.83 גר ', 3.22 גר', 3.61 גר ', 4.08 גר', 4.31 גר ', וגרם 4.74.
      1. החזק את הבסיס של monofilament גרם 3.22 ולחשוף את מונו חזר בונימה.
         הערה: בדגמים מסוימים לא יכולים להיות חוט חד חזר.
      2. למקם את החללית כדי שהחוט חד הוא בכיוון אנכי וכאשר העכבר הוא ערני, חסר תנועה, ומשקל הגוף שלה מחולק באופן שווה בין רגליו האחוריות להחיל אותו אל צד ימין או השמאל של כיס האשכים, הימנעות קו האמצע, עד קל העיקול הוא ציין בנימה.
      3. החזק את החוט חד במקום במשך 10 שניות או עד שהחיה מראה תגובה חיובית.
         הערה: תגובה חיובית נחשבת לאידיוט או לקפוץ נמרצים בתגובה לבקשת monofilament או ליקוק או נשיכת התנהגות המכוונת לחוט חד. אם מהלכי העכבר במהלך יישום monofilament 10 שניות מבלי להציג התנהגויות אלו, monofilament יש הערכה מחדש לאחר תקופה שאר 1 דקות ארוכות מינימום. אם עכבר לא מהלכים ולא מציג כל מעל התנהגויות המופיעות ביישום monofilament 10 שניות, זה נחשב תגובה שלילית.
      4. רשום את התגובה, שלילי או חיובי, במחברת מעבדה או מחשב נייד ולחזור על הליך זה על כל העכברים שנותרו באמצעות החוט חד 3.22 גר '.
      5. לבדוק את כל העכברים שוב באמצעות החוט חד המתאים הבא. הערה: אם העכבר הציג תגובה שלילית לmonofilament 3.22 גר ', להחיל את החוט חד 3.61 גר', באותו אופן ולהקליט את התגובה. אם העכבר הציג תגובה חיובית לmonofilament 3.22 גר ', להחיל את החוט חד 2.83 גר' ולהקליט את התגובה.
   2. המשך בדיקה של כל עכבר באמצעות החוט חד גדול יותר או קטן יותר הבא, כפי שמתאים, ל4 אפליקציות נוספות לאחר התשובה החיובית הראשונה הוא ציינה.
   3. חזור עכברים בכלובים הביתה.
   4. השתמש בשווי של החוט חד פון פריי הסופי שיושם בסדרת המשפט ביחידות יומן לחשב 50% סף נסיגה גרם כפי שמתואר בet al Chaplan. ^43.

כותרת "> 3. מכתים תא acidified toluidine הכחול הפיטום

1. עיבוד רקמות
   1. לנתח רקמת ערמונית ⁴⁴ מעכברים שכבר perfused intracardially עם paraformaldehyde 4% קרים כקרח ^45. Postfix הרקמה paraformaldehyde 4% עבור שעה 1 ב RT ואז cryoprotect בסוכרוז 30% ב1x PBS על 4 מעלות CO / N.
   2. הכן אמבט (30 מיליליטר) קטן של heptane ולמקם אותו על קרח יבש.
   3. יש לשטוף את רקמת הערמונית ב1x PBS ולייבש באמצעות אור החובה למחות.
   4. הכנס את רקמת הערמונית לheptane הקר עד שהוא קפוא.
   5. מייד למקם את רקמת הערמונית הקפואה בcryomold מכיל תקשורת ומקום לתלייה על קרח יבש עד שקפא.
   6. חנות cryomolds ב -20 ° C.
   7. רוחבי לחתוך את רקמת הערמונית ל7 cryosections מיקרומטר עבה באמצעות cryostat.
   8. הנח 8-12 cryosections אינו סידורי כי היקף האורך של הרקמה, על גבי שקופיות מיקרוסקופ חיובי טעונים.
   9. חנות סיימה שקופיות ב -20 ° C עד עיבוד נוסף.
2. הכנת acidified toluidine הכחול
   1. להוסיף 1 גרם של toluidine הכחול O 100 מיליליטר 70% אתנול ו מערבולת עד בפתרון להכין פתרון מניות 1%. פתרון המניות יכול להיות מאוחסן על RT עד שלושה שבועות.
   2. הוסף 1 גרם NaCl למים 100 מיליליטר בכוס מונחת על גבי צלחת ומערבבים.
   3. התאם את ה- pH של תמיסת NaCl באמצעות 12 M HCl עד טווח pH של 0.5-1.0 מושגת.
   4. הכן את פתרון toluidine הכחול 0.25% עובד על ידי שילוב של 8 מיליליטר של פתרון מניות toluidine הכחול ו -32 מיליליטר של 1% פתרון NaCl. פיפטה מעלה ומטה כדי להבטיח שילוב כולל של פתרון מניות toluidine הכחול ומערבבים בעזרת מערבולת. הפתרון עובד חייב להיעשות טרי ומושלך לאחר השימוש.
3. מכתים cryosections הערמונית
   1. הסר את השקופיות להיות מעובד מהמקפיא ולאפשר לאזן לRT לכ -30 מ 'ב.
   2. שטוף את חלקי רקמות על ידי בנפרד טבילת השקופיות עבור כ 1 שניות לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר המכיל נפח מספיק של 1x PBS על מנת להבטיח כי סעיפי רקמות רכוב שקופיות יהיו שקועים לחלוטין. לאפשר שקופיות לאוויר יבשות במגבת נייר.
   3. מגלשות מקום בצנצנת מכתימה זכוכית המכילה 0.25% פתרון toluidine הכחול עובד מספיק כדי להבטיח שסעיפי רקמות רכוב שקופיות יהיו שקועים לחלוטין ודגירה במשך 10 - 15 דקות ואילו על כיסא נדנדה פלטפורמה נקבעה על 15 סל"ד.
   4. טובלים שקופיות ב1x PBS כ 1 שניות כדי לשטוף את עודף toluidine הכחול.
   5. מניחים שקופיות בתיבת שקופיות או מדף בצורה כזו כי השקופיות על צדם, כדי לאפשר ניקוז.
   6. ייבש את השקופיות בתנור על 37 מעלות צלזיוס למשך תקופה מינימאלית של 2 שעות או O / N ב RT.
   7. מייבשים שקופיות באמצעות אלכוהול במהירות, מה שמאפשרים את השקופיות להתייבש לחלוטין בין חשיפות אלכוהול. מגלשות יבשים על ידי ניקוז על מגבת ניירND גב וקצות מנגב עם אור חובה למחות.
      1. לטבול את השקופיות ב -95% EtOH כ 1 שניות ולאפשר לו להתייבש לחלוטין. חזור על תהליך זה 1 - 10 פעמים עד שהרקמה מתייבשת יותר כחולה יותר מסגול.
      2. לטבול את השקופיות בEtOH 100% לכ 1 שניות ולאפשר לו להתייבש לחלוטין. חזור על תהליך זה 1 - 10 פעמים עד שהרקמה היא כהה לכחול בינוני, אבל לא סגולה.
   8. תקן את הכתם על ידי דוגרים שקופיות קסילן 100% במשך 3 דקות. לאפשר לו להתייבש.
   9. Coverslip השקופיות עם גליצרול, PBS, או תקשורת הרכבה קבועה מבוסס קסילן. מסננים תקשורת וחנות עודפות בRT.
4. תאי פיטום כימות
   1. דמיינו את סעיפי רקמות כחולים-הצבעוניים toluidine בהגדלה 20X באמצעות מיקרוסקופ אור (איור 2).
   2. לספור את המספר הכולל של תאי הפיטום הנוכחיים בתחום דמיין ולהבדיל בין תאי פיטום הלא degranulated וdegranulated. מגניפיקט 40Xיון עשוי להיות נחוץ כדי לאשר מעמד פרור בכמה תאי פיטום.
      הערה: תאי פיטום ללא degranulated תערוכה metachromasia הצפוף עם קלוש אין או מתווה גרעינית ו / או לא חול גרגירים סביב התא. תאי פיטום Degranulated התערוכה metachromasia פחות אינטנסיבי ויש לי מתווה ברורה ברורה של הגרעין ו / או גרגירים חופשיים בתוך הציטופלסמה ומחוץ לגבול התא.
   3. תמשיך להעריך את המספר הכולל של תאי פיטום הלא degranulated וdegranulated בשלמות של סעיף הרקמה הנוכחי. חזור על הליך זה על לפחות 7 סעיפים נפרדים נוספים, המשתרע לכל האורך כל רקמה.
   4. חישוב אחוזי degranulated (DG) לסך תאי פיטום לכל רקמה / עכבר על פי המשוואה הבאה: (תאי פיטום DG / תאי פיטום סה"כ) x 100.

תוצאות

עכברים שעברו NMS הראו ראיות התנהגותיות מעידות על CP / CPPS. כאשר נבדק עם סדרה מדורגת של monofilaments פון פריי, עכברי NMS 8 שבוע-ישנים (n = 4) מוצג אלודיניה המכנית perigenital בהשוואה לעמיתיהם נאיביים (n = 5, איור 2). עדות לכך שהפחתה משמעותית (p <0.01; מבחן t) בסף הנסיגה המכני שעורר ת?...

Discussion

פרוטוקול זה מספק מתודולוגיה לשימוש בלחץ בילוד, בצורה של NMS, כדי לגרום לsymptomology מעיד על CP / CPPS בעכברי זכרים בוגרים. כמבוגרים, עכברי NMS להציג אלודיניה המשמעותית perigenital המכנית, כמו גם ראיות של degranulation תא תורן ברקמת ערמונית. השימוש בNMS הוא גישה חדשנית לפיתוח מודל פרה-קליני של C...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pregnant C57BL/6 female mice	Charles River	027	Timed or untimed pregnant females should be monitored daily for in-house birth.
2 L glass beaker(s)	Sigma-Aldrich	CLS10002L	Each NMS litter will be held in the same beaker throughout the 21 day separation period.
VWR Forced Air Incubator, Basic	VWR International	414005-124	The incubator should be held at 33°C and 50% humidity.
Touch Test Sensory Evaluator, Kit of 20 (Semmes-Weinstein Von Frey Aesthesiometer for touch assessment)	Stoelting	58011	The following monofilaments should be used for perigenital sensitivity assessment: 1.65 g, 2.36 g, 2.83 g, 3.22 g, 3.61 g, 4.08 g, 4.31 g, and 4.74 g.
Animal Enclosure (12 mice 6 rats)	IITC	435	Be sure to place a heavy object on top of the individual, acrylic animal enclosures to prevent mice from escaping.
Mesh Stand for mice and rats (12 mice 6 rats)	IITC	410	Place stand on a stable table top for comfortable access.
Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P5493	Dilute the 10x PBS stock to 1x PBS.
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	A 4% paraformaldehyde solution is needed to intracardially perfuse mice and postfix tissue in preparation for mast cell staining.
Sucrose	Sigma-Aldrich	S5016	Cryoprotect fixed tissue in 30% sucrose solution at 4°C overnight.
Heptane	Sigma-Aldrich	246654	Chill heptane on dry ice to freeze tissue.
Standard Cryomold	VWR International	4557	To assist in freezing prostate tissue prior to cryostat sectioning
Tissue-Tek OCT Compound	Sakura	4583	12 x 125 ml
VWR Superfrost Plus Micro Slide	VWR International	48311-703	75 x 25 x 1 mm
Toluidine Blue O	Sigma-Aldrich	198161	Certified by the Biological Stain Commission. Suitable for use as a metachromatic stain for mast cells.
Ethanol, Absolute (200 Proof)	Fisher Scientific	BP2818-4	Molecular Biology Grade, Fisher Bioreagents; 95% and 100% solutions will be needed to dehydrate stained cryosections before mast cell visualization.
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S9888	Acidified NaCl solution should be made fresh before staining cryosections.
GeneMate Sterile 50 ml Centrifuge Tubes	BioExpress	C-3394	Disposable tubes used to mix toulidine blue elements or dip slides into 1xPBS.
Coplin staining dish for 10 slides, with ground glass cover	Fisher Scientific	08-815	Hold up to 10 standard 3 x 1 in. (75 x 25mm) slides back-to-back. Use separate dishes for Toluidine Blue working solution, 95% EtOH, 100% EtOH, and xylene.
Xylenes (Histological)	Fisher Scientific	X3P	Once dehydrated, tissue is cleared with xylene.
Microscope Slide Boxes, 100-Place	VWR International	82003	Boxes can be used for storage and transportation of slides.
Fisherbrand Microscope Slide Box	Fisher Scientific	22-363-400	These slide boxes are typically small enough to fit inside a cryostate.
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	Glycerol is a traditional mounting medium.
Mounting Medium, Richard-Allan Scientific	VWR International	4111	Mounting medium firmly bonds the coverslip to the slide.
Micro Cover Glasses, Rectangular, No. 1	VWR International	48393-106	A coverslip is placed over the dehydrated and cleared tissue to protect the sample.
Light Microscope	Nikon		The Advanced Automated Research Microscope Eclipse 90i, used by our lab, has been discontinued and replaced Eclipse Ni-E.