Avaliação da Perigenital Sensibilidade e Prostatic Mast Ativação celular em um rato modelo de Separação Materna Neonatal

Resumo

Estamos medindo a sensibilidade ea ativação de células mastro mecânico perigenital na próstata masculina de camundongos C57BL / 6 que foram submetidos a um paradigma de estresse precoce - separação materna neonatal, de modo a induzir um modelo pré-clínico de síndrome de dor pélvica / crônica prostatite crônica.

Resumo

Prostatite crônica / síndrome de dor pélvica crônica (CP / CPPS) tem uma prevalência de 14% e é o diagnóstico urológico mais comum entre homens com idade inferior a 50, no entanto, é a desordem de dor pélvica crônica menos compreendidas e estudadas. Um subconjunto significativo de pacientes com dor pélvica crônica relatório ter experimentado estresse precoce ou abuso, que pode afetar significativamente o funcionamento ea regulação do eixo hipotálamo-pituitária-adrenal (HPA). Activação de mastócitos, que se demonstrou ser aumentada na urina e expresso de secreções prostáticas doentes CP / CPPS, é parcialmente regulado por activação a jusante do eixo HPA. Neonatal separação materna (SMN) tem sido usado por mais de duas décadas a estudar os resultados de estresse precoce em modelos de roedores, incluindo alterações no eixo HPA e sensibilidade visceral. Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado para a utilização NMS como um modelo pré-clínico da CP / CPPS em machos C57BL / 6. Nós descrevemos a metodologiapara a realização de NMS, avaliando a alodinia mecânica perigenital, e evidência histológica de ativação de mastócitos. Nós também fornecemos evidências de que o estresse psicológico precoce pode ter efeitos duradouros sobre o sistema urogenital masculina em ratos.

Introdução

A dor pélvica crônica não é em si uma doença, mas sim um termo associado com a dor espontânea em curso e / ou evocado experimentado por pacientes com diagnóstico de síndrome do intestino irritável (IBS), cistite / síndrome da bexiga dolorosa intersticial (IC / PBS), vulvodynia, ou síndrome de prostatite crônica / dor pélvica crônica (CP / CPPS). Estas síndromes são frequentemente comorbidade e partilham muitas características em que eles não têm qualquer patologia associada ou etiologia subjacente identificado, embora a disfunção no sistema imunológico, sistema nervoso central, sistema nervoso periférico e tem sido demonstrado que contribuem para a manutenção e a progressão dessas doenças ^{1 -3.} Os pacientes com dor pélvica crónica são mais propensos a apresentar sintomas de adicional, não-relacionadas distúrbios de dor pélvica funcionais e transtornos de humor, incluindo a ansiedade, depressão, distúrbios de pânico e ^4-6, que tem sido associado com a funcionamento alterado do hipotálamo hipófiseadrenal (HPA) ^7-10. A exposição ao estresse precoce ou trauma é um importante fator de risco para o desenvolvimento de anormalidades HPA e síndromes de dor crônica associados ^10,11 e, como tal, um subconjunto significativo de pacientes com transtornos de dor pélvica funcionais relatam ter experimentado efeitos adversos da infância, como abuso ou negligência ^12-14.

Modelos de roedores de separação materna neonatal (SMN), que envolve a remoção os filhotes de suas mães por um determinado período de tempo durante o período de pré-desmame, foram utilizados para as últimas duas décadas a estudar os resultados de estresse precoce. Em geral, a NMS foi mostrada para aumentar a ativação do eixo HPA, e comportamentos de ansiedade semelhante resultantes, afectando directamente a expressão de genes dentro do hipotálamo, bem como perturbando a regulação a jusante a partir de estruturas límbicas ^15-18. Perturbação de funcionamento correcto do eixo HPA foi mostrado para contribuir para o aumento da colorrectal ^19-22 Vaginal e ¹⁶ sensibilidade apresentada por roedores NMS modelos, mas, apesar de extensa caracterização do efeito a longo prazo de inflamação da bexiga pós-natal ^23-25, o impacto do estresse precoce foi amplamente ido unstudied nos órgãos urogenitais. Portanto, o estudo a seguir descrevem como executar NMS em ratos e, posteriormente, avaliar a sensibilidade mecânica perigenital e infiltração de mastócitos / activação na próstata para validar o uso de camundongos machos NMS como um modelo pré-clínico para CP / CPPS.

De todos os distúrbios da dor pélvica crônica diagnosticada, CP / CPPS é talvez a síndrome menos bem reconhecido e caracterizado, apesar de ter uma prevalência de cerca de 14% ²⁶ e custos anuais de doentes estimados em 4,400 dólares (o dobro da dor lombar ou artrite artrite ^27). Os pacientes com CP relatório / CPPS dor no períneo, reto, próstata, pênis, testículos, e / ou abdômen ^28, experimentar um oigher grau de estresse psicológico do que os pacientes de controle ^29, e comumente presentes com sintomas de ou são diagnosticados com dor ou transtornos de humor pélvicas crônicas de comorbidade ^5,29-31. Infecção recorrente, epitélio com goteiras, inflamação neurogênica, e autoimunidade têm sido imaginado como potenciais causas subjacentes da CP / CPPS ^2,32,33, assim como a ativação de mastócitos e degranulation ^34. Secreções prostáticas expressa a partir de homens com CP / CPPS tinha aumentado triptase de mastócitos e factor de crescimento do nervo (NGF), os níveis ^34, e um estudo mais tarde confirmado que a triptase e carboxipeptidase A (CPA3), um marcador de activação de mastócitos, foram também aumentadas no urina de pacientes com CP / CPPS ^35. O papel potencial de mastócitos no início e manutenção da CP / CPPS tem sido um importante foco de pesquisas com animais sobre essa síndrome até agora. O modelo de roedor mais comumente empregado usado para estudar CP / CPPS é uma prostatite auto-imune experimental (EAP) modelo genrado pela injecção subcutânea do antigénio da próstata em adjuvante completo de Freund, o que resulta em graus variados de inflamação prostática dependendo das espécies e estirpes utilizadas ^34,36-39. Infiltração de mastócitos e ativação / desgranulação foi mostrado para aumentar após a indução da EAP ^34,35,40. Camundongos transgênicos deficientes em ambos os mastócitos ³⁴ ou o receptor tryptase PAR2 ³⁵ não desenvolver a sensibilidade tática prostática seguinte EAP, ao contrário de ratos do tipo selvagem EAP. Embora este modelo pré-clínico replica muitas das características de PB humano / CPPS, o protocolo de indução não é indicativo da condição humana, que tem uma etiologia diversa e muitas vezes não envolvem inflamação directa, infecção ou lesão da próstata.

A influência do estresse precoce no desenvolvimento de CP / CPPS em seres humanos foi amplamente ido sem investigação; no entanto, um estudo realizado por Hu et al. ^41, demonstrou que men que relatou uma história de infância físico, emocional e / ou abuso sexual foram significativamente mais propensos a apresentar sintomas sugestivos de CP / CPPS. Além disso, eles mostraram que tanto a dor e escores urinários foram aumentados em pacientes com história de abuso físico e emocional. Nós já demonstrado que o mesmo paradigma NMS em fêmea C57BL / 6 ratos produz hipersensibilidade vaginal e a expressão do gene anormal tanto na vagina e bexiga sugestivo de HPA disfuncional eixo de saída ^16. Esta evidência combinada com a alta prevalência de CP / CPPS pacientes que apresentam outras comorbidades ^42, incluindo IC / PBS e transtornos de humor, que foram mais claramente demonstrado que é relacionada com a exposição estresse precoce ^12-14, fornece a justificativa para o uso de um modelo NMS para investigar CP / CPPS em camundongos.

Protocolo

Todas as experiências descritas neste protocolo estão em conformidade com as diretrizes do NIH, em conformidade com as orientações especificadas pela University of Kansas Medical Center Institutional Animal Care e do Comitê Use.

1. Separação Materna Neonatal (SMN)

1. Monitorar barragens grávidas diariamente para nascimentos de maca.
   Nota: O dia da ninhada nasce é considerado P0.
2. No P1, retire a barragem da gaiola e coloque em um recipiente secundário limpo.
3. Esfregue um punhado de roupas de cama entre as mãos limpas de luvas para manter cheiro da gaiola.
4. Adicionar uma profundidade de 1-2 cm da cama gaiola em um ambiente limpo, devidamente rotulados 2 copo de vidro G. Adicionar aproximadamente metade de qualquer material adicional enriquecimento de cama que está presente na gaiola, por exemplo, nestlet, papel da dobra, para a taça de vidro.
5. Suavemente colocar todas as crias de uma única ninhada, individualmente, no mesmo copo.
6. Coloque imediatamenteo copo numa incubadora mantida a 33 ^{° C} e 50% de humidade durante 180 minutos.
7. Remova a barragem do recipiente secundário e devolvê-la para a gaiola casa. Retorne a gaiola para seu local de moradia adequada dentro do viveiro.
8. Repita esse procedimento para cada ninhada passando por NMS, usando luvas limpas e recipientes secundários para cada ninhada / barragem.
9. No final do período de separação de 180 min, as ninhadas retornar às suas gaiolas de alojamento na mesma ordem em que foram removidos.
10. Recuperar a gaiola da primeira ninhada que foi separado no início do dia. Remova a barragem da gaiola e coloque em um recipiente secundário limpo.
11. Remova a primeira taça da incubadora e esfregue um punhado de roupas de cama entre as mãos enluvadas limpas para manter cheiro da gaiola durante o manuseio dos filhotes.
12. Suavemente mover os filhotes, individualmente, a partir da taça para a gaiola de origem.
13. Retorne qualquer enriquecimento e roupa de cama restante no copo dea gaiola de origem.
14. Retornar à barragem do reservatório secundário para a gaiola para casa e devolvê-lo ao seu local de moradia adequada dentro do viveiro.
15. Lavar o copo com água e devolvê-lo para a incubadora. Utilizar o mesmo copo para cada ninhada durante todo o procedimento de separação.
16. Repetir este procedimento para cada ninhada submetidos NMS na mesma ordem em que foram colocados na incubadora.
17. Repita este procedimento inteiro para cada ninhada NMS submetidos todos os dias através de P21.
18. Desmamar filhotes NMS e ingênuos sobre P22, colocando ninhada do mesmo sexo juntos em gaiolas limpas completas com comida e água. Filhotes ingênuos devem nascer e ser alojados sob as mesmas condições que os ratos NMS, mas passam por nenhum tratamento adicional fora das tarefas normais de produção animal.

2. Perigenital sensibilidade mecânica

1. von Frey Setup Aparelho
   1. Traga os ratos para a sala de ensaios e permitir-lhes para se aclimatar para 30minutos mantendo-se nas suas gaiolas.
   2. Preparar a área de teste, colocando um resguardo absorvente embaixo de um mesa-top de malha de arame elevada (79 centímetros x 28 cm) que oferece espaço suficiente para permitir que o investigador se aproximar do lado de baixo, sem assustar os ratos, cerca de 55 centímetros de altura.
   3. Coloque até 12 ratos, individualmente, em câmaras de plástico transparente, perfurado (11 cm x 5 cm x 3,5 cm) na parte superior da tabela de malha de arame. Coloque um objecto pesado em cima das câmaras para evitar ratos de escapar.
   4. Aclimatar os ratos durante mais 30 minutos adicionais na tela antes da determinação do limiar de retirada.
2. Avaliação Perigenital sensibilidade mecânica
   1. Execute o método de cima para baixo usando um conjunto padrão de classificados monofilamentos de von Frey ^43. Use as seguintes monofilamentos: 1,65 g, 2,36 g, 2,83 g, 3,22 g, 3,61 g, 4,08 g, 4,31 g e 4,74 g.
      1. Segurar a base do monofilamento de 3,22 g e expor o mono retraídafilamento.
         Nota: Alguns modelos podem não ter um monofilamento retraída.
      2. Situar a sonda de modo que o monofilamento é orientado verticalmente e quando o mouse está em alerta, imóvel, e seu peso do corpo é distribuído igualmente entre as patas traseiras aplicá-lo a qualquer um o lado esquerdo ou direito do escroto, evitando a linha média, até um ligeiro curvatura é observado no filamento.
      3. Segurar o monofilamento no lugar durante 10 segundos ou até que o animal apresenta uma resposta positiva.
         Nota: Uma resposta positiva é considerada um empurrão rápido ou saltar em resposta à aplicação de monofilamento ou lamber ou morder comportamento dirigido para o monofilamento. Se o mouse se move durante a aplicação de monofilamento de 10 segundos sem exibir estes comportamentos, o monofilamento deve ser testada novamente após um período mínimo de descanso de 1 min de duração. Se um rato nem se move nem apresenta qualquer um dos comportamentos listados acima durante a aplicação de monofilamento de 10 segundos, é considerada uma resposta negativa.
      4. Grave a resposta, seja positiva ou negativa, em um caderno de anotações ou laptop e repetir este procedimento em todos os restantes ratos usando a 3,22 g monofilamento.
      5. Testar todos os ratos novamente usando o seguinte monofilamento apropriada. Nota: Se o rato exibiram uma resposta negativa ao monofilamento de 3,22 g, aplicam-se a 3,61 g de monofilamento do mesmo modo e gravar a resposta. Se o mouse exibiram uma resposta positiva para o monofilamento 3,22 g, aplique a 2,83 g monofilamentos e gravar a resposta.
   2. Continue testando cada rato utilizando a próxima monofilamento maior ou menor, consoante o caso, durante quatro aplicações adicionais após a primeira resposta positiva é observada.
   3. Retorno ratos para gaiolas.
   4. Utilizar o valor da última monofilamentos de von Frey aplicado na série experimental em unidades logarítmicas para calcular um limiar de retirada de 50% g como descrito em Chaplan et ai. ^43.

title "> 3. Acidificado Toluidine azul mastro de coloração celular

1. Processamento de Tecidos
   1. Dissecar tecido da próstata ⁴⁴ a partir de ratos que foram perfundidos com intracardial gelada paraformaldeído a 4% ^45. Sufixo o tecido em paraformaldeído a 4% durante 1 h à TA e depois cryoprotect em sacarose a 30% em 1x PBS a 4 ° CO / N.
   2. Prepara-se uma pequena (30 ml) Banho de heptano e colocá-lo em gelo seco.
   3. Lavar o tecido da próstata em 1x PBS e secar com um dever luz wipe.
   4. Insira o tecido da próstata para o heptano frio até que seja congelado.
   5. Imediatamente coloque o tecido da próstata congelado em um cryomold contendo meios de montagem e colocar no gelo seco até congelados.
   6. Loja cryomolds a -20 ° C.
   7. Transversalmente cortar o tecido da próstata em 7 criocortes micrometros de espessura, utilizando um criostato.
   8. Colocar 8-12 criocortes não seriados que abrangem o comprimento do tecido, em lâminas de microscópio com carga positiva.
   9. Loja terminado lâminas a -20 ° C até posterior processamento.
2. Preparando Acidificado Azul de Toluidina
   1. Adicionar 1 g de Azul de Toluidina O para 100 ml de etanol a 70% e vortex até que em solução para preparar uma solução stock de 1%. A solução-mãe pode ser armazenado à temperatura ambiente durante até três semanas.
   2. Adicionar 1 g de NaCl a 100 ml de água num copo colocado no topo de uma placa de agitação.
   3. Ajustar o pH da solução de NaCl utilizando HCl 12 M até uma gama de pH 0,5 - 1,0 é alcançado.
   4. Preparar a solução de azul de toluidina a trabalhar a 0,25% por combinação de 8 mL da solução stock de Toluidina Azul e 32 ml de solução de NaCl a 1%. Pipeta cima e para baixo para garantir a incorporação total da solução estoque Azul de Toluidina e misturar utilizando um vórtice. A solução de trabalho deve ser feito fresco e descartados após o uso.
3. A coloração da próstata Cortes congelados
   1. Retirar as lâminas a serem processados ​​a partir do congelador e deixar equilibrar à temperatura ambiente durante cerca de 30 mdentro.
   2. Lavam-se as secções de tecido por imersão individualmente as lâminas durante cerca de 1 segundo para um tubo cónico de 50 ml contendo um volume suficiente de 1x PBS para assegurar que as secções de tecido em lâminas vão ser completamente submerso. Deixar as lâminas secar ao ar numa toalha de papel.
   3. Colocar as lâminas em um frasco de vidro para coloração contendo suficiente trabalhar solução azul de toluidina a 0,25% para assegurar que as secções de tecido em lâminas vão ser completamente submerso e incubar durante 10 - 15 min, enquanto numa plataforma oscilante fixada em 15 rpm.
   4. Dip slides em 1x PBS para aproximadamente 1 segundo para lavar o excesso de Azul de Toluidina.
   5. Colocar as lâminas em uma caixa de corrediça ou cremalheira, de tal maneira que as lâminas estão nos seus lados para permitir a drenagem.
   6. Secam-se as lâminas em um forno a 37 ° C durante um mínimo de 2 horas ou O / N à temperatura ambiente.
   7. Desidratam rapidamente os slides usando álcool, permitindo que os slides para secar completamente entre as exposições de álcool. Lâminas secas por drenagem em uma toalha de papel umand de limpeza costas e bordas com um dever luz wipe.
      1. Mergulhe as lâminas em 95% EtOH durante cerca de 1 seg e deixe secar completamente. Repita este procedimento 1-10 vezes até que o tecido seca mais azul do que roxo.
      2. Mergulhe as lâminas em EtOH a 100% para aproximadamente 1 segundo e deixe secar completamente. Repita este procedimento 1-10 vezes até que o tecido é escuro para azul médio, mas não roxo.
   8. Corrigir a mancha por incubação das lâminas em 100% de xileno por 3 min. Deixe secar.
   9. Lamela os slides com glicerol, PBS ou mídia de montagem permanente à base de xileno. Escorra o excesso de mídia e armazenar a RT.
4. Quantificando mastócitos
   1. Visualize as secções de tecido azul-toluidina manchadas com ampliação de 20x usando microscopia de luz (Figura 2).
   2. Contar o número total de mastócitos presentes dentro da área visualizada e diferenciar entre mastócitos desgranulados e não-desgranulados. 40X Magnificatião pode ser necessário para confirmar o estado de granulação em alguns mastócitos.
      Nota: os mastócitos desgranulados não exibem metacromasia densa com nenhuma ou esboço fraco nuclear e / ou não granular extrusão em torno da célula. Mastócitos desgranulados exibem menos intensa metacromasia e ter uma visão clara óbvio do núcleo e / ou grânulos livres dentro do citoplasma e fora da borda da célula.
   3. Continuar para avaliar o número total de mastócitos desgranulados e não-desgranulados na totalidade da secção de tecido actual. Repita este procedimento em pelo menos sete seções separadas adicionais, que mede o comprimento cada tecido.
   4. Calcula-se a percentagem de desgranulados (DG) para células totais mastro para cada tecido / rato de acordo com a seguinte equação: (mastócitos dg / células totais x 100) de mastro.

Resultados

Os ratos que foram submetidos a NMS mostrou evidências comportamentais indicativo de CP / CPPS. Quando testado com uma série graduada de monofilamentos de von Frey, 8 semanas de idade, ratinhos NMS (n = 4) exibido alodinia mecânica perigenital quando comparado com homólogos naive (n = 5, Figura 2). Isto é evidenciado como uma redução significativa (p <0,01; teste t de Student) no limiar mecânico de retirada que provocou uma resposta comportamental positiva, registrado como um empurr?...

Discussão

Este protocolo fornece metodologia para usar o estresse neonatal, sob a forma de NMS, para induzir a sintomatologia indicativa de CP / CPPS em ratos machos adultos. Como adultos, os ratos NMS exibir alodinia mecânica perigenital significativa, bem como provas de degranulação dos mastócitos no tecido da próstata. O uso de NMS é uma nova abordagem para o desenvolvimento de um modelo pré-clínico da CP / CPPS na medida em que reproduz o início da vida stress que muitas vezes é relatada pelos pacientes com dor pél...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pregnant C57BL/6 female mice	Charles River	027	Timed or untimed pregnant females should be monitored daily for in-house birth.
2 L glass beaker(s)	Sigma-Aldrich	CLS10002L	Each NMS litter will be held in the same beaker throughout the 21 day separation period.
VWR Forced Air Incubator, Basic	VWR International	414005-124	The incubator should be held at 33°C and 50% humidity.
Touch Test Sensory Evaluator, Kit of 20 (Semmes-Weinstein Von Frey Aesthesiometer for touch assessment)	Stoelting	58011	The following monofilaments should be used for perigenital sensitivity assessment: 1.65 g, 2.36 g, 2.83 g, 3.22 g, 3.61 g, 4.08 g, 4.31 g, and 4.74 g.
Animal Enclosure (12 mice 6 rats)	IITC	435	Be sure to place a heavy object on top of the individual, acrylic animal enclosures to prevent mice from escaping.
Mesh Stand for mice and rats (12 mice 6 rats)	IITC	410	Place stand on a stable table top for comfortable access.
Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P5493	Dilute the 10x PBS stock to 1x PBS.
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	A 4% paraformaldehyde solution is needed to intracardially perfuse mice and postfix tissue in preparation for mast cell staining.
Sucrose	Sigma-Aldrich	S5016	Cryoprotect fixed tissue in 30% sucrose solution at 4°C overnight.
Heptane	Sigma-Aldrich	246654	Chill heptane on dry ice to freeze tissue.
Standard Cryomold	VWR International	4557	To assist in freezing prostate tissue prior to cryostat sectioning
Tissue-Tek OCT Compound	Sakura	4583	12 x 125 ml
VWR Superfrost Plus Micro Slide	VWR International	48311-703	75 x 25 x 1 mm
Toluidine Blue O	Sigma-Aldrich	198161	Certified by the Biological Stain Commission. Suitable for use as a metachromatic stain for mast cells.
Ethanol, Absolute (200 Proof)	Fisher Scientific	BP2818-4	Molecular Biology Grade, Fisher Bioreagents; 95% and 100% solutions will be needed to dehydrate stained cryosections before mast cell visualization.
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S9888	Acidified NaCl solution should be made fresh before staining cryosections.
GeneMate Sterile 50 ml Centrifuge Tubes	BioExpress	C-3394	Disposable tubes used to mix toulidine blue elements or dip slides into 1xPBS.
Coplin staining dish for 10 slides, with ground glass cover	Fisher Scientific	08-815	Hold up to 10 standard 3 x 1 in. (75 x 25mm) slides back-to-back. Use separate dishes for Toluidine Blue working solution, 95% EtOH, 100% EtOH, and xylene.
Xylenes (Histological)	Fisher Scientific	X3P	Once dehydrated, tissue is cleared with xylene.
Microscope Slide Boxes, 100-Place	VWR International	82003	Boxes can be used for storage and transportation of slides.
Fisherbrand Microscope Slide Box	Fisher Scientific	22-363-400	These slide boxes are typically small enough to fit inside a cryostate.
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	Glycerol is a traditional mounting medium.
Mounting Medium, Richard-Allan Scientific	VWR International	4111	Mounting medium firmly bonds the coverslip to the slide.
Micro Cover Glasses, Rectangular, No. 1	VWR International	48393-106	A coverslip is placed over the dehydrated and cleared tissue to protect the sample.
Light Microscope	Nikon		The Advanced Automated Research Microscope Eclipse 90i, used by our lab, has been discontinued and replaced Eclipse Ni-E.