Évaluation de la sensibilité et de la prostate péri-Mast Cell Activation dans un modèle murin de la séparation maternelle néonatale

Résumé

Nous mesurons activation périgénitale mécanique de la sensibilité et des mastocytes dans la prostate des hommes C57BL / 6 qui a subi un début de paradigme du stress de la vie - la séparation maternelle néonatale, afin d'induire un modèle préclinique de syndrome chronique de la prostatite chronique / de douleurs pelviennes.

Résumé

La prostatite chronique / syndrome de la douleur pelvienne chronique (CP / CPPS) a une prévalence à vie de 14% et est le diagnostic urologique la plus courante pour les hommes de moins de 50 ans, mais il est le trouble le moins bien compris et a étudié la douleur pelvienne chronique. Un sous-ensemble significatif de patients avec le rapport de la douleur pelvienne chronique ayant connu le stress de début de la vie ou d'abus, ce qui peut sensiblement affecter le fonctionnement et la régulation du (HPA) axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien. L'activation des mastocytes, qui a été montré à être augmentée dans l'urine et exprimé sécrétions prostatiques de patients CP / CPPS, est partiellement régulée par activation en aval de l'axe HPA. La séparation maternelle néonatale (NMS) a été utilisé pendant plus de deux décennies à étudier les résultats de début de stress de la vie dans les modèles de rongeurs, y compris les changements dans l'axe HPA et la sensibilité viscérale. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour l'utilisation de NMS comme un modèle préclinique de CP / CPPS dans C57BL / 6 souris mâles. Nous décrivons la méthodologiepour effectuer NMS, évaluer allodynie mécanique périgénitale, et la preuve histologique de l'activation des mastocytes. Nous fournissons également des preuves que le stress psychologique précoce peut avoir des effets à long terme sur le système génito-urinaire masculin chez la souris.

Introduction

La douleur pelvienne chronique est pas en soi une maladie, mais plutôt un terme associé à la douleur continue spontanée et / ou évoquée vécue par les patients diagnostiqués avec le syndrome du côlon irritable (IBS), la cystite interstitielle / syndrome de la vessie douloureuse (IC / PBS), vulvodynie, ou le syndrome de douleur pelvienne prostatite chronique / chronique (CP / CPPS). Ces syndromes sont souvent des comorbidités et partagent beaucoup de caractéristiques en ce qu'ils présentent aucune pathologie associée ou étiologie identifiée, bien que a été montré un dysfonctionnement dans le système immunitaire, le système nerveux central et le système nerveux périphérique de contribuer à l'entretien et à la progression de ces troubles ^{1 -3.} Les patients souffrant de douleurs pelviennes chroniques sont plus susceptibles de présenter des symptômes de plus, non-pelvienne liée à des troubles fonctionnels de la douleur et des troubles de l'humeur, y compris l'anxiété, la dépression et le trouble panique ^4-6, qui a été associée avec le fonctionnement altéré de la hypothalamo hypophysosurrénalien (HHS) ^7-10. L'exposition au stress de la vie au début ou à un traumatisme est un facteur de risque important pour le développement des anomalies HPA et les syndromes de douleur chronique associée ^10,11 et, comme tel, un sous-ensemble significatif de patients atteints de troubles de douleur pelvienne fonctionnels ont indiqué avoir vécu les événements de l'enfance indésirables tels que l'abus ou la négligence ^12-14.

des modèles de rongeurs de la séparation maternelle néonatale (SMN), qui consiste à enlever les chiots de leur mère pour une période de temps au cours de la période d'avant le sevrage, ont été utilisées pour les deux dernières décennies pour étudier les résultats de début de stress de la vie. En général, NMS a été montré pour augmenter l'activation de l'axe HPA, et les comportements de type anxieux qui en résultent, en affectant directement l'expression des gènes dans l'hypothalamus, ainsi que de perturber la régulation en aval de structures limbiques ^15-18. Perturbation du bon fonctionnement de l'axe HHS a été montré pour contribuer à l'augmentation colorectal ^19-22 Vaginale et ¹⁶ sensibilité affichée par les modèles de NMS de rongeurs, mais malgré une caractérisation de l'effet à long terme de ^23-25 ​​postnatale inflammation de la vessie, de l'impact de début stress de la vie a largement pas été étudié dans les organes génito-urinaires. Par conséquent, l'étude suivante décrira comment effectuer NMS chez les souris et plus tard d'évaluer la sensibilité mécanique périgénitale et l'infiltration des mastocytes / activation dans la prostate pour valider l'utilisation de souris mâles NMS comme un modèle préclinique pour CP / CPPS.

De tous les troubles diagnostiqués de douleurs pelviennes chroniques, CP / CPPS est peut-être le syndrome de moins bien reconnu et caractérisé, en dépit d'une prévalence à vie d'environ 14% ²⁶ et les coûts annuels de patients estimés à $ 4400 (deux fois celle de la lombalgie ou la polyarthrite retour l'arthrite ^27). Les patients atteints de CP / CPPS rapport douleurs au niveau du périnée, du rectum, de la prostate, pénis, testicules, et / ou à l'abdomen ^28, l'expérience d'un salutgher degré de stress psychologique que les patients témoins ^29, et couramment présente avec des symptômes de ou sont diagnostiqués avec la douleur ou les troubles de l'humeur pelviennes chroniques concomitantes ^5,29-31. Infection récurrente, l'épithélium qui fuit, une inflammation neurogène, et l'auto-immunité ont tous été supposé que les causes sous-jacentes potentielles de CP / CPPS ^2,32,33, ainsi que l'activation des mastocytes et la dégranulation ^34. Sécrétions prostatiques exprimé à partir d'hommes atteints de CP / CPPS avaient augmenté tryptase des mastocytes et le facteur de croissance des nerfs (NGF) niveaux ^34, et une étude plus récente confirme que la tryptase et la carboxypeptidase A (CPA3), un marqueur de l'activation des mastocytes, ont également été augmenté dans le urine de patients CP / CPPS ^35. Le rôle potentiel des mastocytes dans l'apparition et le maintien de CP / CPPS a été une préoccupation majeure de la recherche animale sur ce syndrome jusqu'ici. Le modèle de rongeur le plus couramment employé utilisé pour étudier CP / CPPS est une prostatite auto-immune expérimentale (PAE) modèle gensurvoltage par injection sous-cutanée de l'antigène de la prostate dans de l'adjuvant complet de Freund, qui se traduit par des degrés variés de l'inflammation de la prostate selon l'espèce et la souche utilisée ^34,36-39. Il a été démontré infiltration de cellules de mât et l'activation / dégranulation à augmenter après l'induction de l'EAP ^34,35,40. Les souris transgéniques déficientes en soit mastocytes ³⁴ ou le récepteur PAR2 tryptase ³⁵ ne développent pas la sensibilité de la prostate tactique suivante EAP, contrairement aux souris de type sauvage du PAE. Bien que ce modèle préclinique reproduit bon nombre des caractéristiques de CP humaine / CPPS, le protocole d'induction ne sont pas indicatifs de la condition humaine, qui a une étiologie diverse et souvent ne comporte pas l'inflammation directe, une infection ou une blessure de la prostate.

L'influence de début stress de la vie sur le développement de CP / CPPS chez les humains est largement passée objet d'aucune enquête; Toutefois, une étude menée par Hu et al. ^41, a démontré que moin qui ont rapporté une histoire de physique de l'enfance, émotionnel, et / ou d'abus sexuels étaient beaucoup plus susceptibles d'éprouver des symptômes évocateurs d'CP / CPPS. En outre, ils ont montré que la douleur et les scores urinaires ont été augmentées chez les patients ayant des antécédents de violence physique et psychologique. Nous avons précédemment démontré que le même paradigme dans NMS femelle C57BL / 6 souris produit une hypersensibilité vaginal et l'expression du gène anormal à la fois dans le vagin et la vessie suggestif de sortie de l'axe HPA ¹⁶ dysfonctionnelle. Cette preuve combiné avec la forte prévalence de CP / CPPS patients présentant des comorbidités ⁴² autres, y compris les IC / PBS et troubles de l'humeur, qui ont été présentées plus clairement être lié à la vie tôt le stress exposition ^12-14, fournit la justification de l'utilisation d'un NMS modèle d'enquêter CP / CPPS chez la souris.

Protocole

Toutes les expériences décrites dans ce protocole sont conformes aux directives du NIH en conformité avec les orientations définies par l'Université du Kansas Medical Center Institutional Animal Care et l'utilisation Comité.

1. Séparation néonatale maternelle (NMS)

1. Surveiller barrages enceintes quotidienne pour les naissances de litière.
   Remarque: Le jour de la litière est né est considéré P0.
2. Sur P1, enlever le barrage de la cage de la maison et placer dans un récipient secondaire propre.
3. Frottez une poignée de literie entre les mains propres gantée de maintenir parfum de la cage de la maison.
4. Ajouter une profondeur de 1 - 2 cm de la maison de la literie cage dans un endroit propre, marquée de manière appropriée 2 L verre bécher. Ajouter environ la moitié de tout matériel supplémentaire d'enrichissement de literie qui est présent dans la cage d'accueil, par exemple, nestlet, papier froissé, dans le bêcher en verre.
5. Placez délicatement tous les chiots à partir d'une seule portée, individuellement, dans le même bécher.
6. Placer immédiatementle bêcher dans un incubateur maintenu à 33 ^° C et 50% d'humidité pendant 180 min.
7. Retirer le barrage de l'emballage secondaire et son retour à la cage de la maison. Retourner la cage à domicile à son lieu d'habitation approprié dans le vivarium.
8. Répétez cette procédure pour chaque portée subir NMS, en utilisant des gants propres et des récipients secondaires pour chaque portée / barrage.
9. À la fin de la période de séparation de 180 min, retourner les litières à leurs cages à domicile dans le même ordre qu'ils ont été enlevés.
10. Récupérer la cage d'accueil de la première portée qui a été séparé plus tôt dans la journée. Retirer le barrage de la cage de la maison et placer dans un récipient secondaire propre.
11. Retirer le premier bécher de l'incubateur et frotter une poignée de literie entre les mains gantées propres à maintenir le parfum de la cage de la maison lors de la manipulation des chiots.
12. Déplacez doucement les chiots, individuellement, du bécher à la cage de la maison.
13. Retour tout enrichissement et de la literie en restant dans le bécher pourla cage de la maison.
14. Retour du barrage du conteneur secondaire à la cage de la maison et de le retourner à son lieu d'habitation approprié dans le vivarium.
15. Rincer le bécher avec de l'eau et de le retourner à l'incubateur. Utiliser le même bêcher pour chaque portée tout au long de la procédure de séparation.
16. Répétez cette procédure pour chaque portée subir NMS dans le même ordre qu'ils ont été placés dans l'incubateur.
17. Répétez cette procédure pour chaque ensemble subissant litière NMS chaque jour grâce à la P21.
18. Sevrer leur progéniture NMS et naïfs sur P22 en plaçant congénères du même sexe ensemble dans des cages propres complets avec de la nourriture et de l'eau. Naïve chiots doivent être nés et logés dans les mêmes conditions que les souris NMS, mais subissent aucun traitement supplémentaire en dehors des tâches normales d'élevage.

2. péri-Sensibilité mécanique

1. von Frey Appareillage
   1. Apportez les souris à la salle d'examen et de leur permettre d'acclimater 30min tout en restant dans leur cage d'origine.
   2. Préparer la zone de test en plaçant une alèse absorbante sous un fil élevée tableau maille filet (79 cm x 28 cm) qui offre suffisamment d'espace pour permettre à l'enquêteur d'approcher de la face inférieure sans effaroucher les souris, environ 55 cm de hauteur.
   3. Placez jusqu'à 12 souris, individuellement, sous, les chambres de plastique perforés claires (11 cm x 5 cm x 3,5 cm) sur le dessus de la table de treillis métallique. Placez un objet lourd sur le dessus des chambres pour empêcher les souris de se échapper.
   4. Acclimater la souris pour un 30 minutes supplémentaires sur l'écran avant l'évaluation de seuil de retrait.
2. Évaluation périgénitale Sensibilité mécanique
   1. Effectuer la méthode de haut en bas en utilisant un ensemble standard de gradués monofilaments von Frey ^43. Utilisez les monofilaments suivantes: 1,65 g, 2,36 g, 2,83 g, 3,22 g, 3,61 g, 4,08 g, 4,31 g et 4,74 g.
      1. Maintenir la base de la g monofilament 3.22 et exposer le mono rétractéefilament.
         Remarque: Certains modèles peuvent ne pas avoir un monofilament rétractée.
      2. Situer la sonde de telle sorte que le monofilament est orienté verticalement et lorsque la souris est alerte, immobile, et son poids du corps est réparti également entre les pattes de derrière l'appliquer soit à la gauche ou à droite du scrotum, en évitant la ligne médiane, jusqu'à ce qu'une légère pli est observé dans le filament.
      3. Tenez le monofilament en place pendant 10 secondes ou jusqu'à ce que l'animal montre une réponse positive.
         Remarque: Une réponse positive est considérée comme une secousse rapide ou saut en réponse à la demande de monofilament ou léchage ou de comportement de morsure dirigé vers le monofilament. Si les mouvements de la souris lors de l'application de monofilament de 10 sec sans afficher ces comportements, le monofilament doivent être retestés après une 1 min longue période minimale de repos. Si une souris se déplace ni ni présente l'un des comportements énumérés ci-dessus lors de l'application de monofilament de 10 sec, il est considéré comme une réponse négative.
      4. Enregistrer la réponse, positive ou négative, dans un cahier de laboratoire ou un ordinateur portable et répétez cette procédure sur toutes les souris restantes en utilisant la 3,22 g monofilament.
      5. Testez toutes les souris de nouveau en utilisant la prochaine monofilament appropriée. Remarque: Si la souris a présenté une réponse négative au monofilament 3,22 g, 3,61 g appliquer le monofilament de la même manière et enregistrer la réponse. Si la souris a montré une réponse positive à la monofilament 3,22 g, 2,83 g appliquer le monofilament et enregistrer la réponse.
   2. Continuer l'essai de chaque souris en utilisant la prochaine monofilament plus ou moins, selon le cas, pour une période supplémentaire de 4 applications après la première réponse positive est observée.
   3. Souris Retour à cages à domicile.
   4. Utilisez la valeur de la finale monofilament von Frey appliquée dans la série de procès dans des unités de journaux pour calculer un seuil g de retrait de 50% comme décrit dans Chaplan et al. ^43.

title "> 3. acidifiés Bleu de Toluidine Mast Cell coloration

1. Traitement des tissus
   1. On dissèque le tissu de la prostate à partir de ⁴⁴ souris qui ont été perfuses avec intracardiaque glacée paraformaldehyde à 4% ^45. Postfix le tissu dans du paraformaldéhyde 4% pendant 1 heure à température ambiante puis cryoprotect dans 30% de saccharose dans 1 x PBS à 4 ° CO / N.
   2. Préparer un petit (30 ml) de bain d'heptane et le placer sur la glace sèche.
   3. Rincez le tissu de la prostate chez 1x PBS et sécher en utilisant un devoir essuyer la lumière.
   4. Insérez le tissu de la prostate dans l'heptane froid jusqu'à ce qu'il soit congelé.
   5. Immédiatement placer le tissu de la prostate congelé dans un contenant cryomoule milieux de montage et les placer sur carboglace.
   6. Magasin cryomoules à -20 ° C.
   7. Transversalement couper le tissu de la prostate en 7 cryosections um d'épaisseur à l'aide d'un cryostat.
   8. Passer 8-12 cryosections non-série qui couvrent la longueur du tissu, sur des lames de microscope chargés positivement.
   9. Magasin terminé diapositives à -20 ° C jusqu'à leur traitement ultérieur.
2. Préparation acidifiés bleu de toluidine
   1. Ajouter 1 g de bleu de toluidine O à 100 ml 70% d'éthanol et de vortex jusqu'à en solution pour préparer une solution mère à 1%. La solution stock peut être conservé à température ambiante pendant jusqu'à trois semaines.
   2. Ajouter 1 g NaCl à 100 ml d'eau dans un bécher placé sur le dessus d'une plaque d'agitation.
   3. Ajuster le pH de la solution de NaCl en utilisant du HCl 12 M jusqu'à un pH de 0,5 à 1,0 est atteint.
   4. Préparer la solution de travail de 0,25% bleu de toluidine en combinant 8 ml de la solution de bleu de toluidine et 32 ​​ml de la solution de NaCl à 1%. Introduire à la pipette de haut en bas pour assurer l'incorporation totale de la solution stock bleu de toluidine et mélanger à l'aide d'un vortex. La solution de travail doit être fait frais et jeté après utilisation.
3. La coloration de la prostate cryosections
   1. Retirez les diapositives à être transformés du congélateur et laisser équilibrer à température ambiante pendant environ 30 mdans.
   2. Laver les coupes de tissu par immersion individuellement les diapositives pendant environ 1 seconde dans un tube conique de 50 ml contenant une quantité suffisante de PBS 1x faire en sorte que les coupes de tissus montées sur les glissières seront complètement immergés. Laisser les lames sécher à l'air sur une serviette en papier.
   3. Placer les lames dans un bocal de coloration de verre contenant suffisamment de solution de travail bleu de toluidine 0,25% à veiller à ce que les coupes de tissus les diapositives montées seront complètement submergés et incuber pendant 10 - 15 min tandis que sur une plate-forme rocker fixé à 15 tours par minute.
   4. Tremper les lames dans du PBS 1X pour environ 1 sec pour laver l'excès de bleu de toluidine.
   5. Placer les lames dans une boîte à tiroir ou un rack de telle sorte que les coulisseaux se trouvent sur les côtés pour permettre le drainage.
   6. Sécher les lames dans un four à 37 ° C pendant un minimum de 2 heures ou O / N à température ambiante.
   7. Déshydrater diapositives rapidement en utilisant de l'alcool, permettant aux diapositives sécher complètement entre les expositions à l'alcool. Diapositives sec, par une vidange sur une serviette en papier unnd dos d'essuyage et les bords avec un devoir essuyer la lumière.
      1. Plonger les lames dans EtOH à 95% pendant environ 1 sec et laisser sécher complètement. Répétez cette procédure 1 - 10 fois jusqu'à ce que le tissu sèche plus bleu que la pourpre.
      2. Plonger les lames dans EtOH à 100% pendant environ 1 sec et laisser sécher complètement. Répétez cette procédure 1 - 10 fois jusqu'à ce que le tissu est foncé au bleu moyen, mais pas violet.
   8. Fixer la tache en incubant les lames dans 100% de xylène pendant 3 min. Laisser sécher.
   9. Lamelle les diapositives avec du glycérol, PBS, ou supports de montage permanent basé xylène. Égoutter les supports en excès et stocker à température ambiante.
4. Cellules Quantifier Mast
   1. Visualisez les coupes de tissus de toluidine bleui à un grossissement de 20x en utilisant la microscopie optique (figure 2).
   2. Compter le nombre total des mastocytes présents dans la zone et de visualiser la différence entre les mastocytes et non dégranulés dégranulés. 40X magnification peut être nécessaire de confirmer l'état de granulation dans des mastocytes.
      Remarque: les mastocytes non-dégranulés présentent métachromasie dense avec pas ou contour faible nucléaire et / ou ne extrusion granulaire autour de la cellule. Mastocytes dégranulés présenter métachromasie moins intense et d'avoir un aperçu clair évidente du noyau et / ou de granules libres dans le cytoplasme et à l'extérieur de la frontière de la cellule.
   3. Continuer d'évaluer le nombre total de mastocytes non dégranulés dégranulés et dans la totalité de la coupe de tissu en cours. Répétez cette procédure sur au moins 7 sections supplémentaires distincts, couvrant la longueur de chaque tissu.
   4. Calculer le pourcentage de dégranulés (DG) de mastocytes totaux pour chaque tissu / souris selon l'équation suivante: (DG mastocytes / Total mastocytes) x 100.

Résultats

Les souris qui ont subi NMS a montré des preuves de comportement indicatif de CP / CPPS. Lors d'un essai avec une série graduée de monofilaments von Frey, souris NMS 8 semaines-vieux (n = 4) affiché allodynie mécanique périgénitale par rapport à leurs homologues naïfs (n = 5, figure 2). Ceci est démontré qu'une réduction significative (p <0,01; test t de Student) dans le seuil de retrait mécanique qui a suscité une réaction positive des comportements, enregistrée comm...

Discussion

Ce protocole fournit une méthodologie pour utiliser le stress néonatal, sous la forme de NMS, pour induire une symptomatologie indicatif de CP / CPPS chez les souris mâles adultes. Comme les adultes, les souris NEM affichent allodynie mécanique périgénitale importante, ainsi que la preuve de la dégranulation des mastocytes dans le tissu de la prostate. L'utilisation de NMS est une nouvelle approche pour développer un modèle préclinique de CP / CPPS en ce qu'elle reproduit le stress de la vie au début ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pregnant C57BL/6 female mice	Charles River	027	Timed or untimed pregnant females should be monitored daily for in-house birth.
2 L glass beaker(s)	Sigma-Aldrich	CLS10002L	Each NMS litter will be held in the same beaker throughout the 21 day separation period.
VWR Forced Air Incubator, Basic	VWR International	414005-124	The incubator should be held at 33°C and 50% humidity.
Touch Test Sensory Evaluator, Kit of 20 (Semmes-Weinstein Von Frey Aesthesiometer for touch assessment)	Stoelting	58011	The following monofilaments should be used for perigenital sensitivity assessment: 1.65 g, 2.36 g, 2.83 g, 3.22 g, 3.61 g, 4.08 g, 4.31 g, and 4.74 g.
Animal Enclosure (12 mice 6 rats)	IITC	435	Be sure to place a heavy object on top of the individual, acrylic animal enclosures to prevent mice from escaping.
Mesh Stand for mice and rats (12 mice 6 rats)	IITC	410	Place stand on a stable table top for comfortable access.
Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P5493	Dilute the 10x PBS stock to 1x PBS.
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	A 4% paraformaldehyde solution is needed to intracardially perfuse mice and postfix tissue in preparation for mast cell staining.
Sucrose	Sigma-Aldrich	S5016	Cryoprotect fixed tissue in 30% sucrose solution at 4°C overnight.
Heptane	Sigma-Aldrich	246654	Chill heptane on dry ice to freeze tissue.
Standard Cryomold	VWR International	4557	To assist in freezing prostate tissue prior to cryostat sectioning
Tissue-Tek OCT Compound	Sakura	4583	12 x 125 ml
VWR Superfrost Plus Micro Slide	VWR International	48311-703	75 x 25 x 1 mm
Toluidine Blue O	Sigma-Aldrich	198161	Certified by the Biological Stain Commission. Suitable for use as a metachromatic stain for mast cells.
Ethanol, Absolute (200 Proof)	Fisher Scientific	BP2818-4	Molecular Biology Grade, Fisher Bioreagents; 95% and 100% solutions will be needed to dehydrate stained cryosections before mast cell visualization.
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S9888	Acidified NaCl solution should be made fresh before staining cryosections.
GeneMate Sterile 50 ml Centrifuge Tubes	BioExpress	C-3394	Disposable tubes used to mix toulidine blue elements or dip slides into 1xPBS.
Coplin staining dish for 10 slides, with ground glass cover	Fisher Scientific	08-815	Hold up to 10 standard 3 x 1 in. (75 x 25mm) slides back-to-back. Use separate dishes for Toluidine Blue working solution, 95% EtOH, 100% EtOH, and xylene.
Xylenes (Histological)	Fisher Scientific	X3P	Once dehydrated, tissue is cleared with xylene.
Microscope Slide Boxes, 100-Place	VWR International	82003	Boxes can be used for storage and transportation of slides.
Fisherbrand Microscope Slide Box	Fisher Scientific	22-363-400	These slide boxes are typically small enough to fit inside a cryostate.
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	Glycerol is a traditional mounting medium.
Mounting Medium, Richard-Allan Scientific	VWR International	4111	Mounting medium firmly bonds the coverslip to the slide.
Micro Cover Glasses, Rectangular, No. 1	VWR International	48393-106	A coverslip is placed over the dehydrated and cleared tissue to protect the sample.
Light Microscope	Nikon		The Advanced Automated Research Microscope Eclipse 90i, used by our lab, has been discontinued and replaced Eclipse Ni-E.