Valutazione della perigenitale Sensibilità e prostatica Mast attivazione delle cellule in un modello murino di Neonatale separazione materna

Riepilogo

Stiamo misurando la sensibilità e l'albero di attivazione perigenitale cella meccanico nella prostata maschile C57BL / 6 topi che ha subito un paradigma di stress primi anni di vita - la separazione materna neonatale, al fine di indurre un modello preclinico di sindrome da dolore pelvico / cronico prostatite cronica.

Abstract

Prostatite cronica / sindrome da dolore pelvico cronico (CP / CPPS) ha una prevalenza una tantum del 14% ed è la diagnosi urologica più comune per gli uomini di età inferiore ai 50 anni, ma è la malattia dolore pelvico cronico meno compresi e studiati. Un sottoinsieme significativo di pazienti con la relazione del dolore cronico pelvico avendo sperimentato presto lo stress della vita o di abuso, che può notevolmente influenzare il funzionamento e la regolamentazione del (HPA) dell'asse ipotalamo-ipofisi-surrene. L'attivazione dei mastociti, che ha dimostrato di aumentare sia nelle urine e ha espresso secrezioni prostatiche di CP pazienti / CPPS, è parzialmente regolato dall'attivazione valle dell'asse HPA. Neonatale separazione materna (NMS) è stato utilizzato per oltre due decenni a studiare i risultati di stress primi anni di vita in modelli di roditori, compresi i cambiamenti di HPA e la sensibilità viscerale. Qui forniamo un protocollo dettagliato per l'utilizzo di NMS come modello preclinico di CP / CPPS in maschi C57BL / 6 topi. Descriviamo la metodologiaper l'esecuzione di NMS, valutando perigenitale allodinia meccanica, ed evidenza istologica di attivazione dei mastociti. Inoltre forniamo la prova che presto lo stress psicologico può avere effetti di lunga durata sul sistema urogenitale maschile in topi.

Introduzione

Dolore pelvico cronico, non è di per sé una malattia, ma piuttosto un termine associato con il dolore in corso spontaneo e / o evocata vissuta dai pazienti con diagnosi di sindrome dell'intestino irritabile (IBS), cistite interstiziale / sindrome della vescica dolorosa (IC / PBS), vulvodinia, o prostatite cronica / sindrome da dolore pelvico cronico (CP / CPPS). Queste sindromi sono spesso coesistenti e condividere molte caratteristiche che non hanno patologia associata o identificati eziologia, anche se disfunzioni all'interno del sistema immunitario, sistema nervoso centrale e del sistema nervoso periferico ha dimostrato di contribuire al mantenimento e la progressione di questi disturbi ^{1 -3.} I pazienti con dolore pelvico cronico sono più propensi a presentare sintomi di addizionale, non pelvico relativi disturbi del dolore funzionali e disturbi dell'umore, tra cui ansia, depressione, attacchi di panico e ^4-6, che è stato associato con alterata funzionamento del ipotalamo ipofisisurrene (HPA) ^7-10. L'esposizione a presto lo stress della vita o trauma è un fattore di rischio significativo per lo sviluppo di anomalie HPA e associati sindromi da dolore cronico ^10,11 e, in quanto tale, un sottoinsieme significativo di pazienti con disturbi del dolore pelvico funzionali dichiara di aver sperimentato eventi avversi dell'infanzia come l'abuso o negligenza ^12-14.

Modelli di roditori neonatale separazione materna (NMS), che comporta la rimozione dei cuccioli dalla loro madre per un determinato periodo di tempo durante il periodo preweaning, sono stati utilizzati negli ultimi due decenni a studiare i risultati di stress primi anni di vita. In generale, la NMS ha dimostrato di aumentare la HPA asse di attivazione, e comportamenti ansiosi come risultanti, influenzando direttamente l'espressione genica all'interno dell'ipotalamo, così come disturbare regolazione a valle di strutture limbiche ^15-18. Interruzione del buon funzionamento dell'asse HPA ha dimostrato di contribuire a un aumento del colon-retto ^19-22 E vaginale ¹⁶ sensibilità visualizzata roditori NMS modelli, ma nonostante estesa caratterizzazione degli effetti a lungo termine di postnatale infiammazione della vescica ^23-25, l'impatto dello stress primi anni di vita è in gran parte andata non studiato negli organi urogenitali. Pertanto, il seguente studio descrive come eseguire NMS nei topi e poi valutare perigenitale sensibilità meccanica e l'infiltrazione dei mastociti / attivazione nella prostata per validare l'uso di topi maschi NMS come modello preclinico per CP / CPPS.

Di tutti i disturbi del dolore pelvico cronico diagnosi, CP / CPPS è forse la sindrome almeno ben riconosciuto e caratterizzato, pur avendo una prevalenza una tantum di circa il 14% ²⁶ e costo annuo dei pazienti stimati a 4.400 dollari (il doppio di quella di lombalgia o reumatoide artrite ^27). I pazienti con CP rapporto / CPPS dolore nel perineo, del retto, della prostata, pene, testicoli, e / o l'addome ^28, l'esperienza di un hiGrado gher di stress psicologico rispetto ai pazienti di controllo ^29, e comunemente presenti con sintomi di o con diagnosi di comorbidità del dolore o disturbi dell'umore pelvici cronici ^5,29-31. Infezioni ricorrenti, epitelio che perde, l'infiammazione neurogena e autoimmunità sono stati tutti ipotizzato come potenziali cause sottostanti di CP / CPPS ^2,32,33, così come l'attivazione dei mastociti e degranulazione ^34. Espresso secrezioni prostatiche da uomini con CP / CPPS erano aumentati triptasi mastocitaria e fattore di crescita nervoso (NGF) livelli di ^34, e uno studio successivo confermato che triptasi e carbossipeptidasi A (CPA3), un marker di attivazione dei mastociti, sono stati aumentati nel urine dei pazienti CP / CPPS ^35. Il ruolo potenziale di mastociti nella insorgenza e la manutenzione di CP / CPPS è stato un importante centro di ricerca animale su questa sindrome finora. Il modello di roditore più comunemente impiegato utilizzato per studiare CP / CPPS è una prostatite autoimmune sperimentale (EAP) Modello genazionata mediante iniezione sottocutanea di antigene prostatico in adiuvante completo di Freund, che si traduce in vari gradi di infiammazione prostatica seconda specie e ceppo usati ^34,36-39. Infiltrazione dei mastociti e l'attivazione / degranulazione ha dimostrato di aumentare dopo induzione di EAP ^34,35,40. Topi transgenici carenti in entrambi i mastociti ³⁴ o il recettore triptasi PAR2 ³⁵ non sviluppano prostatica sensibilità tattica seguente EAP, a differenza di topi di tipo selvatico EAP. Anche se questo modello preclinico replica molte delle caratteristiche della CP umana / CPPS, il protocollo di induzione non è indicativo della condizione umana, che ha un'eziologia diverse e spesso non comporta l'infiammazione diretta, infezioni o lesioni della prostata.

L'influenza dello stress primi anni di vita sullo sviluppo del CP / CPPS negli esseri umani ha in gran parte andato uninvestigated; tuttavia, uno studio di Hu, et al. ^41, ha dimostrato che men che ha riportato una storia di infanzia fisico, emotivo, e / o di abusi sessuali erano significativamente più probabilità di avere sintomi suggestivi di CP / CPPS. Inoltre, essi hanno dimostrato che sia il dolore e decine urinari sono aumentati nei pazienti con una storia di abuso fisico ed emotivo. Abbiamo precedentemente dimostrato che lo stesso paradigma NMS in femmina C57BL / 6 topi produce ipersensibilità vaginale e l'espressione genica anormale sia nella vagina e vescica suggestiva HPA disfunzionale uscita asse ^16. Questa evidenza combinata con l'alta prevalenza di pazienti CP / CPPS presentano altre patologie concomitanti, tra cui ⁴² IC / PBS e disturbi dell'umore, che sono state più chiaramente dimostrato di essere collegati con l'esposizione allo stress primi anni di vita ^12-14, fornisce il razionale per l'utilizzo di un modello di NMS per indagare CP / CPPS nei topi.

Protocollo

Tutti gli esperimenti descritti in questo protocollo sono conformi alle linee guida NIH in conformità con le linee guida indicate dalla University of Kansas Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee.

1. neonatale materna Separation (NMS)

1. Monitorare le dighe in gravidanza al giorno per le nascite lettiera.
   Nota: Il giorno la lettiera è nato è considerato P0.
2. Il P1, rimuovere la diga dalla gabbia di casa e mettere in un contenitore secondario pulito.
3. Strofinare una manciata di assestamento tra le mani pulite guantate per mantenere il profumo della gabbia di casa.
4. Aggiungere una profondità di 1-2 cm della biancheria da letto gabbia a casa in un ambiente pulito, adeguatamente etichettati 2 bicchiere L vetro. Aggiungere circa metà di qualsiasi arricchimento lettiera aggiuntivo che è presente nella gabbia casa, per esempio, nestlet, carta crespa, il bicchiere di vetro.
5. Posizionare delicatamente tutti i cuccioli da un'unica cucciolata, singolarmente, nello stesso becher.
6. Immediatamente postoil becher in un incubatore tenuto a 33 ^{° C} e 50% di umidità per 180 min.
7. Rimuovere la diga dal contenitore secondario e il suo ritorno alla gabbia di casa. Riportare la gabbia a casa per la sua posizione appropriata alloggiamento all'interno del vivaio.
8. Ripetere questa procedura per ogni disordine in fase di NMS, utilizzando guanti puliti e contenitori secondari per ogni disordine / bacino.
9. Alla fine del periodo di separazione 180 min, restituire cucciolate alle loro gabbie a casa nello stesso ordine in cui sono stati rimossi.
10. Recuperare la gabbia a casa della prima cucciolata che è stato separato in precedenza nel corso della giornata. Rimuovere diga dalla gabbia di casa e mettere in un contenitore secondario pulito.
11. Rimuovere il primo bicchiere dal termostato e strofinare una manciata di assestamento tra le mani guantate pulite per mantenere il profumo della gabbia di casa durante la manipolazione dei cuccioli.
12. Spostare delicatamente i cuccioli, individualmente, dal bicchiere alla gabbia di casa.
13. Rientro arricchimento e biancheria da letto rimanendo nel bicchiere perla gabbia di casa.
14. Ritorno alla diga dal contenitore secondario alla gabbia a casa e tornare alla sua posizione appropriata alloggiamento all'interno del vivaio.
15. Sciacquare il bicchiere con acqua e restituirlo al incubatrice. Utilizzare lo stesso bicchiere per ogni disordine durante tutta la procedura di separazione.
16. Ripetere questa procedura per ogni cucciolata subire NMS nello stesso ordine in cui sono stati messi in incubatrice.
17. Ripetere l'intera procedura per ogni sottoposti cucciolata NMS ogni giorno attraverso P21.
18. Wean cuccioli NMS e naif su P22 mettendo nidiata dello stesso sesso insieme in gabbie pulite complete di cibo e acqua. Cuccioli ingenui dovrebbero nascere e alloggiati sotto le stesse condizioni dei topi NMS, ma subiscono nessun trattamento aggiuntivo al di fuori delle normali attività di allevamento.

2. perigenitale Sensibilità meccanica

1. Setup Apparecchio von Frey
   1. Portare i topi alla camera di prova e consentire loro di acclimatare per 30min pur rimanendo nelle loro gabbie a casa.
   2. Preparare l'area di prova mettendo un underpad assorbente sotto un filo di elevata tavolo maglia-top (79 centimetri x 28 cm) che offre spazio sufficiente per consentire al ricercatore di avvicinarsi dal lato inferiore, senza sorprendente topi, circa 55 cm di altezza.
   3. Posizionare fino a 12 topi, individualmente, in base a chiare, le camere di plastica forata (11 centimetri x 5 cm x 3.5 cm) sulla parte superiore del tavolo rete metallica. Posizionare un oggetto pesante sulla parte superiore delle Camere per evitare che i topi di fuggire.
   4. Acclimatare topi per altri 30 min sullo schermo prima valutazione soglia di ritiro.
2. Valutazione perigenitale sensibilità meccanica
   1. Eseguire il metodo up-down con un set standard di graduati monofilamenti von Frey ^43. Utilizzare i seguenti monofilamenti: 1,65 g, 2,36 g, 2,83 g, 3,22 g, 3,61 g, 4,08 g, 4,31 g, e 4,74 g.
      1. Tenere la base del 3,22 g monofilamento ed esporre il mono retrattafilamento.
         Nota: alcuni modelli non possono avere un monofilamento retratta.
      2. Collocare la sonda in modo che il monofilamento è orientato verticalmente e quando il mouse è vigile, immobile, e il suo peso corporeo è distribuito uniformemente tra le zampe posteriori applicare sia al lato sinistro o destro dello scroto, evitando la linea mediana, fino ad un lieve bend è osservata nel filamento.
      3. Tenere il monofilamento in posizione per 10 secondi o finché l'animale mostra una risposta positiva.
         Nota: Una risposta positiva è considerato uno scatto veloce o salto in risposta all'applicazione monofilamento o leccare o comportamenti mordere diretta verso il monofilamento. Se il mouse si muove durante l'applicazione monofilamento 10 secondi senza visualizzare questi comportamenti, il monofilamento devono essere ritestati dopo un periodo di riposo 1 min a lungo minimo. Se un topo né mosse né mostra uno dei comportamenti elencati sopra durante l'applicazione monofilamento 10 sec, viene considerata una risposta negativa.
      4. Registrare la risposta, negativo o positivo, in un quaderno di laboratorio o portatile e ripetere questa procedura su tutti i rimanenti topi utilizzando il 3,22 g monofilamento.
      5. Testare tutti i topi utilizzando nuovamente la prossima monofilamento appropriata. Nota: Se il mouse esibito una risposta negativa al 3,22 g monofilamento, applicare il 3,61 g monofilamento nello stesso modo e registrare la risposta. Se il mouse esibito una risposta positiva al 3,22 g monofilamento, applicare il 2,83 g monofilamenti e registrare la risposta.
   2. Continuare il test ogni mouse usando la prossima monofilamento maggiore o minore, a seconda dei casi, per altri 4 applicazioni dopo la prima risposta positiva si osserva.
   3. Topi Ritorno a gabbie a casa.
   4. Utilizzare il valore della finale von Frey monofilamento applicata nella serie processo in unità logaritmiche per calcolare una soglia g recesso 50% come descritto nel Chaplan et al. ^43.

title "> 3. Colorazione cellulare acidificati toluidina blu Mast

1. Tissue Processing
   1. Sezionare prostata tessuto ⁴⁴ da topi che sono stati intracardiaca perfusi con ghiacciata 4% paraformaldeide ^45. Postfix il tessuto in 4% paraformaldeide per 1 ora a RT e poi cryoprotect nel 30% di saccarosio in 1x PBS a 4 ° CO / N.
   2. Preparare una piccola (30 ml) bagno di eptano e posizionarlo sul ghiaccio secco.
   3. Sciacquare il tessuto prostatico in 1x PBS e asciugare con un panno leggeri.
   4. Inserire il tessuto prostatico in eptano freddo fino a quando non è congelato.
   5. Porre immediatamente il tessuto prostatico congelato in un cryomold contenente mezzi di montaggio e posto in ghiaccio secco fino congelati.
   6. Conservare cryomolds a -20 ° C.
   7. Trasversalmente tagliare il tessuto prostatico in 7 criosezioni micron di spessore con un criostato.
   8. Inserire 8 - 12 criosezioni non seriali che estendono la lunghezza del tessuto, su vetrini da microscopio caricati positivamente.
   9. Conservare finito diapositive a -20 ° C, fino al procedimento.
2. Preparazione acidificata toluidina blu
   1. Aggiungere 1 g di blu di toluidina O a 100 ml 70% di etanolo e vortice fino a soluzione per preparare una soluzione madre 1%. La soluzione madre può essere conservata a temperatura ambiente per un massimo di tre settimane.
   2. Aggiungere 1 g di NaCl a 100 ml di acqua in un becher posto sulla sommità di una piastra di agitazione.
   3. Regolare il pH della soluzione NaCl usando HCl 12 M fino a pH compreso tra 0,5 - 1,0 si ottiene.
   4. Preparare la Toluidine Blu soluzione di lavoro 0,25% combinando 8 ml della soluzione madre blu di toluidina e 32 ml di soluzione NaCl 1%. Pipetta su e giù per garantire integrazione totale della soluzione stock blu di toluidina e miscelare con un vortice. La soluzione di lavoro deve essere preparata fresca e scartato dopo l'uso.
3. Colorazione criosezioni prostata
   1. Rimuovere i vetrini da elaborare dal freezer e lasciare equilibrare a temperatura ambiente per circa 30 min.
   2. Lavare le sezioni di tessuto immergendo singolarmente i vetrini per circa 1 secondo in una provetta conica da 50 ml contenente un volume sufficiente di 1x PBS per assicurare che le sezioni di tessuto montati scorrevoli saranno completamente sommerse. Lasciare i vetrini per asciugare sul un tovagliolo di carta.
   3. Posizionare i vetrini in una vaschetta di colorazione di vetro contenente abbastanza 0,25% la soluzione di blu di toluidina per garantire che le sezioni di tessuto montati diapositive saranno completamente sommerse e incubare per 10 - 15 minuti, mentre su una sedia a dondolo piattaforma fissato a 15 giri al minuto.
   4. Immergere i vetrini in PBS 1x per circa 1 secondo per lavare l 'eccesso di toluidina blu.
   5. Posizionare i vetrini in una scatola diapositiva o rack in modo tale che i vetrini sono sui loro lati per permettere il drenaggio.
   6. Essiccare i vetrini in un forno a 37 ° C per un minimo di 2 ore o O / N a RT.
   7. Disidratare scivoli rapidamente utilizzando alcol, permettendo i vetrini per asciugare completamente tra le esposizioni di alcol. Diapositive Dry drenando su un tovagliolo di carta unnd spalle asciugandosi e bordi con un light duty wipe.
      1. Immergere i vetrini in 95% EtOH per circa 1 secondo e lasciare asciugare completamente. Ripetere questa procedura 1-10 volte fino tessuto asciuga più azzurro che viola.
      2. Immergere i vetrini in 100% EtOH per circa 1 secondo e lasciare asciugare completamente. Ripetere questa procedura 1-10 volte fino tessuto è scuro al blu medio, ma non viola.
   8. Fissare la macchia incubando i vetrini in 100% xilene per 3 min. Lasciare asciugare.
   9. Coverslip le diapositive con glicerolo, PBS, o un supporto di montaggio permanente basato xilene. Scolare l'eccesso dei media e conservare a temperatura ambiente.
4. Quantificare mastociti
   1. Visualizzare le sezioni di tessuto blu-tinto toluidina a 20X di ingrandimento tramite microscopio ottico (Figura 2).
   2. Contare il numero totale di cellule presenti all'interno della zona visualizzata albero e distinguere tra mastociti non degranulati e degranulati. 40X magnificatione può essere necessario confermare lo stato di granulazione in alcuni mastociti.
      Nota: mastociti non degranulati presentano denso metacromasia senza o con profilo debole nucleare e / o non estrusione granuli intorno alla cellula. Mastociti degranulati esporre meno intenso metacromasia e hanno un evidente chiara descrizione del nucleo e / o granuli liberi all'interno del citoplasma e al di fuori del bordo della cella.
   3. Continuare per valutare il numero totale dei mastociti non degranulati e degranulati nell'interezza della sezione di tessuto corrente. Ripetere questa procedura su almeno 7 ulteriori sezioni distinte, che lo porterà lungo ogni tessuto.
   4. Calcolare la percentuale di degranulati (DG) per mastociti totali per ciascun tessuto / mouse in base alla seguente equazione: (DG mastociti / Totale mastociti) x 100.

Risultati

I topi che hanno subito NMS ha mostrato la prova del comportamento indicativa di CP / CPPS. Quando la prova con una serie graduata di monofilamenti von Frey, a 8 settimane di età topi NMS (n = 4) visualizzato perigenitale allodinia meccanica rispetto alle controparti ingenui (n = 5, figura 2). Ciò è evidenziato come una riduzione significativa (p <0.01; test t) del limite meccanico recesso che ha suscitato una risposta comportamentale positiva, iscritto a scatto veloce o salto in risposta...

Discussione

Questo protocollo prevede una metodologia per l'utilizzo di stress neonatale, sotto forma di NMS, per indurre sintomatologia indicativa di CP / CPPS nei topi maschi adulti. Da adulti, i topi NMS mostrano significativo allodinia meccanica perigenitale, così come prova della degranulazione dei mastociti nel tessuto della prostata. L'uso di NMS è un nuovo approccio allo sviluppo di un modello preclinico di CP / CPPS in quanto riproduce lo stress primi anni di vita che viene spesso segnalato dai pazienti con dolor...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pregnant C57BL/6 female mice	Charles River	027	Timed or untimed pregnant females should be monitored daily for in-house birth.
2 L glass beaker(s)	Sigma-Aldrich	CLS10002L	Each NMS litter will be held in the same beaker throughout the 21 day separation period.
VWR Forced Air Incubator, Basic	VWR International	414005-124	The incubator should be held at 33°C and 50% humidity.
Touch Test Sensory Evaluator, Kit of 20 (Semmes-Weinstein Von Frey Aesthesiometer for touch assessment)	Stoelting	58011	The following monofilaments should be used for perigenital sensitivity assessment: 1.65 g, 2.36 g, 2.83 g, 3.22 g, 3.61 g, 4.08 g, 4.31 g, and 4.74 g.
Animal Enclosure (12 mice 6 rats)	IITC	435	Be sure to place a heavy object on top of the individual, acrylic animal enclosures to prevent mice from escaping.
Mesh Stand for mice and rats (12 mice 6 rats)	IITC	410	Place stand on a stable table top for comfortable access.
Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P5493	Dilute the 10x PBS stock to 1x PBS.
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	A 4% paraformaldehyde solution is needed to intracardially perfuse mice and postfix tissue in preparation for mast cell staining.
Sucrose	Sigma-Aldrich	S5016	Cryoprotect fixed tissue in 30% sucrose solution at 4°C overnight.
Heptane	Sigma-Aldrich	246654	Chill heptane on dry ice to freeze tissue.
Standard Cryomold	VWR International	4557	To assist in freezing prostate tissue prior to cryostat sectioning
Tissue-Tek OCT Compound	Sakura	4583	12 x 125 ml
VWR Superfrost Plus Micro Slide	VWR International	48311-703	75 x 25 x 1 mm
Toluidine Blue O	Sigma-Aldrich	198161	Certified by the Biological Stain Commission. Suitable for use as a metachromatic stain for mast cells.
Ethanol, Absolute (200 Proof)	Fisher Scientific	BP2818-4	Molecular Biology Grade, Fisher Bioreagents; 95% and 100% solutions will be needed to dehydrate stained cryosections before mast cell visualization.
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S9888	Acidified NaCl solution should be made fresh before staining cryosections.
GeneMate Sterile 50 ml Centrifuge Tubes	BioExpress	C-3394	Disposable tubes used to mix toulidine blue elements or dip slides into 1xPBS.
Coplin staining dish for 10 slides, with ground glass cover	Fisher Scientific	08-815	Hold up to 10 standard 3 x 1 in. (75 x 25mm) slides back-to-back. Use separate dishes for Toluidine Blue working solution, 95% EtOH, 100% EtOH, and xylene.
Xylenes (Histological)	Fisher Scientific	X3P	Once dehydrated, tissue is cleared with xylene.
Microscope Slide Boxes, 100-Place	VWR International	82003	Boxes can be used for storage and transportation of slides.
Fisherbrand Microscope Slide Box	Fisher Scientific	22-363-400	These slide boxes are typically small enough to fit inside a cryostate.
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	Glycerol is a traditional mounting medium.
Mounting Medium, Richard-Allan Scientific	VWR International	4111	Mounting medium firmly bonds the coverslip to the slide.
Micro Cover Glasses, Rectangular, No. 1	VWR International	48393-106	A coverslip is placed over the dehydrated and cleared tissue to protect the sample.
Light Microscope	Nikon		The Advanced Automated Research Microscope Eclipse 90i, used by our lab, has been discontinued and replaced Eclipse Ni-E.