בידוד של שברים תת-גרעיניים מועשרים-תא ויראלי שכפול מתאים נורמלים אדם נגוע Adenovirus

Summary

We provide a novel strategy to isolate viral replication compartments (RC) from adenovirus (Ad)-infected human cells. This approach represents a cell-free system that can help to elucidate the molecular mechanisms regulating viral genome replication and expression as well as regulation of viral-host interactions established at the RC.

Abstract

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments through the recruitment of viral and cellular proteins to sites occupied by the viral genome. These sites, called replication compartments (RC), can be considered viral-induced nuclear domains where the viral genome is localized and viral and cellular proteins that participate in replication, transcription and post-transcriptional processing are recruited. Moreover, cellular proteins involved in the antiviral response, such as tumor suppressor proteins, DNA damage response (DDR) components and innate immune response factors are also co-opted to RC. Although RC seem to play a crucial role to promote an efficient and productive replication cycle, a detailed analysis of their composition and associated activities has not been made. To facilitate the study of adenoviral RC and potentially those from other DNA viruses that replicate in the cell nucleus, we adapted a simple procedure based on velocity gradients to isolate Ad RC and established a cell-free system amenable to conduct morphological, functional and compositional studies of these virus-induced subnuclear structures, as well as to study their impact on host-cell interactions.

Introduction

Adenoviruses מכיל הגנום גדילי דנ"א כפול שמשכפל בגרעין התא הנגוע. כאשר ה- DNA הנגיפי נכנס לגרעין, זה localizes סמוך לגופים גרעיניים PML ^1. בעקבות ביטוי גנים נגיפי מוקדם, הארכיטקטורה הגרעינית היא מחדש באופן דרמטי, וישכנע היווצרות של מייקרו-סביבות נגיפיות, המכונה תאים לנגיפיים שכפול (RC) ^2. מאז אדנווירוס RC (מודעות) הם אתרים שבם שכפול הגנום נגיפי וביטוי של גנים נגיפיים מאוחר יתקיימו, הם מספקים סביבה לגיוס של כל הגורמים הנגיפיים וסלולריים הצורך המשתתפים בתהליכים אלה. מעניין, מגוון רחב של חלבונים תאיים אחראים לתגובה אנטי הסלולרית, כגון תגובת הנזק לדנ"א, התגובה החיסונית המולדת ודיכוי גידול הם לאתרים הנגיפיים אלה ² נבחרים. רכזות רגולציה מכאן, יכול להיחשב מודעות RC המקדמות שכפול נגיפי יעיל תוך הסדרה במקבילתגובה תאית אנטי, מצביעה על כך שהמבנים אלה הם מפתח להבנת אינטראקציות תא-מארח וירוס. עם זאת, המנגנונים המולקולריים של היווצרות RC, הרכבם והפעילויות נלוות הם הבינו היטב.

Adenoviral RC, כמו גם RC מוירוסים DNA אחרים שלשכפל בגרעין אינם קשור לקרומים, בניגוד לRC cytoplasmic ^3. יתר על כן, מבנים מושרה וירוס אלה עשויים להיות מורכבים כולו מחלבונים וחומצות גרעין. RC נוצר בתאים נגועים בווירוסי RNA (בדרך כלל מכונה מפעלים נגיפיים) היה מבודד, מנצל הלוקליזציה שלהם cytoplasmic ומעמד קרום הנכנס, אשר הקלה המורפולוגיות מפורטות שלהם, אפיון פונקציונלי ויוכימיים ^4.

למיטב ידיעתנו, RC הנגיפי גרעיני לא היה מבודד, אולי בשל המורכבות של הארכיטקטורה והיעדר הגרעיניים של מטר intranuclearembranes שיאפשר בידודם. מחקרם הסתמך במקום על מיקרוסקופיה immunofluorescence, דגים ומיקרוסקופים אלקטרונים הילוכים. עם זאת, למרות סיבוכים הגלומים לבידוד מבני subnuclear, תחומים גרעיניים אחרים כגון nucleoli וגופים קחל היו מבודדים לפני ^5,6. מאז nucleoli וRC שניהם מורכבים מחלבונים וחומצות גרעין, ויש קוטר בין 0.5-5 מיקרומטר, שערנו כי RC צריך להיות גם נוח לבידוד. לכן, על מנת לאפיין את ההרכב המולקולרי ופונקציות הקשורות לRC מדויק יותר, הקמנו שיטה חדשה לבודד את השברים subnuclear מועשרים בRC. לשם כך, אנחנו מוכנים שברים תת-גרעיני באמצעות הדרגתיים מהירות וכריות סוכרוז דומה לנהלים המשמשים לבודד nucleoli ⁷ או תחומים גרעיניים אחרים ⁶ והקמנו מערכת תא ללא שמאפשרת הלימוד של ההרכב המולקולרי ופעילויות הקשורות לRC. טכניקה זו ולכן צריכה לקדם את ההבנה של אינטראקציות תא-מארח וירוס ומהווה כלי רב עוצמה שצריכה גם להקל על הניתוח מפורט של RC מוירוסים אחרים שלשכפל בגרעין ולגרום להיווצרות של תאי שכפול של ממדים דומים לאלה שנוצרו בadenovirus- נגועים בתאים, כגון, herpesviruses, papillomaviruses או polyomaviruses.

Protocol

תרבית תאי 1. HFF ומודעות-זיהום

1. הפץ וירוס Ad5 WT בmonolayers של HEK-293 תאים וכיילו כיחידות ניאון יוצרים (FFU) בתאי HFF כפי שתואר לעיל ^8.
2. לגדול fibroblasts העורלה האדם (HFF) ב 10 מיליליטר של DMEM 10% שור עוברי סרום (FBS) במנות מ"מ סטרילי תרבות 100 על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO / ₂ בחממה humidified. לקבוע את המספר הסלולרי באמצעות תא נויבאואר על ידי ספירת תאים בארבעת סטים של 16 מ"ר. מספר התאים למ"ל מתקבל על ידי חישוב מספר התאים הממוצע בארבעת סטים של 16 מ"ר והכפלת מספר זה ב -10 ^4. עבור כל זיהום שלאחר זמן הכלול בשלב 1.3, להשתמש 1 x 10 ⁷ תאי HFF.
3. מוק להדביק או להדביק תאי HFF עם סוג אדנווירוס 5 (Ad5) wild-type (WT) (H5pg4100 ⁸⁾ במנות בתרבית רקמת 100 מ"מ באמצעות 1 מיליליטר של Ad5 בDMEM לכל צלחת במשרד פנים של 30 פוקוס יצירת יחידה, או FFU , לכל תא. דגירה עבור שעה 2 באהחממת umidified תרבית תאים על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2, נדנדה בזהירות את המנות בכל 15 דקות על מנת להבטיח הפצה הומוגנית של הבידוד הווירוס על התאים. לאחר פרק זמן זה, להסיר את המדיום ולהוסיף DMEM הטרי בתוספת 10% FBS ו דגירה של 16, 24 או 36 שעות בתרבית תאי חממת humidified על 37 ^מעלות צלזיוס, 5% CO _2. המשך לשלב 2.1.

2. הכנת שברים תת-גרעיניים מועשר בAdenovirus RC

1. נגוע Ad5 הקציר או תאי HFF נגועים מדומים עם scrapper תא ולאסוף את התאים בצינורות צנטריפוגות סטרילי. לקבוע את המספר הסלולרי כמו בשלב 1.2. להשתמש 1 x 10 ⁷ תאים לכל זיהום שלאחר זמן מסוים בשלב 1.3.
2. צנטריפוגה התאים ב 220 XG, 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
3. Resuspend התא גלולה בPBS קר כקרח (137 מ"מ NaCl, 2.7 מ"מ KCl, 10 מ"מ Na _{2 4} HPO ו -1.8 מ"מ KH ₂ PO _4). תא גלולה לשטוףשל 3 פעמים באמצעות 5 מיליליטר של PBS קר כקרח לכל לשטוף. לצורך כך, צנטריפוגה התאים ב 220 XG, 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, למזוג וזורקים supernatant (SN), וresuspend התא גלולה על ידי pipetting העדין.
4. לשבש את קרום הפלזמה, resuspend התא גלולה ב700 μ l של חיץ hypotonic קר כקרח (10 מ"מ HEPES pH 7.9, 10 מ"מ KCl, 1.5 מ"מ MgCl _2, 0.5 מ"מ DTT, 20 μ g / ml phenylmethylsulfonyl פלואוריד (PMSF) , תערובת של ציסטאין, סרין, תראונין מעכבי פרוטאז וaspartyl כולל 10 גרם / מיליליטר מעכבי טריפסין לבלב שור, 10 גר '/ מיליליטר pepstatin μ μ ו -10 גר' / מיליליטר -acetyl-L-leucyl-L-leucyl-L N μ -argininal) ולתת לתאים להתנפח על קרח 3 שעות.
5. Lyse התאים באמצעות homogenizer עם העלי טפלון סוג רפוי. בצע 80 dounce שבץ ודגימות צג כל 20 משיכות על ידי מיקרוסקופ שדה הבהיר כדי להבטיח שכל התאים כבר lysed, אבל שיש לי הגרעינים nםוריה נפגע או מקרע.
6. צנטריפוגה homogenate התא ב 300 XG, 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. אחסן את SN כחלק cytoplasmic ב -20 מעלות צלזיוס בצינור צנטריפוגות.
7. כדי להסיר סלולרית פסולת מגרעינים, resuspend גלולה ב750 μ l של פתרון 1 (S1) (0.25 מ 'סוכרוז, 10 מ"מ MgCl ₂ 20 μ g מעכבים / מיליליטר PMSF, תערובת של ציסטאין, סרין, תראונין ופרוטאז aspartyl כולל 10 μ g / ml מעכב שור לבלב טריפסין, 10 μ g מיליליטר pepstatin / 10 וμ g / ml N -acetyl-L-leucyl-L-leucyl-L-argininal) ושכבה מעל נפח שווה של פתרון 2 (S2) (0.35 מ 'סוכרוז, 0.5 מ"מ MgCl _2, 20 μ g / ml PMSF, תערובת של ציסטאין, סרין, תראונין מעכבי פרוטאז וaspartyl כוללים 10 μ g / מיליליטר מעכבי טריפסין לבלב שור, 10 μ g / ml pepstatin ו -10 μ g / ml N -acetyl-L-leucyl-L-leucyl-L-argininal). Centrifuge ב1,400 XG, 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
8. מחק את SN באמצעות micropipette. הימנע להפריע גלולה.
9. Resuspend גלולה המכילה גרעינים מבודדים ב750 μ l של S2.
10. כדי לבודד שברים subnuclear מועשרים באדנווירוס RC (RCF), sonicate resuspended גרעינים עם אמבטיה קולית, באמצעות שתי פעימות 5 דקות, או עד שכל הגרעינים lysed כפי שנצפו על ידי מיקרוסקופ שדה הבהיר. השתמש בקרח באמבטיה קולית לפי צורך כדי לשמור על דגימות באו מתחת ל -4 מעלות צלזיוס.
11. שכבת גרעיני sonicated על נפח שווה של פתרון 3 (S3) (0.88 M סוכרוז, 0.5 מ"מ MgCl ₂₎ ו צנטריפוגות ב3,000 XG, 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. אחסן את supernatant 1.5 מיליליטר כחלק nucleoplasmic (NPL) ב -70 מעלות צלזיוס. Resuspend גלולה ב700 μ l של S2 וחנות כRCF ב -70 מעלות צלזיוס.

3. ניתוח המערבי כתם של RCF

הערה: לניתוח המערבי כתם של שברים של NPL וRCFet הצידה 640 μ l לNPL ו -300 μ l לRCF מהנפח הכולל שהושג בשלב 2.11.

1. מערבבים 15 μ l של כל חלק subnuclear ב2x Laemmli חיץ (4% SDS, גליצרול 20%, 10% 2-mercaptoethanol, bromophenol 0.004% כחולים, 0.125 M טריס HCl pH 6.8) ורתיחה ב 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. טען את הדגימות באלקטרופורזה נתרן 10% dodecyl סולפט-polyacrylamide ג'ל (SDS-PAGE) denaturing ג'ל וחלבונים נפרדים עבור 1.5 שעות, בטמפרטורה של 20 milliamperes (MA).
2. העבר את החלבונים על ידי electroblotting תמורת 1.5 שעות ב 400 מילי-אמפר על difluoride polyvinylidene ממברנות (PVDF).
3. לחסום קרום לשעה 2 ב RT באמצעות חלב יבש ללא שומן 3% ב- PBS.
4. דגירה O / N במעלות צלזיוס 4 עם נוגדן ראשוני נגד חלבון נגיפי E2A מחייב DNA (B6-8 ⁹⁾ בדילול 1: 500 בחלב ללא שומן יבש / 0.3% PBS.
5. קרום לשטוף 3 פעמים עם PBS / 0.1% Tween 20 במשך 10 דקות.
6. דגירה הממברנה עם IgG נגד עכבר המשניtibody מצמידים peroxidase סוס-צנון (HRP) בדילול 1: 10,000 ב PBS עבור שעה 2 ב RT.
7. שטוף את הקרום 3 פעמים עם PBS / 0.1% Tween 20 במשך 10 דקות.
8. לפתח הקרום באמצעות chemiluminescence משופרת וצילומי רנטגן.

4. ויראלי DNA איתור בRCF

הערה: לבידוד DNA משני השברים NPL וRCF, להשתמש 210 μ l לNPL וμ 100 ליטר לRCF מהנפח הכולל שהושג בשלב 2.11.

1. דגירה שברים תת-גרעיניים עבור שעה 1 ב 55 מעלות צלזיוס עם 1 מ"ג / מיליליטר של proteinase K ו 0.5% Tween 20.
2. להשבית K proteinase ידי דוגרים הדגימות במשך 10 דקות על 95 מעלות צלזיוס.
3. צנטריפוגה דגימות ב20,000 XG, ב RT למשך 2 דקות.
4. לאסוף SN. להאיץ את ה- DNA עם 1/10 נפח של נתרן אצטט 3M ונפח אחד של isopropanol, O / N ב 4 מעלות צלזיוס.
5. צנטריפוגה דגימות ב20,000 XG, ב RT במשך 10 דקות.
6. מחק את u SNלשיר micropipette. שטוף את הכדור עם 70% אתנול ו צנטריפוגות ב 20,000 XG, 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
7. Resuspend DNA ב 10 μ l 10 מ"מ טריס-HCl pH 7.4
8. לכמת DNA באמצעות ספקטרופוטומטר על ידי מדידת הצפיפות האופטית (OD) ב 260 ננומטר.
9. כדי להגביר DNA הנגיפי, להשתמש של DNA 100 ng כל חלק מן subnuclear בתגובת PCR סטנדרטית באמצעות פולימראז תקי DNA ב -25 μ l של נפח תגובה עם פריימרים המאפשרים ההגברה של אזור בתוך יחידת השעתוק המאוחר סרן, מנוקלאוטיד 7273 ל נוקלאוטיד 7353 (81 נ"ב) (Fw: GAGCGAGGTGTGGGTGAGC; Rv: GGATGCGACGACACTGACTTCA). השתמש בתנאים הבאים המחזור: denaturation הראשוני 3 דקות ב 95 מעלות צלזיוס, ואחריו 20 מחזורים של הגברה (1 דקות ב 95 מעלות צלזיוס, חישול 1 דקות במעלות צלזיוס 62 והארכה למשך 30 שניות על 72 מעלות צלזיוס) וצעד ארכה סופי ל 3 דקות ב 72 מעלות צלזיוס.
10. הפעל את מוצר ה- PCR בג'ל agarose 2%, ב -90 V. כתם עם ethidiumרומיד ברמה של 0.5 μ / מיליליטר ריכוז סופי גרם ולדמיין DNA כדי לאשש העשרת ה- DNA נגיפית בRCF. ידית ברומיד בזהירות רבה ותמיד לוודא ללבוש כפפות, כמתחם הזה הוא mutagen חזק. השלך ברומיד על פי הנחיות מוסדיות.

5. ויראלי המאוחר mRNA איתור בRCF

הערה: לבידוד RNA משני השברים NPL וRCF, להשתמש 640 μ l לNPL ו -300 μ l לRCF מהנפח הכולל שהושג בשלב 2.11.

1. לבודד RNA משברי subnuclear באמצעות Trizol פי עם הוראות היצרן. Resuspend RNA ב -50 μ l של DEPC מים -treated (diethilpyrocarbonate).
2. לכמת את RNA באמצעות ספקטרופוטומטר למדוד את OD ב 260 ננומטר (ז כ 3 μ מתקבל). אחסן את RNA ב -50 ng / μ aliquots l ב -70 מעלות צלזיוס.
3. בדוק RNA המטוהרעל היעדריו של זיהום הדנ"א על ​​ידי ביצוע תגובת PCR שליטה בהעדר טרנסקריפטאז (RT), באמצעות 5 ננוגרם של רנ"א הכל ותנאי המחזור מתואר בשלב 4.9.
   1. אם זיהום הדנ"א נעדר צריך להיות מיוצר לא amplicon. אם זיהום הדנ"א הוא הווה, דגירה הדגימות עם 10 U DNase אני, 10 U של מעכב RNase, 0.1 מ 'טריס-HCl pH 8.3, 0.5 M KCl ו -15 מ"מ MgCl ₂ למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. המשך מחדש לבודד RNA כמו בשלב 5.1.
4. כדי לנתח mRNA ויראלי הקשורים לRCF, להגביר של RNA 100 ng כל חלק מן subnuclear על ידי RT-PCR באמצעות פריימרים נועדו לזהות mRNA מאוחר adenoviral ממשפחות גנים שונים (טבלה 1).
   1. לשעתוק לאחור (RT), להשתמש של RNA 100 ng, מכל חלק subnuclear בתגובת RT סטנדרטי באמצעות אנזים M-MuLV RT 20 μ l של נפח תגובה עבור שעה 1 ב 42 מעלות צלזיוס ו -10 דקות ב -70 מעלות צלזיוס.
   2. להגברה, להשתמש 1l μ של cDNA בPCR תגובות, כמו בשלב 4.9. השתמש בתנאים הבאים המחזור: denaturation הראשוני 3 דקות ב 95 מעלות צלזיוס, ואחריו 25 מחזורים של הגברה (1 דקות ב 95 מעלות צלזיוס, חישול 1 דקות בטמפרטורה שצוינה בטבלה 1 והארכה למשך 30 שניות על 72 מעלות צלזיוס) ו צעד ארכה סופי 3 דקות ב 72 מעלות צלזיוס.
5. הפעל את מוצרי RT-PCR בג'ל agarose 2%, ב 90 ג 'ו' כתם עם ברומיד ברמה של 0.5 μ / מיליליטר ריכוז סופי גרם ולדמיין לאשש עמותת mRNA מאוחר נגיפית לRCF. ידית ברומיד כפי שצוין בשלב 4.10.

6. ויזואליזציה Immunofluorescence של RCF

הערה: לעסוק בהליך זה תחת הזרימה למינרית כדי למנוע זיהום של הדגימות עם כל חלקיקי אבק, ולסנן את כל הפתרונות לפני השימוש.

1. מקום 5 μ l של חלק RCF שהושג בשלב 2.10 חמוריםctly בשקופית מצופה silane.
2. בואו יבש מקום לכ -5 דקות ב RT.
3. Re-מימה ידי לאט ובעקיפין pipetting 500 ליטר μ של PBS בירידה ליד מקום RCF ולתת לה לזרום על ידי הטיית השקופיות. מסננים את PBS העודף מהצד.
4. בלוק על ידי כיסוי המדגם עם 500 μ l של / 5% אלבומין בסרום שור PBS (BSA) לשעה 2 ב RT.
5. לשטוף את השקופית 3 פעמים על ידי בעדינות ובעקיפין pipetting 500 ליטר μ של PBS על המדגם. הטה את השקופית כדי לנקז את PBS העודף.
6. דגירה המדגם עם נוגדן ראשוני נגד החלבון הנגיפי E2A מחייב DNA (B6-8 ⁹⁾ בדילול 1: 500 ב PBS עבור שעה 2 ב RT. מכסה את המדגם הבחין עם 20 μ l של פתרון נוגדן דגירה בתא לח כדי למנוע התייבשות.
7. לשטוף את המדגם 3 פעמים עם PBS Tween / 0.02% 20 על ידי בעדינות ובעקיפין pipetting 500 μ l של PBS על המדגם. הטה את השקופית כדי לנקז את לשעברפתרון לשטוף סס.
8. דגירה הדגימות עם נוגדן אנטי עכבר IgG המשני מצמידים את fluorophore שהלהיב ב 488 ננומטר בדילול 1: 2,000 ב PBS, עבור שעה 1 ב 4 מעלות צלזיוס. מכסה את המדגם הבחין עם 20 μ l של פתרון נוגדן דגירה בתא לח כדי למנוע התייבשות.
9. לשטוף את המדגם 3 פעמים עם PBS Tween / 0.02% 20 על ידי בעדינות ובעקיפין pipetting 500 μ l של PBS על המדגם. הטה את השקופית כדי לנקז את הפתרון לשטוף העודף.
10. מכסה את המדגם הבחין בשקופית עם coverslip באמצעות 2 μ l גליצרול / 10% PBS כהרכבה בינונית. חותם עם לק ברור וחנות אל -20 מעלות צלזיוס.
11. ניתוח הדגימות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, עם מטרת 63x ומספרי צמצם 1.4 (NA) באורך גל של 488 ננומטר.

תוצאות

מאז תאים נגיפיים שכפול (RC) הם מבנים הנוצרים על-נגיפיים subnuclear המורכב מחלבונים וחומצות גרעין, בדומה לתחומים אחרים גרעיניים, הם הוכיחו שניתנים לבידוד על ידי מילויים מהירות המבוססים על תכונות ביוכימיות. צעדים קריטיים בפרוטוקול חלוקה הם באיור 1. בכל שלב הדגימות צ...

Discussion

In order to elucidate the molecular mechanisms that govern regulation of cellular activities by viral infection understanding the composition and activities associated with RC would be instrumental. Therefore, to make a detailed analysis of RC, we established a cell-free system that takes advantage of the size and biochemical composition of these virus-induced structures, to isolate subnuclear fractions enriched with RC using a simple procedure that relies on velocity gradients with sucrose cushions. Critical steps of th...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Gibco	12100-046	Warm in 37 ºC water bath before use
Fetal Bovine Serum	Gibco	12484-028
Sucrose, Ultra Pure	Research Organics	0928S	Prepare a 2.55 M stock solution and store at 4 ºC
Dounce homogenizer	Kontess Glass Company	884900-0000
Branson 1800 Ultrasonic Bath	Branson	Z769533 SIGMA	Turn on 15 min before use.
Goat anti-Mouse IgG1 Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	Life Technologies	A-21121	Use at a 1:2,000 dilution in PBS
Silane-Prep Slides	Sigma	S4651-72EA	Open in a laminar flow cabinet
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate	Pierce ThermoScientific	34080