Adenovirüs ile enfekte Normal İnsan Hücreleri Viral Çoğaltma Bölme zenginleştirilmiş Alt nükleer Kesirler izolasyonu

Özet

We provide a novel strategy to isolate viral replication compartments (RC) from adenovirus (Ad)-infected human cells. This approach represents a cell-free system that can help to elucidate the molecular mechanisms regulating viral genome replication and expression as well as regulation of viral-host interactions established at the RC.

Özet

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments through the recruitment of viral and cellular proteins to sites occupied by the viral genome. These sites, called replication compartments (RC), can be considered viral-induced nuclear domains where the viral genome is localized and viral and cellular proteins that participate in replication, transcription and post-transcriptional processing are recruited. Moreover, cellular proteins involved in the antiviral response, such as tumor suppressor proteins, DNA damage response (DDR) components and innate immune response factors are also co-opted to RC. Although RC seem to play a crucial role to promote an efficient and productive replication cycle, a detailed analysis of their composition and associated activities has not been made. To facilitate the study of adenoviral RC and potentially those from other DNA viruses that replicate in the cell nucleus, we adapted a simple procedure based on velocity gradients to isolate Ad RC and established a cell-free system amenable to conduct morphological, functional and compositional studies of these virus-induced subnuclear structures, as well as to study their impact on host-cell interactions.

Giriş

Adenovirüsler, enfekte hücre çekirdeğinde replike olan bir çift sarmallı DNA genomunu içerir. Viral DNA çekirdeği girdiğinde, PML nükleer organları ¹ bitişik lokalize. Viral erken gen ifadesinin ardından, nükleer mimarisi dramatik olarak adlandırılan viral mikroçevrelerde oluşumunu uyaran, yeniden düzenlenir viral çoğaltma Bölmeler (RC) ^2. Adenovirüs (Ad) RC viral genomun replikasyonu ve viral geç genlerinin sentezlenmesi gerçekleşecek siteleri olduğundan, bu süreçlere katılmak için gerekli tüm viral ve hücresel faktörlerin alımı için bir ortam sağlar. İlginç bir şekilde, örneğin DNA hasar cevap olarak hücresel antiviral yanıt sorumlu olan hücresel proteinlerin, çeşitli doğal immün cevabı ve tümör bastırma yandaşlaştırılmıştır bu viral sitelerinin ² için vardır. Eş zamanlı olarak düzenlenmesi sırasında etkin viral replikasyon teşvik Dolayısıyla, Reklam RC kabul edilebilir düzenleyici hubBu yapıların virüs konak hücre etkileşimleri anlamak için anahtar olduğunu belirten hücresel antiviral yanıt. Bununla birlikte, RC oluşumunun moleküler mekanizmalar, bunların kompozisyonu ve ilgili faaliyetler tam olarak anlaşılamamıştır.

Çekirdeğin içinde replike diğer DNA virüslerinden adenoviral RC, hem de RC sitoplazmik RC ³ aksine, membranlara ilişkili değildir. Ayrıca, bu virüs kaynaklı yapıların protein ve nükleik asitlerin bütünüyle oluşan olması muhtemeldir. RNA virüsleri ile enfekte edilmiş hücrelerde oluşan RC, ayrıntılı morfolojik ve fonksiyonel ve biyokimyasal karakterizasyonu ⁴ kolaylaştırmıştır sitoplazmik lokalizasyonu ve membrana bağlı durum, yararlanarak, izole edilmiştir (genellikle viral fabrikaları olarak da adlandırılır).

Bildiğimiz kadarıyla, nükleer viral RC belki de intranükleer m nükleer mimarisi ve yokluğu karmaşıklığı, izole edilmemişOnların izolasyon kolaylaştıracak embranes. Onların çalışma yerine mikroskobik, FISH ve transmisyon elektron mikroskobu güvendi. Ancak, subnuclear yapıların izole doğasında komplikasyonları rağmen, bu tür nukleoli ve Cajal Organları gibi diğer nükleer etki ^5,6 öncesinde izole edilmiştir. Çekirdekçikler ve RC her iki protein ve nükleik asitten oluşan ve 0.5 arasında bir çapa sahip olması nedeniyle - 5 um, RC de izolasyon için uygun olmalıdır varsayıldı. Bu nedenle, daha kesin olarak RC ilişkili moleküler bileşim ve fonksiyonlarını karakterize etmek amacıyla biz RC ile zenginleştirilmiş çekirdek içi kısımlar izole etmek için yeni bir yöntem kurulmuştur. Bu amaçla, nükleollü ⁷ ya da diğer nükleer etki ⁶ izole etmek için kullanılan prosedürlerin benzer hız gradyanları ve sükroz yastıkları kullanılarak çekirdek altı fraksiyonlar hazırlandı ve moleküler bileşimin çalışma ve ilişkili aktiviteleri sağlayan bir hücre içermeyen bir sistem kurulmuşturRC. Bu teknik, bu nedenle virüs konak hücre etkileşimleri anlayışı ilerletmek ve aynı zamanda çekirdeğinde çoğaltmak diğer virüslerden RC ayrıntılı analizini kolaylaştırmak ve adenovirüs- oluşan benzer boyutlardaki çoğaltma bölmelerinin oluşumuna neden gereken güçlü bir araç temsil etmelidir örneğin, herpes, papilloma ya polyomavirusları olarak enfekte olmuş hücreleri.

Protokol

1. HFF Hücre Kültürü ve Ad-enfeksiyon

1. Daha önce tarif edildiği ^{gibi, 8} HFF hücreleri üzerinde floresan oluşturucu birim (FFU) halinde HEK-293 hücrelerinden ve titre mono tabakaları Ad5 WT virüsü yayar.
2. Nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde DMEM /% 10 fetal sığır 37 ° C'de steril kültür 100 mm'lik tabaklar içerisinde serum (FBS) ve% 5 _CO2, 10 ml insan alın derisi fibroblastları (HFF) büyütün. Dört 16 kare setleri hücreleri sayılarak bir Neubauer odasına kullanarak hücre sayısını belirler. Ml başına hücre sayısı dört 16-kare setleri hücrelerin ortalama sayısını hesaplamak ve 10 ⁴ ile bu sayı çarpımı ile elde edilir. Adımda 1.3 dahil her zaman sonrası enfeksiyon için, 1 x 10 ⁷ HFF hücreleri kullanın.
3. Mock-enfekte oluşturucu birim 30 odak MOl'de tabak başına DMEM Ad5 1 ml ile 100 mm doku kültürü çanakları içinde adenovirüs tip 5 (Ad5) vahşi-tipi (WT) (H5pg4100 ⁸⁾ ile HFF hücreleri enfekte veya FFU veya hücre başına. Ah 2 saat süreyle inkübe edindikkatle yemeklere her 15 dakikada bir sallanan umidified 37 ° C'de hücre kültürü inkübatörü% 5 _CO2, hücreleri üzerinde virüs aşı maddesi homojen bir dağılım sağlamak için. Bu süre sonunda, ortam çıkarın ve% 10 FBS ile desteklenmiş taze DMEM ve _CO2 ³⁷ ° C'de nemlendirilmiş bir hücre kültürü inkübatöründe 16, 24 ya da 36 saat süreyle inkübe edilir ve% 5. 2.1 adıma geçin.

Adenovirüs RC ile zenginleştirilmiştir Alt nükleer Kesirler 2. Hazırlık

1. Hasat Ad5-enfekte veya hücre kavgacı ile sahte enfekte HFF hücreleri ve steril santrifüj tüplerine hücreleri toplamak. Adım 1.2 olarak hücre sayısını belirler. Adım 1.3 'de belirtilen her zaman sonrası enfeksiyon için 1 x 10 ⁷ hücre kullanın.
2. 220 x g'de 5 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüj hücreleri.
3. Buz soğukluğunda PBS hücre pelletini (137 mM NaCI, 2.7 mM KCI, 10 mM _Na-2 HPO ₄ ve 1,8 mM KH ₂ PO _4). Yıkama Hücre peletis, yıkama başına buz soğukluğunda 5 ml PBS ile 3 kez. Bu amaçla, santrifüj 220 x g'de 5 dakika, tortusundan 4 ° C'de hücreleri ve yüzer (SN) atmak ve nazik pipetleme hücre pelletini.
4. Plazma membranını bozmak için, 700 hücre topağı buz soğukluğunda hipotonik tampon maddesi (10 mM HEPES pH 7.9, 10 mM KCI, 1.5 mM _MgCI2, 0.5 mM DTT, 20 μ ug / ml fenilmetilsülfonil florid (PMSF) u tekrar süspansiyon , 10 μ / ml sığır pankreatik tripsin inhibitörü, 10 μ ug / ml pepstatin A ve 10 μ ug / ml N-asetil-L-leusil-L-leusil-L dahil olmak üzere sistein, serin, treonin ve aspartil proteaz inhibitörlerinin bir karışımı, -argininal) ve hücreler 3 saat boyunca buz üzerinde şişmesi sağlar.
5. Lyse bir gevşek A tipi teflon havan ile homojenleştirici kullanılarak hücreler. Vuruşları ve parlak alan mikroskobu ile her 20 vuruş tüm hücreleri parçalanmış edilmiş olmasını sağlamak için monitör örneklerinin Dounce 80 gerçekleştirin, ancak çekirdekler n varhasarlı veya kopmuş ot.
6. 300 x g'de 5 dakika boyunca 4 ° C'de, hücre homojenatı santrifüjleyin. Bir santrifüj tüpüne -20 ºC 'de sitoplazmik fraksiyon olarak SN saklayın.
7. Çözelti 1 (S1) 750 μ l (tekrar süspansiyon, çekirdeklerden pelet, selüler artığın ayrılması için 0.25 M sukroz, 10 mM MgC 10 de dahil olmak üzere _{2 ila 20} μ / ml PMSF, sistein, serin, bir treonin ve kanşım aspartil proteaz inhibitörleri μ ug / ml sığır pankreatik tripsin inhibitörü, 10 μ ug / ml pepstatin A ve 10 μ ug / ml N-asetil-L-leusil-L-leusil-L-argininal) ve çözelti, 2 eşit bir hacmi boyunca tabaka (S2) (0.35 M sukroz, 0.5 _mM MgCI2, 20 μ / ml PMSF, sistein, serin, 10 μ / ml sığır pankreatik tripsin inhibitörü, 10 μ ug / ml pepstatin A ve 10 μ içeren treonin ve aspartil proteaz inhibitörlerinin bir karışımı, ug / ml N-asetil-L-leusil-L-leusil-L-argininal). Centr1400 x g'de 5 dakika boyunca 4 ° C'de ifuge.
8. Bir mikropipet kullanarak SN atın. Pelet rahatsız etmemek.
9. S2 750 μ l izole çekirdek içeren pelletini.
10. Adenovirüs RC (RCF) ile zenginleştirilmiş çekirdek içi fraksiyonları izole edilmesi için, iki adet 5 dakikalık darbeleri kullanılarak, ultrasonik bir banyoda çekirdekler yeniden süspansiyon haline ses dalgalarına maruz veya parlak alan mikroskopisi ile gözlendiği haliyle, tüm çekirdek lize kadar devam eder. C ya da 4 ° altında örnekleri tutmak için gerektiğinde ultrasonik banyoda buz kullanın.
11. Çözelti 3 (S3) 3000 xg'de (0.88 M sukroz, 0.5 mM _MgCl2) ve santrifüj, 10 dakika boyunca 4 ° C eşit hacimde üzerinde sonike çekirdekleri katman. -70 ºC nucleoplasmic fraksiyonu (Npl) olarak 1.5 ml süpernatant saklayın. -70 ºC RCF olarak S2 700 μ l pelet ve mağaza tekrar.

RCF 3. Western Blot Analizleri

Not: TGA ve RCF fraksiyonlar s Western Blot analizi içinet kenara 640 Npl için l ve adım 2.11 elde edilen toplam hacim gelen RCF 300 μ l u.

1. 5 dakika boyunca 95 ° C 'de 15 μ Laemmli tamponu 2x, her çekirdek içi fraksiyonun l (% 4 SDS,% 20 gliserol,% 10 2-merkaptoetanol,% 0.004 bromofenol mavisi, 0,125 M Tris-HCl, pH 6.8) ve kaynatın karıştırın. Bir% 10 sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) 20 miliamperlik (mA), 1.5 saat için jel ve ayrı proteinleri denatüre örnekleri yükleyin.
2. Poliviniliden diflorür (PVDF) membran üzerinde 400 mA'da 1.5 saat elektro proteinleri aktarın.
3. RT PBS içinde% 3 yağsız kuru süt ile 2 saat boyunca zarın bloke eder.
4. PBS /% 0.3 yağsız kuru süt 500 seyreltme: 1 viral E2A DNA-bağlama proteini (B6-8 ⁹⁾ karşı birincil antikor ile 4 ° C 'de O / N inkübe edin.
5. 3 kez PBS ile yıkayın membran /% 0.1 Tween 10 dakika boyunca 20.
6. Fare anti IgG sekonder AN membran inkübeoda sıcaklığında 2 saat süreyle PBS içinde 10.000 seyreltme: tibody Bir 1 at turpu peroksidaz (HRP) bağlanmış.
7. PBS ile membrana 3 kez yıkayın /% 0.1 Tween 20 10 dakika karıştırıldı.
8. Gelişmiş kemilüminesans ve X-ışını filmleri kullanılarak membran geliştirin.

RCF 4. Viral DNA tespiti

NOT: Her iki TGA ve RCF fraksiyonlardan, DNA izolasyonu için aşama 2,11 'de elde edilen toplam hacminin RCF için Npl 210 μ l ve 100 μ l kullanın.

1. Proteinaz K, 1 mg / ml ve% 0.5 Tween 20 ile 55 ° C 'de 1 saat süre ile çekirdek altı fraksiyonlar inkübe edin.
2. 95 ° C 'de 10 dakika boyunca inkübe edilerek örnekleri proteinaz K inaktive.
3. 2 dakika boyunca oda sıcaklığında, 20,000 x g'de santrifüjleyin örnekleri.
4. SN toplayın. 4 ° C 'de 3M sodyum asetatın 1/10 hacmi ve bir izopropanol hacminin, O / N-DNA çökeleği.
5. 10 dakika boyunca oda sıcaklığında, 20,000 x g'de santrifüjleyin örnekleri.
6. SN u atınmikropipet şarkı. 20.000 x g'de 5 dakika boyunca 4 ° C 'de% 70 etanol ve santrifüj ile pelet yıkayın.
7. 10 mM, 10 μ l DNA yeniden süspanse Tris-HCI pH 7.4
8. 260 nm'de optik yoğunluğu (OD) ölçmek suretiyle bir spektrofotometre kullanılarak DNA ölçmek.
9. Viral DNA'yı büyütmek için, nükleotid 7273 ile ilgili, Geç Temel transkripsiyon birimi içindeki bir bölgenin yükseltilmesine olanak sağlayacak primerler ile reaksiyon hacmi 25 μ l, Taq DNA polimeraz kullanılarak, standart bir PCR reaksiyonunda, her çekirdek içi fraksiyondan DNA 100 ng kullanmak için Nükleotid 7353 (81 bp) (Fw: GAGCGAGGTGTGGGTGAGC; Rv: GGATGCGACGACACTGACTTCA). 95 ° C 'de 3 dakika boyunca ilk denatürasyon, 20 amplifikasyon (95 ° C, 72 ° C' de 30 saniye boyunca 62 ° C 'de 1 dakika boyunca tavlama ve uzatma 1 dakika) devirlik bir son uzatma adımı ile takip aşağıdaki döngü koşulları kullanarak 72 ºC'de 3 dak.
10. Etidyum 90 V. Stain de,% 2 agaroz jelleri içinde PCR ürünü başlat0.5 μ ug / ml son konsantrasyonda bromür ve RCF viral DNA zenginleştirme doğrulamak için DNA görselleştirmek. Bu bileşik güçlü bir mutajen olduğu gibi, eldiven giymek emin olun her zaman çok dikkatli etidyum bromür Kulp ve. Kurumsal kurallarına göre etidyum bromür atınız.

RCF 5. Geç Viral mRNA Algılama

NOT: Her iki Npl ve RCF fraksiyonlardan RNA izolasyonu için, adım 2.11 'de elde edilen toplam hacim gelen RCF için Npl için 640 μ l ve 300 μ l kullanın.

1. Üreticinin talimatlarına uygun olarak Trizol kullanarak subnuclear fraksiyonlardan RNA izole. DEPC (diethilpyrocarbonate) enjekte edilmiş su 50 μ l RNA süspanse edin.
2. 260 nm'de OD ölçümü için bir spektrofotometre kullanılarak RNA niceliğini (yaklaşık 3 μ g elde edilir). 50 ng RNA Mağaza / -70 ºC sıcaklıkta l alikotları u.
3. Saflaştırılmış RNA kontrol5 ng toplam RNA ve aşama 4,9 tarif edilen döngü koşulları kullanılarak, ters transkriptaz (RT) yokluğunda bir kontrol PCR reaksiyonunun gerçekleştirilmesi ile DNA kontaminasyonu yokluğu.
   1. DNA kontaminasyonu yok ise herhangi bir amplikon üretilmelidir. DNA kontaminasyonu mevcut ise, 10 U RNaz inhibitör 10 U DNase I, 0.1 M Tris-HCI pH 8.3, 0.5 M KCl ve 37 ° C 'de 30 dakika boyunca 15 mM _MgCl2 ile örnekleri inkübe edin. Adım 5.1 olarak RNA yeniden izole etmek için devam edin.
4. RCF ilişkili viral mRNA analiz etmek için, farklı gen ailesine (Tablo 1), adenoviral Geç mRNA tespit etmek için tasarlanmış primerler kullanılarak, RT-PCR ile, her çekirdek içi fraksiyondan RNA 100 ng yükseltmek.
   1. Ters transkripsiyon (RT) için, 42 ° C 'de 1 saat boyunca karıştırılır ve 70 ° C' de 10 dakika boyunca, reaksiyon hacmi 20 μ l M-MuLV RT enzim kullanılarak, standart RT reaksiyonunda, her çekirdek içi fraksiyondan, RNA 100 ng kullanımı.
   2. Yükseltilmesi için, 1 kullanınAşama 4.9 PCR reaksiyonları, cDNA μ l. Amplifikasyon 25 döngü izledi 95 ° C 'de 3 dakika boyunca ilk denatürasyon (95 ° C'de 1 dakika, tavlama 72 ° C'de 30 saniye için Tablo 1 ve uzatma belirtilen sıcaklıkta 1 dakika süre ile) ve aşağıdaki döngü koşulları kullanarak 72 ° C 'de 3 dakika boyunca son bir uzatmadan oluşmuştur.
5. 0.5 μ ug / ml son konsantrasyonda etidyum bromür ile 90 V Leke jeller% 2 agaroz jelleri RT-PCR ürünleri, çalıştırmak ve RCF viral mRNA geç ilişki doğrulayacak görselleştirmek. Adımda 4.10 belirtildiği gibi etidyum bromür tutun.

RCF 6. İmmünofloresan Görselleştirme

NOT: Carry-out bu yordamı bir laminer akış kabini altında herhangi bir toz parçacıkları ile numunelerin kontaminasyonu önlemek ve kullanmadan önce tüm çözümleri filtre.

1. Nokta 5 adımda korkunç 2.10 elde edilen RCF kısmının l uctly silan kaplı slayt.
2. Oda sıcaklığında yaklaşık 5 dakika boyunca nokta kurumasını bekleyin.
3. Yeniden hidrat yavaş ve dolaylı RCF nokta yanında bir damla PBS 500 μ l pipetle ve slayt eğerek akış sağlayarak. Taraftan aşırı PBS boşaltın.
4. Oda sıcaklığında 2 saat süre ile PBS /% 5 bovin serum albümini 500 μ l (BSA) ile örnek kaplayarak Blok.
5. Nazikçe ve dolaylı olarak numune üzerine PBS 500 μ l pipetle slayt 3 kez yıkayın. Aşırı PBS tahliye etmek slayt eğin.
6. Oda sıcaklığında 2 saat süreyle PBS içinde 500 seyreltme bir 1: viral E2A DNA-bağlama proteini (B6-8 ⁹⁾ karşı birincil antikor ile numuneyi inkübe edin. Antikor çözeltisi 20 μ l tespit örnek örtün ve kurumasını önlemek için nemli bir oda içinde inkübe edilir.
7. Yumuşak ve dolaylı numune üzerine 500 ul PBS μ l pipetleme PBS /% 0.02 Tween 20 ile numune 3 kez yıkayın. Eski kapalı drenaj slayt yatırıncess yıkama çözeltisi.
8. 4 ° C 'de 1 saat süre ile, PBS içinde 2000 seyreltme: 1 ile 488 nm'de uyarıldı bir flüorofora bağlı fare anti IgG sekonder antikor ile inkübe edin. Antikor çözeltisi 20 μ l tespit örnek örtün ve kurumasını önlemek için nemli bir oda içinde inkübe edilir.
9. Yumuşak ve dolaylı numune üzerine 500 ul PBS μ l pipetleme PBS /% 0.02 Tween 20 ile numune 3 kez yıkayın. Fazla yıkama solüsyonu boşaltmak için slayt eğin.
10. Orta montaj olarak 2 μ PBS /% 10 gliserol kullanılarak bir lamel ile slayt üzerine tespit örnek örtün. Net oje ve mağaza el -20 ºC ile mühür.
11. 63x objektif ve 488 nm'lik bir dalga boyunda bir 1,4 Sayısal açıklık (NA) ile, bir floresans mikroskobu kullanılarak örnekleri analiz edin.

Sonuçlar

Viral replikasyon bölme (RC), protein ve diğer nükleer etki benzer nükleik asitten oluşan çekirdek içi virüslerin neden olduğu yapılar olduğu için, bu biyokimyasal özelliklerine göre hız gradyanları ile izolasyon için uygun olduğu kanıtlanmıştır. Fraksiyonlara protokol Kritik adımlar örnekleri farklı alt-hücresel fraksiyonların bütünlüğünü sağlamak için parlak bir alan mikroskobu ile izlenmesi gereken adım her birinde Şekil 1'de gösterilmiştir. Hücreler şişe...

Tartışmalar

In order to elucidate the molecular mechanisms that govern regulation of cellular activities by viral infection understanding the composition and activities associated with RC would be instrumental. Therefore, to make a detailed analysis of RC, we established a cell-free system that takes advantage of the size and biochemical composition of these virus-induced structures, to isolate subnuclear fractions enriched with RC using a simple procedure that relies on velocity gradients with sucrose cushions. Critical steps of th...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Gibco	12100-046	Warm in 37 ºC water bath before use
Fetal Bovine Serum	Gibco	12484-028
Sucrose, Ultra Pure	Research Organics	0928S	Prepare a 2.55 M stock solution and store at 4 ºC
Dounce homogenizer	Kontess Glass Company	884900-0000
Branson 1800 Ultrasonic Bath	Branson	Z769533 SIGMA	Turn on 15 min before use.
Goat anti-Mouse IgG1 Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	Life Technologies	A-21121	Use at a 1:2,000 dilution in PBS
Silane-Prep Slides	Sigma	S4651-72EA	Open in a laminar flow cabinet
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate	Pierce ThermoScientific	34080