Isolierung der viralen Replikation Compartment angereicherte Teil nuklearen Fraktionen von Adenovirus-infizierten normalen menschlichen Zellen

Zusammenfassung

We provide a novel strategy to isolate viral replication compartments (RC) from adenovirus (Ad)-infected human cells. This approach represents a cell-free system that can help to elucidate the molecular mechanisms regulating viral genome replication and expression as well as regulation of viral-host interactions established at the RC.

Zusammenfassung

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments through the recruitment of viral and cellular proteins to sites occupied by the viral genome. These sites, called replication compartments (RC), can be considered viral-induced nuclear domains where the viral genome is localized and viral and cellular proteins that participate in replication, transcription and post-transcriptional processing are recruited. Moreover, cellular proteins involved in the antiviral response, such as tumor suppressor proteins, DNA damage response (DDR) components and innate immune response factors are also co-opted to RC. Although RC seem to play a crucial role to promote an efficient and productive replication cycle, a detailed analysis of their composition and associated activities has not been made. To facilitate the study of adenoviral RC and potentially those from other DNA viruses that replicate in the cell nucleus, we adapted a simple procedure based on velocity gradients to isolate Ad RC and established a cell-free system amenable to conduct morphological, functional and compositional studies of these virus-induced subnuclear structures, as well as to study their impact on host-cell interactions.

Einleitung

Adenoviren enthält ein doppelsträngiges DNA-Genom, das in den infizierten Zellkern repliziert. Wenn der Virus-DNA in den Zellkern, lokalisiert es neben PML nuclear bodies ^1. Folgende virale frühe Genexpression wird die Kernarchitektur erheblich umstrukturiert Induzieren der Bildung von viralen Mikroumgebungen, bezeichnet als virale Replikation Compartments (RC) ^2. Seit Adenovirus (Ad) RC sind Websites, auf denen Virusgenom Replikation und Expression der viralen späten Gene stattfinden, bieten sie eine Umgebung für die Rekrutierung von allen notwendigen viralen und zellulären Faktoren, die in diesen Prozessen zu beteiligen. Interessanterweise eine Vielzahl von zellulären Proteinen für die zelluläre antivirale Reaktion verantwortlich ist, wie das die DNA-Reparatur, die angeborene Immunantwort und Tumorsuppression kooptiert zu diesen viralen ^Orte 2. Daher kann Ad RC berücksichtigt werden regulatorische Hubs, die effiziente virale Replikation zu fördern, während gleichzeitig die Regulierung derzelluläre antivirale Antwort, die anzeigt, dass diese Strukturen sind der Schlüssel zum Verständnis der Virus-Wirt-Zell-Interaktionen. Dennoch sind die molekularen Mechanismen der RC Bildung, ihrer Zusammensetzung und damit verbundenen Tätigkeiten sind weitgehend unverstanden.

Adenoviralen RC sowie RC von anderen DNA-Viren, die im Zellkern repliziert sind nicht auf Membranen cytoplasmatische RC ³ zugeordnet ist, im Gegensatz. Darüber hinaus sind diese virusinduzierten Strukturen wahrscheinlich vollständig von Proteinen und Nukleinsäuren aufgebaut sein. RC in Zellen mit RNA-Viren infiziert gebildet (gewöhnlich als viralen Fabrik) isoliert, unter Ausnutzung ihrer zytoplasmatischen Lokalisation und membrangebundenen Status, der ihre detaillierte morphologische, funktionelle und biochemische Charakterisierung ⁴ erleichtert hat.

Nach unserem Kenntnisstand haben Atom viralen RC nicht isoliert wurden, möglicherweise aufgrund der Komplexität der Kernarchitektur und Abwesenheit der intranukleären membranes, die ihre Isolierung erleichtern würde. Ihre Studie wurde stattdessen auf die Immunfluoreszenzmikroskopie, Fisch und Transmissionselektronenmikroskopie verlassen. Doch trotz Komplikationen inhärenten Isolierung subnuclear Strukturen, andere Kernbereichen wie Kernkörperchen und Cajal Bodies haben, bevor ^5,6 isoliert. Da Nucleoli und RC beide aus Proteinen und Nukleinsäuren besteht, und haben einen Durchmesser zwischen 0,5 - 5 um, stellten wir die Hypothese, dass RC auch zugänglich Isolation. Deshalb, um genauer zu charakterisieren, die molekulare Zusammensetzung und Funktionen RC verbunden sind, haben wir eine neuartige Methode, um subnuclear Fraktionen mit RC bereichert zu isolieren. Zu diesem Zweck stellten wir Sub-Kernfraktionen mit Geschwindigkeitsgradienten und Saccharose Kissen ähnlich Verfahren verwendet werden, um Kernkörperchen ⁷ oder sonstigen Kerndomänen ⁶ zu isolieren und gründete ein zellfreies System, das die Untersuchung der molekularen Zusammensetzung und die damit verbundenen Tätigkeiten erlaubtRC. Diese Technik ist daher das Verständnis der voran Virus-Wirt-Zell-Wechselwirkungen und ist ein mächtiges Werkzeug, das auch die detaillierte Analyse von RC zu erleichtern, sollte aus anderen Viren, die im Zellkern repliziert und induzieren Bildung replikations Abteile ähnliche Abmessungen wie jene in Adenovirus- gebildet infizierte Zellen, wie Herpesviren, Papillomaviren oder Polyomaviren.

Protokoll

1. HFF Zellkultur und Ad-Infektion

1. Ausbreiten Ad5 Virus in Monoschichten von HEK-293 Zellen und Titer als fluoreszierende bildenden Einheiten (FFU) auf HFF-Zellen, wie ^{zuvor. 8 beschrieben}
2. Wachsen Menschliche Vorhautfibroblasten (HFF) in 10 ml DMEM / 10% fötales Rinderserum (FBS) in sterile Kulturschalen von 100 mm bei 37 ° C und _5% CO 2 in einem befeuchteten Inkubator. Bestimmen Sie die Zellzahl unter Verwendung einer Neubauer Kammer durch Zählen der Zellen in den vier 16-Quadratmeter-Sets. Die Zellzahl pro ml wird durch Berechnen der Anzahl der Zellen in den vier 16-Quadrat-Sets und Multiplizieren dieser Zahl mit 10 ^{4 erhalten.} Für jeden Zeit nach der Infektion in Schritt 1.3 verwendet, so führen 1 x 10 ⁷ HFF-Zellen.
3. Mock-Infektion oder infizieren HFF-Zellen mit Adenovirus Typ 5 (Ad5) Wildtyp (WT) (H5pg4100 ⁸⁾ in 100 mm Gewebekulturschalen mit 1 ml von Ad5 in DMEM pro Schale bei einer MOI von 30 Fokus Erzeugungseinheit oder FFU pro Zelle. Inkubieren für 2 Stunden in ahumidified Zellkulturbrutschrank bei 37 ° C und _5% CO 2, sorgfältig rockt die Gerichte alle 15 Minuten, um eine homogene Verteilung des Virusinokulum über die Zellen zu gewährleisten. Nach dieser Zeit, entfernen Sie das Medium und fügen Sie frisches DMEM mit 10% FBS und Inkubation für 16, 24 oder 36 Stunden in einem befeuchteten Zellkulturbrutschrank bei 37 ^{° C} und _5% CO 2. Fahren Sie mit Schritt 2.1.

2. Herstellung von Sub-Kern Fraktionen mit Adenovirus RC Angereichert

1. Ernte-Ad5-infizierte oder scheininfizierte HFF-Zellen mit einem Zell scrapper und sammeln die Zellen in sterile Zentrifugenröhrchen. Bestimmen Sie die Anzahl der Zellen, wie in Schritt 1.2. Verwenden 1 x ¹⁰ 7 Zellen für jede Zeit nach der Infektion in Schritt 1.3 angegeben.
2. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 220 × g, 4 ° C für 5 min.
3. Zellpellet in eiskaltem PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na _{2 HPO 4} und 1,8 mM KH _{2 PO 4).} Wash Zellpellets 3 mal mit 5 ml eiskaltem PBS pro Waschgang. Zu diesem Zweck Zentrifuge die Zellen bei 220 × g, 4 ° C für 5 min, dekantieren und den Überstand verwerfen (SN) und Zellpellet durch vorsichtiges Pipettieren.
4. An der Plasmamembran zu stören, Zellpellet in 700 ul eiskaltem hypotonischen Puffer (10 mM HEPES pH 7,9, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl _2, 0,5 mM DTT, 20 μ g / ml Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) eine Mischung aus Cystein, Serin, Threonin und Aspartylproteasehemmstoffen einschließlich 10 μ g / ml Rinderpankreas-Trypsininhibitor, 10 μ g / ml Pepstatin A und 10 μ g / ml N-Acetyl-L-Leucyl-L-Leucyl-L -argininal) und lassen Sie die Zellen schwellen auf Eis für 3 Stunden.
5. Lyse der Zellen unter Verwendung eines Homogenisators mit einem locker sitzende A-Typ Teflonpistill. Führen Sie 80 Dounce Schlaganfälle und Monitorproben alle 20 Hübe von Hellfeld-Mikroskopie, um sicherzustellen, dass alle Zellen lysiert worden sind, aber das Kerne not beschädigt oder zerrissen.
6. Zentrifugieren Sie die Zellhomogenat bei 300 × g, 4 ° C für 5 min. Lagern Sie den SN als cytoplasmatische Fraktion bei -20 ºC in einem Zentrifugenröhrchen.
7. Um Zelltrümmer aus Keimen in 750 μ l der Lösung 1 (S1) (zu entfernen, das Pellet 0,25 M Saccharose, 10 mM MgCl _{2 20} μ g / ml PMSF, eine Mischung aus Cystein, Serin, Threonin und Aspartyl-Protease-Inhibitoren einschließlich 10 μ g / ml Rinderpankreas-Trypsininhibitor, 10 μ g / ml Pepstatin A und 10 μ g / ml N-Acetyl-L-Leucyl-L-Leucyl-L-argininal) und die Schicht über ein gleiches Volumen der Lösung 2 (S2) (0,35 M Saccharose, 0,5 mM MgCl _{2, 20} μ g / ml PMSF, eine Mischung aus Cystein, Serin, Threonin und Aspartyl-Protease-Inhibitoren einschließlich 10 μ g / ml Rinderpankreas-Trypsininhibitor, 10 μ g / ml Pepstatin A und 10 μ g / ml N-Acetyl-L-Leucyl-L-Leucyl-L-argininal). Centrifuge bei 1.400 × g, 4 ° C für 5 min.
8. Entsorgen Sie die SN mit einer Mikropipette. Vermeiden Sie das Pellet aufzurühren.
9. Das Pellet enthält isolierten Zellkernen in 750 μ l S2.
10. Um subnuclear Fraktionen mit Adenovirus RC (RCF) angereichert zu isolieren, beschallen resuspendiert Kerne mit einem Ultraschallbad, mit Hilfe von zwei 5 min Impulse, oder bis alle Kerne werden lysiert, wie durch Hellfeldmikroskopie beobachtet. Gebraucheissätze in Ultraschallbad wie notwendig, um Proben, die bei oder unter 4 ° C zu halten.
11. Schichten beschallt Kernen über einem gleichen Volumen der Lösung 3 (S3) (0,88 M Saccharose, 0,5 mM MgCl _{2) und} Zentrifuge bei 3.000 x g, 4 ° C für 10 min. Bewahren Sie die 1,5 ml Überstand als nukleoplasmatischen Fraktion (NPL) bei -70 ºC. Das Pellet in 700 μ l S2 und speichern als RCF bei -70 ºC.

3. Western-Blot-Analysen der RCF

HINWEIS: Western-Blot-Analyse der Npl und RCF Fraktionen set Seite 640 & mgr; l für Npl und 300 μ l RCF aus dem in Stufe 2.11 erhaltenen Gesamtvolumens.

1. Mix 15 μ l jeder subnuclear Fraktion in Laemmli-Puffer 2x (4% SDS, 20% Glycerin, 10% 2-Mercaptoethanol, 0,004% Bromphenolblau, 0,125 M Tris HCl pH 6,8) und Kochen bei 95 ºC für 5 min. Laden der Proben in einem 10% Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) Denaturierungsgel und separaten Proteinen für 1,5 h bei 20 Milliampere (mA).
2. Transferproteine ​​durch Elektroblotting für 1,5 h bei 400 mA auf Polyvinylidendifluorid (PVDF) -Membranen.
3. Block Membran für 2 Stunden bei RT mit 3% fettfreier Trockenmilch in PBS.
4. Inkubieren O / N bei 4 ºC mit dem primären Antikörper gegen virale E2A DNA-bindendes Protein (B6-8 ⁹⁾ bei einer 1: 500-Verdünnung in PBS / 0,3% fettfreier Trockenmilch.
5. Waschen der Membran 3 mal mit PBS / 0,1% Tween 20 für 10 min.
6. Inkubieren Sie die Membran mit Maus-anti-IgG-Sekundär ein10.000-Verdünnung in PBS für 2 h bei RT: tibody bei einer 1 bis Meerrettichperoxidase (HRP) gekoppelt.
7. 3 mal für 10 min Waschen der Membran mit PBS / 0,1% Tween 20.
8. Entwickeln Sie die Membran unter Verwendung verstärkter Chemilumineszenz und Röntgenfilme.

4. Virale DNA-Nachweis in RCF

HINWEIS: DNA-Isolierung aus beiden Npl und RCF Fraktionen, verwenden Sie 210 μ l für Npl und 100 μ l für RCF des in Stufe 2.11 erhaltenen Gesamtvolumen.

1. Inkubieren subnuklearer Fraktionen für 1 h bei 55 ° C mit 1 mg / ml Proteinase K und 0,5% Tween 20.
2. Proteinase K inaktiviert durch Inkubation der Proben für 10 min bei 95 ° C.
3. Zentrifugieren Sie die Probe bei 20000 · g, bei Raumtemperatur für 2 min.
4. Sammeln Sie die SN. Ausfällung der DNA mit 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat und einem Volumen Isopropanol, O / N bei 4 ° C.
5. Zentrifugieren der Proben bei 20.000 xg bei RT für 10 min.
6. Entsorgen Sie die SN usingen ein Mikropipette. Bei 20000 × g, 4 ° C für 5 min Waschen des Pellets mit 70% Ethanol und zentrifugiert.
7. Resuspendieren der DNA in 10 μ l 10 mM Tris-HCl pH 7,4
8. Quantifizierung DNA unter Verwendung eines Spektrophotometers durch Messung der optischen Dichte (OD) bei 260 nm.
9. Zur Amplifikation viraler DNA, verwenden 100 ng DNA aus jedem subnuclear Fraktion in einer Standard-PCR-Reaktion unter Verwendung von Taq-DNA-Polymerase in 25 μ l-Reaktionsvolumen mit Primern, die die Amplifikation einer Region innerhalb des hauptsächlichen späten Transkriptionseinheit zu ermöglichen, von Nucleotid 7273 bis Nukleotid 7353 (81 bp) (Fw: GAGCGAGGTGTGGGTGAGC; Rv: GGATGCGACGACACTGACTTCA). Verwenden Sie die folgenden Zyklusbedingungen: Initiale Denaturierung für 3 min bei 95 ° C, gefolgt von 20 Amplifikationszyklen (1 min bei 95 ° C, Annealing für 1 min bei 62 ° C und Verlängerung für 30 Sekunden bei 72 ° C) und einem abschließenden Verlängerungsschritt für 3 min bei 72 ° C.
10. Führen Sie das PCR-Produkt in 2% Agarose-Gelen, bei 90 V. Stain mit EthidiumBromid bei 0,5 μ g / ml Endkonzentration und visualisieren DNA, virale DNA-Anreicherung in der RCF mauern. Griff Ethidiumbromid mit äußerster Vorsicht und immer darauf achten, Handschuhe zu tragen, da diese Verbindung ist ein potenter mutagen. Entsorgen Ethidiumbromid gemäß gültiger Richtlinien.

5. späten viralen mRNA-Nachweis in RCF

HINWEIS: Für die RNA-Isolierung aus beiden Npl und RCF Fraktionen, verwenden Sie 640 μ l für Npl und 300 μ l für RCF aus dem in Stufe 2.11 erhaltenen Gesamtvolumen.

1. Isolieren von RNA aus subnuclear Fraktionen unter Verwendung von Trizol nach den Herstelleranweisungen. Resuspendieren RNA in 50 μ l DEPC (diethilpyrocarbonate) behandelten Wasser.
2. Quantifizierung der RNA mit einem Spektralphotometer, um die OD bei 260 nm messen (ca. 3 μ g erhalten). Bewahren Sie die RNA in 50 ng / & mgr; l-Aliquots bei -70 ºC.
3. Überprüfen gereinigte RNAdie Abwesenheit von DNA-Kontamination durch Durchführung einer PCR-Kontrollreaktion in Abwesenheit von reverser Transkriptase (RT) unter Verwendung von 5 ng Gesamt-RNA und die in Schritt 4.9 beschriebenen Zyklusbedingungen.
   1. Wenn DNA-Kontamination fehlt kein Amplikon sollte hergestellt werden. Wenn DNA-Kontamination vorhanden ist, läßt man die Proben mit 10 U DNase I, 10 U RNase-Inhibitor, 0.1 M Tris-HCl pH 8,3, 0,5 M KCl und 15 mM _MgCl2 30 Minuten bei 37 ºC. Gehen Sie erneut zu isolieren RNA, wie in Schritt 5.1.
4. Virale mRNA zu RCF zugeordnet analysieren, verstärken 100 ng RNA aus jeder subnuclear Fraktion durch RT-PCR unter Verwendung von Primern, um adenoviralen späten mRNA aus verschiedenen Genfamilien (Tabelle 1) zu detektieren.
   1. Für die reverse Transkription (RT), Verwenden von 100 ng RNA, die voneinander subnuclear Fraktion in einem Standard-RT-Reaktion unter Verwendung von M-MuLV RT-Enzym in 20 μ l Reaktionsvolumen 1 h bei 42 ºC und 10 min bei 70 ºC.
   2. Zur Verstärkung, benutzen 1μ l der cDNA in der PCR-Reaktionen, wie in Schritt 4.9. Mithilfe der folgenden Zyklusbedingungen: Initiale Denaturierung für 3 min bei 95 ºC, gefolgt von 25 Zyklen der Amplifizierung (1 min bei 95 ºC, Annealing für 1 min bei der in Tabelle 1 und Erweiterung angegeben für 30 Sekunden bei 72 ºC Temperatur) und ein abschließenden Extensionsschritt für 3 min bei 72 ºC.
5. Führen Sie die RT-PCR-Produkte in 2% Agarose-Gelen, bei 90 V. Stain Gele mit Ethidiumbromid bei 0,5 μ g / ml Endkonzentration und zu visualisieren, um Viren späten mRNA-Assoziation mit dem RCF mauern. Griff Ethidiumbromid wie in Schritt 4.10 angegeben.

6. Immunfluoreszenz Visualisierung von RCF

HINWEIS: Carry-out dieses Verfahren unter einer Sterilbank, um eine Kontamination der Proben zu vermeiden, mit jedem Staubpartikel und alle Lösungen auswählen, vor dem Gebrauch.

1. Spot 5 ul der in Schritt 2.10 dire erhalten RCF Bruchctly auf einem Silan-beschichteten Objektträger.
2. Lassen Sie die Stelle trocken für ca. 5 min bei RT.
3. Re-Hydrat durch langsam und indirekt Pipettieren von 500 μ l PBS in einem Tropfen neben dem RCF Stelle und lässt sie durch Kippen des Schiebe fließen. Lassen Sie das überschüssige PBS von der Seite.
4. Block durch Bedecken der Probe mit 500 μ l PBS / 5% Rinderserumalbumin (BSA) für 2 h bei RT.
5. 3 Mal vorsichtig und indirekt Pipettieren von 500 μ l PBS auf die Probe zu waschen der Folie. Neigen Sie den Schieber zum Ableiten des überschüssigen PBS.
6. Inkubieren der Probe mit dem primären Antikörper gegen an einer 1-Virus E2A DNA-bindendes Protein (B6-8 ^9): 500 Verdünnung in PBS für 2 h bei RT. Decken Sie die beschmutzte Probe mit 20 μ l der Antikörperlösung und Inkubation in einer feuchten Kammer, um ein Austrocknen zu verhindern.
7. 3 Mal Waschen der Probe mit PBS / 0,02% Tween 20 durch leichtes und indirekt Pipettieren von 500 μ l PBS auf die Probe. Neigen Sie den Schieber, um weg von der ex DrainProzesswaschlösung.
8. 2.000 Verdünnung in PBS bei 4 ° C, für 1 h: die Proben mit Maus-anti-IgG-Sekundärantikörper mit einem Fluorophor, das bei 488 nm in einem 1 angeregt wird, gekoppelt zu inkubieren. Decken Sie die beschmutzte Probe mit 20 μ l der Antikörperlösung und Inkubation in einer feuchten Kammer, um ein Austrocknen zu verhindern.
9. 3 Mal Waschen der Probe mit PBS / 0,02% Tween 20 durch leichtes und indirekt Pipettieren von 500 μ l PBS auf die Probe. Neigen Sie den Schieber zum Ableiten des überschüssigen Waschlösung.
10. Decken Sie die beschmutzte Probe auf dem Objektträger mit einem Deckglas mit 2 μ l PBS / 10% Glycerin als Einschlussmittel. Dichtung mit klarem Nagellack und speichern al -20 ºC.
11. Analyse der Proben unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops mit einem 63x-Objektiv und einem 1,4 numerischen Apertur (NA) bei einer Wellenlänge von 488 nm.

Ergebnisse

Da virale Replikation Abteile (RC) sind subnuclear viral induzierten Strukturen von Proteinen und Nukleinsäuren, ähnlich zu anderen Kerndomänen zusammengesetzt, erwiesen sie zugänglich Isolierung zu sein durch Geschwindigkeitsgradienten basierend auf biochemischen Funktionen. Kritischen Schritte bei der Fraktionierung Protokolls sind in Abbildung 1. Bei jedem dargestellten Schritt die Proben müssen durch Hellfeldmikroskopie überwacht, um die Integrität der verschiedenen subzellulären Fraktionen ...

Diskussion

In order to elucidate the molecular mechanisms that govern regulation of cellular activities by viral infection understanding the composition and activities associated with RC would be instrumental. Therefore, to make a detailed analysis of RC, we established a cell-free system that takes advantage of the size and biochemical composition of these virus-induced structures, to isolate subnuclear fractions enriched with RC using a simple procedure that relies on velocity gradients with sucrose cushions. Critical steps of th...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Gibco	12100-046	Warm in 37 ºC water bath before use
Fetal Bovine Serum	Gibco	12484-028
Sucrose, Ultra Pure	Research Organics	0928S	Prepare a 2.55 M stock solution and store at 4 ºC
Dounce homogenizer	Kontess Glass Company	884900-0000
Branson 1800 Ultrasonic Bath	Branson	Z769533 SIGMA	Turn on 15 min before use.
Goat anti-Mouse IgG1 Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	Life Technologies	A-21121	Use at a 1:2,000 dilution in PBS
Silane-Prep Slides	Sigma	S4651-72EA	Open in a laminar flow cabinet
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate	Pierce ThermoScientific	34080