Выделение вирусной репликации отсек обогащенных субъядерных фракций из аденовируса-инфицированных клетках человека нормальный

Резюме

We provide a novel strategy to isolate viral replication compartments (RC) from adenovirus (Ad)-infected human cells. This approach represents a cell-free system that can help to elucidate the molecular mechanisms regulating viral genome replication and expression as well as regulation of viral-host interactions established at the RC.

Аннотация

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments through the recruitment of viral and cellular proteins to sites occupied by the viral genome. These sites, called replication compartments (RC), can be considered viral-induced nuclear domains where the viral genome is localized and viral and cellular proteins that participate in replication, transcription and post-transcriptional processing are recruited. Moreover, cellular proteins involved in the antiviral response, such as tumor suppressor proteins, DNA damage response (DDR) components and innate immune response factors are also co-opted to RC. Although RC seem to play a crucial role to promote an efficient and productive replication cycle, a detailed analysis of their composition and associated activities has not been made. To facilitate the study of adenoviral RC and potentially those from other DNA viruses that replicate in the cell nucleus, we adapted a simple procedure based on velocity gradients to isolate Ad RC and established a cell-free system amenable to conduct morphological, functional and compositional studies of these virus-induced subnuclear structures, as well as to study their impact on host-cell interactions.

Введение

Аденовирусы содержат геном двухцепочечной ДНК, который воспроизводит в ядре зараженной клетки. Когда вирусная ДНК проникает в ядро, она локализуется рядом с ПМЛ ядерных ^тел 1. После вирусной экспрессии генов раннего, ядерная архитектура резко реорганизована, вызывая образование вирусных микросреды, называется вирусной репликации Отсеки (RC) ^2. Так аденовирус (объявление) RC сайты, где репликации вирусного генома и экспрессия вирусных генов конце происходят, они обеспечивают среду для вербовки всех необходимых вирусных и клеточных факторов, участвующих в этих процессах. Интересно, что различные клеточные белки, ответственные за сотовой противовирусной реакции, такие как реакции повреждения ДНК, врожденного иммунного ответа и подавление опухоли кооптированы этих вирусных сайтов ^2. Следовательно, Объявление RC можно считать нормативные концентраторы, которые способствуют эффективной репликации вируса в то время как одновременно, регулирующихсотовая противовирусный ответ, указывая, что эти структуры являются ключевыми для понимания взаимодействий вирус-клеток-хозяев. Тем не менее, молекулярные механизмы формирования RC, их состав и связанные с ними мероприятия, плохо понимал.

Аденовирусный RC, а также RC от других вирусов ДНК, которые реплицируются в ядре не связаны с мембранами, в отличие от цитоплазматического ^RC 3. Кроме того, эти вирус-индуцированные структуры, вероятно, будут полностью состоит из белков и нуклеиновых кислот. RC формируется в клетках, инфицированных РНК-содержащих вирусов (обычно называют вирусные фабрики) были выделены, пользуясь их цитоплазматической локализации и мембраной статуса, который способствовал их детальное морфологическое, функциональное и биохимических характеристик ^4.

По нашим сведениям, ядерным вирусная RC не были выделены, возможно, из-за сложности ядерной архитектуры и отсутствии внутри- мembranes, которые будут способствовать их изоляции. Их исследование опирается вместо этого на иммунофлюоресценции микроскопии, рыбы и просвечивающей электронной микроскопии. Тем не менее, несмотря на осложнения, присущие изоляции субъядерных структуры, другие ядерные домены, такие как ядрышек и Cajal органов были выделены, прежде чем ^5,6. Так ядрышек и RC оба состоят из белков и нуклеиновых кислот, и имеют диаметр от 0,5 до 5 мкм -, мы предположили, что RC также должны быть пригодны для изоляции. Поэтому, для того, чтобы более точно охарактеризовать молекулярный состав и функции, связанные с дистанционным управлением, мы установили новый способ, чтобы изолировать субъядерных Фракции, обогащенные с дистанционным. Для этого мы подготовили суб-ядерным фракции, используя градиенты скорости и сахарозы подушки, подобные процедуры, используемые, чтобы изолировать ядрышки ⁷ или другие ядерные домены ⁶ и создана система бесклеточной, что позволяет изучение молекулярного состава и связанные деятельностьRC. Таким образом, этот метод следует улучшить понимание взаимодействия вирус-хозяин клеток и представляет собой мощный инструмент, который также должно способствовать детальный анализ RC от других вирусов, которые воспроизводят в ядре и вызвать образование репликации отсеков подобных размеров, чтобы те, которые образуются в adenovirus- инфицированных-клетки, такие как, вирусы герпеса, папилломы или polyomaviruses.

протокол

1. HFF клеточной культуре и Ad-инфекции

1. Propagate вирус Ad5 WT в монослоев клеток НЕК-293 и титра, люминесцентных единиц (ФФУ) по HFF клеток, как описано ранее ^8.
2. Выращивают фибробласты крайней плоти человека (HFF) в 10 мл DMEM / 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), в стерильной культуральной 100 мм чашках при 37 ° С и _5% СО 2 в увлажненном инкубаторе. Определить количество клеток с помощью камеры Neubauer в подсчетом клеток в четырех 16-квадратных наборов. Число клеток на мл получают путем вычисления среднего количества клеток в четырех 16-квадратных наборов и умножения этого числа на ¹⁰ 4. Для каждого периода времени после инфекции, включенной в шаге 1.3, используют 1 х 10 ⁷ клеток HFF.
3. Макет Infect или заразить HFF клеток аденовируса типа 5 (Ad5) дикого типа (WT) (H5pg4100 ⁸⁾ в 100 мм чашках для тканевых культур с использованием 1 мл Ad5 в DMEM на чашку на МВД 30 Фокус формовочным блоком, или ФФУ , на ячейку. Выдержите в течение 2 часов в ахumidified клеточной культуры инкубатор при 37 ° С и 5% СО _2, тщательно качалки посуду каждые 15 мин, чтобы обеспечить равномерное распределение вируса инокулята над клетками. По истечении этого времени, удалить носитель и добавить свежий DMEM с добавлением 10% FBS и инкубировали в течение 16, 24 или 36 ч в увлажненной клеточной культуры инкубатор при ^{37? С} и 5% _СО 2. Перейдите к шагу 2.1.

2. Подготовка субъядерных фракций Обогащенный аденовируса RC

1. Урожай Ad5-инфицированных или макет-инфицированных HFF клеток с клеточной скребка и сбора клеток в стерильных центрифужные пробирки. Определить количество клеток, как на стадии 1.2. Используйте 1 х 10 ⁷ клеток для каждого времени после заражения, указанных в пункте 1.3.
2. Центрифуга клетки при 220 мкг, 4 ° С в течение 5 мин.
3. Ресуспендируют осадок клеток в ледяной PBS (137 мм NaCl, KCl 2,7 мм, 10 мМ _Na 2 HPO _{4 и} 1,8 мм _КН 2 РО _4). Вымойте осадок клетокс 3 раза с использованием 5 мл охлажденного льдом PBS на каждую промывку. С этой целью центрифуги клетки при 220 мкг, 4 ° С в течение 5 мин, после декантации и отбросить супернатант (SN), и ресуспендируют осадок клеток осторожно пипеткой.
4. Чтобы разрушить клеточную мембрану, ресуспендируют осадок клеток в 700 мкл ледяного гипотонического буфера (10 мМ HEPES, рН 7,9, 10 мМ КСl, 1,5 мМ MgCl _2, 0,5 мМ ДТТ, 20 μ г / мл фенилметилсульфонилфторида (ФМСФ) , смесь цистеина, серина, треонина и аспартил-протеазы ингибиторов, включая 10 мкг / мл бычьего панкреатического трипсина, ингибитор 10 μ г / мл пепстатина А и 10 мкг / мл N-ацетил-L-лейцил-L-лейцил-L -argininal) и пусть клетки набухают на льду в течение 3 ч.
5. Лизировать клетки с помощью гомогенизатора с рыхлой облегающие A Тип тефлоновым пестиком. Выполните 80 Dounce инсультов и образцов монитора каждые 20 ударов по ярким микроскопии обеспечить, чтобы все клетки были лизированы, но ядра имеют нOT были повреждены или разорваны.
6. Центрифуга клеточного гомогената при 300 х г, 4 ° С в течение 5 мин. Хранить SN как цитоплазматической фракции при -20 ° С в центрифужную пробирку.
7. Для удаления остатков клеток от ядер, ресуспендируют осадок в 750 μ л раствора 1 (S1) (0,25 М сахарозы, 10 мМ _MgCl 2 20 мкг / мл PMSF, смесь цистеин, серин, треонин и аспартил-протеазы ингибиторов в том числе 10 μ г / мл бычьего панкреатического ингибитора трипсина, 10 μ г / мл пепстатина А и 10 μ г / мл N-ацетил-L-лейцил-L-лейцил-L-argininal) и слой над равный объем раствора 2 (S2) (0,35 М сахарозы, 0,5 мМ MgCl _2, 20 μ г / мл ФМСФ, смесь цистеин, серин, треонин и аспартил-протеазы ингибиторов, включая 10 μ г / мл бычьего панкреатического ингибитора трипсина, 10 μ г / мл пепстатина А и 10 мкм г / мл N-ацетил-L-лейцил-L-лейцил-L-argininal). Центрifuge в 1400 мкг, 4 ° С в течение 5 мин.
8. Откажитесь от SN, используя микропипетку. Избегайте нарушая гранул.
9. Ресуспендируют осадок, содержащий изолированные ядра в 750 μ л S2.
10. Чтобы изолировать субъядерных фракции, обогащенные аденовируса RC (RCF), ультразвук ресуспендировали ядра с ультразвуковой ванне, с помощью двух импульсов 5 мин, или до тех пор, пока все ядра лизируют как это наблюдается ярко микроскопии. Использование льда в ультразвуковой ванне в случае необходимости, чтобы сохранить образцы на уровне или ниже 4 ° С.
11. Слой ультразвуком в течение ядра равным объемом раствора 3 (S3) (0,88 М сахарозы, 0,5 мМ _MgCl 2) и центрифугируют при 3000 х г, 4 ° С в течение 10 мин. Храните супернатант 1,5 мл в качестве нуклеоплазме фракции (NPL) при -70 ° C. Ресуспендируют осадок в 700 μ л S2 и магазин как RCF при -70 ° С.

3. вестерн-блот анализ РШФ

ПРИМЕЧАНИЕ: Для вестерн-блот анализа NPL и RCF фракций сET сторону 640 мкл для NPL и 300 μ л для RCF от общего объема, полученного на стадии 2.11.

1. Смешайте 15 μ л каждого субъядерной фракции в буфере Лэммли 2x (4% SDS, 20% глицерина, 10% 2-меркаптоэтанола, 0,004% бромфеноловый синий, 0,125 М трис-HCl рН 6,8) и варить при 95 ° С в течение 5 мин. Загрузка образцов в электрофореза в 10% додецилсульфата натрия-полиакриламидном геле (SDS-PAGE) денатурирующем геле и отдельные белки в течение 1,5 ч, при 20 мА (мА).
2. Передача белков проводили электроблоттинг в течение 1,5 ч при 400 мА на поливинилиденфторид (ПВДФ) мембраны.
3. Блок мембраны в течение 2 ч при комнатной температуре с помощью 3% Обезжиренное сухое молоко в PBS.
4. Инкубируйте O / N при 4 ° С с первичным антителом против вирусной ДНК E2A-связывающего белка (B6-8) в ⁹ в разведении 1: 500 в PBS / 0,3% обезжиренного сухого молока.
5. Промыть 3 раза мембраны с PBS / 0,1% Твин 20 в течение 10 мин.
6. Выдержите мембрану мыши анти IgG вторичного апtibody соединен с пероксидазой хрена (HRP) в разведении 1: 10000 в PBS в течение 2 ч при комнатной температуре.
7. Промыть мембраны 3 раза ЗФР / 0,1% Твин 20 в течение 10 мин.
8. Разработка мембраны, используя усиленной хемилюминесценции и рентгеновские снимки.

4. Вирусный Обнаружение ДНК в RCF

ПРИМЕЧАНИЕ: Для выделения ДНК из обоих NPL и RCF фракций, используйте 210 μ л для NPL и 100 μ л для RCF от общего объема, полученного на стадии 2.11.

1. Инкубируйте субъядерных фракций в течение 1 ч при 55 ° С с 1 мг / мл протеиназы К и 0,5% Tween 20.
2. Деактивировать протеиназы К путем инкубации образцов в течение 10 мин при 95 ° С.
3. Центрифуга образцов при 20000 х г, при комнатной температуре в течение 2 мин.
4. Соберите SN. Осадок ДНК с 1/10 объема 3 М ацетата натрия и один объем изопропанола, O / N при 4 ° С.
5. Центрифуга образцов при 20000 х г, при комнатной температуре в течение 10 мин.
6. Откажитесь от U SNпеть микропипетку. Промыть гранулу с 70% этанола и центрифугируют при 20000 х г, 4 ° С в течение 5 мин.
7. Ресуспендируют ДНК в 10 μ л 10 мМ Трис-HCl, рН 7,4
8. Количественно ДНК с помощью спектрофотометра путем измерения оптической плотности (ОП) при 260 нм.
9. Для усиления вирусной ДНК, используют 100 нг ДНК из каждого субъядерной фракции в стандартной реакции ПЦР с использованием полимеразы Taq ДНК-в 25 μ л реакционного объема с использованием праймеров, которые позволяют амплификацию области в рамках основных блока поздний транскрипции, от нуклеотида 7273 до нуклеотид 7353 (81 б.п.) (Fw: GAGCGAGGTGTGGGTGAGC; Откр: GGATGCGACGACACTGACTTCA). Используйте следующие условия цикла: первоначальной денатурации в течение 3 мин при 95 ° С, затем 20 циклов амплификации (1 мин при 95 ° С, отжиг в течение 1 мин при 62 ° С и расширением в течение 30 сек при 72 ° С) и конечная стадия удлинения для 3 мин при 72 ° С.
10. Запустите продукт ПЦР в 2% агарозном геле, в 90 В. красителей этидияметила на 0,5 μ г / мл конечная концентрация и визуализировать ДНК, чтобы подтвердить обогащение вирусной ДНК в RCF. Ручка бромид этидия с особой осторожностью и всегда убедитесь, что носить перчатки, так как это соединение является мощным мутагенным. Утилизировать этидия бромид соответствии с установленными руководящими принципами.

5. В конце вирусной мРНК обнаружения в RCF

ПРИМЕЧАНИЕ: Для выделения РНК из обеих NPL и RCF фракций, используйте 640 μ л для NPL и 300 μ л для RCF от общего объема, полученного на стадии 2.11.

1. Изолировать РНК из субатомных фракций с помощью Trizol по инструкции завода-изготовителя. Ресуспендируют РНК в 50 μ л DEPC (diethilpyrocarbonate) -обработанной воды.
2. Количественная РНК с использованием спектрофотометра для измерения оптической плотности при 260 нм (приблизительно 3 г μ получены). Храните РНК в 50 нг / мкл аликвоты при -70 ° С.
3. Проверьте очищенной РНКна отсутствие загрязнения ДНК путем выполнения управления ПЦР в отсутствие обратной транскриптазы (RT), с использованием 5 нг общей РНК и условия цикла, описанного в пункте 4.9.
   1. Если загрязнение ДНК отсутствует нет ампликона не должно быть произведено. Если загрязнение ДНК присутствует, инкубировать образцы с 10 U ДНКазы I, 10 ед ингибитора РНКазы из, 0,1 М Трис-HCl рН 8,3, 0,5 М KCl и 15 мМ _MgCl 2 в течение 30 мин при 37 ° С. Продолжать повторно выделения РНК, как на стадии 5.1.
4. Для анализа вирусной мРНК, связанную с RCF, усиливать 100 нг РНК из каждой фракции субъядерной ОТ-ПЦР с использованием праймеров, сконструированных для обнаружения аденовируса конце мРНК из различных семейств генов (таблица 1).
   1. Для обратной транскрипции (RT), используют 100 нг РНК, из каждой фракции субъядерной в стандартной реакции RT с помощью М-MuLV RT фермент в 20 μ л реакционного объема в течение 1 ч при 42 ° С и 10 мин при 70 ° С.
   2. Для усиления, используйте 1μ л кДНК в реакции ПЦР, как в шаге 4.9. Используйте следующие условия цикла: первоначальной денатурации в течение 3 мин при 95 ° С, затем 25 циклов амплификации (1 мин при 95 ° С, отжиг в течение 1 минуты при температуре, указанной в таблице 1 и на расширение в течение 30 сек при 72 ° С) и Заключительный этап расширения в течение 3 мин при 72 ° С.
5. Запуск продукты-ПЦР в 2% агарозном геле при 90 В. Stain гелей с бромистым этидием при 0,5 μ г / мл конечной концентрации и визуализации для подтверждения вирусной мРНК в конце ассоциации с RCF. Ручка бромид этидия, как указано в шаге 4.10.

6. Иммунофлуоресценции Визуализация RCF

ПРИМЕЧАНИЕ: Carry-эту процедуру под шкафом ламинарного потока, чтобы избежать загрязнения образцов с любыми частицами пыли, и фильтровать все решения перед использованием.

1. Пятно 5 мкл фракции RCF, полученного на стадии 2.10 тяжелымctly на силана покрытием слайда.
2. Пусть пятна высохнуть в течение приблизительно 5 мин при комнатной температуре.
3. Re-гидрата, медленно и косвенно пипетки 500 мкл PBS в капле рядом месте RCF и позволяя ей течь, наклоняя телефон. Слить лишнюю PBS со стороны.
4. Блок путем покрытия образца с 500 μ л PBS / 5% альбумина бычьей сыворотки (BSA) в течение 2 ч при комнатной температуре.
5. Вымойте слайд 3 раза осторожно и косвенно пипетки 500 мкл PBS на образец. Наклоните слайд слить лишнюю PBS.
6. Инкубируйте образца с первичными антителами против вирусных E2A ДНК-связывающего белка (B6-8) в ⁹ в разведении 1: 500 в PBS в течение 2 ч при комнатной температуре. Накройте пятнистый образец с 20 μ л раствора антител и инкубировать во влажной камере, чтобы избежать высыхания.
7. Промыть образец 3 раза ФБР / 0,02% Твин-20, осторожно пипеткой и косвенно 500 μ л PBS на образец. Наклоните слайд стечь эксналог промывочного раствора.
8. Инкубируйте образцы с мышиного антитела IgG вторичного антитела, соединенного с флуорофором, который возбуждается при 488 нм при разведении 1: 2000 в PBS, в течение 1 часа при 4 ° С. Накройте пятнистый образец с 20 μ л раствора антител и инкубировать во влажной камере, чтобы избежать высыхания.
9. Промыть образец 3 раза ФБР / 0,02% Твин-20, осторожно пипеткой и косвенно 500 μ л PBS на образец. Наклоните слайд слить лишнюю промывочного раствора.
10. Накройте пятнистый образец на слайде с помощью покровного стекла 2 μ л PBS / 10% глицерина в качестве крепления среду. Печать с ясно лак для ногтей и магазина аль -20 ºC.
11. Анализ образцов с использованием флуоресцентного микроскопа, с целью 63x и 1,4 числовая апертура, (Na) на длине волны 488 нм.

Результаты

Так вирусные отсеки репликации (RC) являются субъядерных вирусные индуцированной структуры, состоящие из белков и нуклеиновых кислот, подобных других ядерных областей, они оказались пригодны для изоляции от градиентов скорости на основе биохимических особенностей. Критические шаги в ...

Обсуждение

In order to elucidate the molecular mechanisms that govern regulation of cellular activities by viral infection understanding the composition and activities associated with RC would be instrumental. Therefore, to make a detailed analysis of RC, we established a cell-free system that takes advantage of the size and biochemical composition of these virus-induced structures, to isolate subnuclear fractions enriched with RC using a simple procedure that relies on velocity gradients with sucrose cushions. Critical steps of th...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Gibco	12100-046	Warm in 37 ºC water bath before use
Fetal Bovine Serum	Gibco	12484-028
Sucrose, Ultra Pure	Research Organics	0928S	Prepare a 2.55 M stock solution and store at 4 ºC
Dounce homogenizer	Kontess Glass Company	884900-0000
Branson 1800 Ultrasonic Bath	Branson	Z769533 SIGMA	Turn on 15 min before use.
Goat anti-Mouse IgG1 Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	Life Technologies	A-21121	Use at a 1:2,000 dilution in PBS
Silane-Prep Slides	Sigma	S4651-72EA	Open in a laminar flow cabinet
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate	Pierce ThermoScientific	34080