תאי בידוד של תאי Sertoli ו Peritubular מן חולדת האשכים

Summary

תאי Sertoli הראשי נדרשים ללימוד זכות testis-אימוניות, הולך אותות בזמן דלקת או זיהום, וניצול של נכסי immunoprotective שלהם. כאן אנו מתארים פרוטוקול אנזים המבוסס עבור בידוד של תאי Sertoli העיקרי נקיים במיוחד ותאי peritubular מן אשכי חולדה.

Abstract

לאשכים, ובפרט הגמטות הזכריות, קורא תיגר על המערכת החיסונית בדרך ייחודית שהזרע הבדיל מופיעים לראשונה בזמן גיל ההתבגרות - יותר מעשר שנים אחרי הקמת סובלנות החיסונית מערכתית. תאים Spermatogenic להביע מספר חלבונים שעשויים להיראות כמו מה שאינו עצמי על ידי המערכת החיסונית. לאשכים חייב אז יוכלו להקים סובלנות לאנטיגנים-ניאו אלה מצד אחד אך עדיין להיות מסוגל להגן על עצמה מפני זיהומים התפתחות גידולים מצד שני. לכן האשכים הם אחד כמה אתרים חסויים חיסוניים בגוף לסבול אנטיגנים זרים מבלי לעורר תגובה חיסונית דלקתית מזיקה. תאי Sertoli לשחק תפקיד מפתח לשמירה על הסביבה חסויה חיסונית זו של אשכים וגם להאריך הישרדות של תאי cotransplanted בסביבת זרה. לכן התאים Sertoli העיקריים הם כלי חשוב ללימוד זכות החיסונית של האשכים כי לא יכול להיות דוארasily שהחליף שורות תאים הוקם או מודלים תאיים אחרים. כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט ומקיף עבור בידוד של תאים Sertoli - ותאי peritubular אם תרצה בכך - מן האשכים עכברוש בתוך יום אחד.

Introduction

האשכים לייצר גמטות הורמונים זכריים מינית, כלומר, אנדרוגנים. האורגן מורכב משני תאים. בתא ביניים, המייצג כ 10-12% של נפח האשכים הכולל ^1, steroidogenesis מתרחש בתוך התאים ליידיג. תא צינורי מייצג כ 60-80% מנפח האשכים ¹ ומכיל בתאי הנבט שני סוגים של תאים סומטיים - תאים פריטובולרית והפרשה תאי Sertoli. לאשכים מחולקים septa רקמת חיבור לתוך 250-300 אוניות, שכל אחת מהן מכיל 1-3 מאוד ראשוני באבוביות מפותל. Tubules אלה מוקפים על ידי קרום בסיס, גיליון קולגן, ושכבה היקפי של תאי peritubular (איור 1 א).

אפיתל הנבטי ממוקם בצד luminal של קרום הבסיס. תאי Sertoli הם תאים מאורכים גדולים כי ההיקף האפיתל נבטי כולו מן הקרום הבסיסי אל לומן. הם מאוד attכאב קרום הבסיס ויוצר גיליון הסלולר מתמשך דרך צומת הדוקים basolateral מאורגנות חוסם האפיתל הנבטי מן interstitium ומייצג את מחסום הדם-האשך. יש תאים Sertoli תחזיות ציטופלסמית בולטות והשלכות המאפשרות להם להגיע במגע מורפולוגית ופונקציונלי הדוקים עם מספר מינים ספציפיים אך קבוע של תאים ניבטו. תאי גזע נבטי דיפלואידי להתרבות להתמיין spermatogonia.

במהלך המיוזה שאני קצר מועד spermatocytes tetraploid נוצרות המתפתחים נוספים לארבעה spermatids הפלואידים במהלך המיוזה השנייה. כל תאי נבט הם מחוברים על ידי גשרים ציטופלסמית כך שהם יוצרים רשת הסלולר. האירוע העיקרי בתקופת הבשלה של spermatids הוא שהחול של חלקים גדולים של הציטופלסמה, ויצר גופים שיורית, בתהליך הנקרא spermiogenesis. גופי שייר נבחנים phagocytosed ידי תאי Sertoli. spermatids מאוחר ואז משתחררת לתוךלומן הצינור והובל אל יותרת האשך עבור התבגרות נוספת. תאי Sertoli ו בתאי הנבט להופיע לתאם spermatogenesis הדדית טופוגרפית והן מבחינה תפקודית.

הכנת סוגי תאי אשכים בודדים נכתבה לפני כמעט מאה שנה כאשר חתיכות אשכים קטנות עובדו סוגי תאים המזוהים על ידי מיקרוסקופ ^2. על ידי דיסקציה זהירה של tubules לאחר פתיחת Tunica albuginea באמצעות מלקחיים קנס שקצהו אפשר היה מאוחר להפריד צינורי ותאים ביניים ^3. בשנת 1975 וולשית ו וויב הציגה טיפול collagenase כדי לשחרר את tubules מ דבקות רקמת ביניים טיפול pancreatin להסרת שכבת התאים peritubular החיצוני ^4. משחר נעוריה חולדות צעירים לא מפותחות (סביב 20 ימים) נוצלו שבה תא Sertoli מהווה חלק הגדול של אוכלוסיית צינורי התא כי spermatogenesis טרם החל. בשעה זו Sert עכברוש גילoli התאים מפסיקים להתחלק, צמתים הדוקים בין תאים שכנים ליצור כך את מחסום הדם-testis מוקמת ^5.

המבקר של וולשית ו וויב Dorrington et al. הציג שילוב של טריפסין deoxyribonuclease ואחריו מעכב soybeen טריפסין וטיפול collagenase שפורסם באותה שנה ^6. שתי הקבוצות גם השתמשו בכוח מכני (ציור שברי צינורי מתעכל שוב ושוב באמצעות מחט מזרק או פיפטה פסטר בהתאמה) כדי לייצר ההשעיה תא הומוגנית ציפוי המכיל כ 70% תאים Sertoli. לאחר 3 ימים בתרבות, באמצעות מדיום זה סרום ללא, באחוז התאים Sertoli מגדילה בכ -90%. זה יכול להיות מיוחס בעיקר מותו של זיהום בתאי הנבט. תאי peritubular שיורים (PTCs), לעומת זאת, להישאר מחוברים היטב באמצעות תאי מטריקס שלהם. PTCs, אבל לא התאים Sertoli, ידועים לייצרפיברונקטין שיכולים לשמש חלבון סמן להערכת זיהום עם PTCs. לכן, טונג ואח. מנומק כי טיפול hyaluronidase נוסף עשוי לשפר את הטוהר של שבר ⁷ תא סרטולי. ואכן הם יכולים להראות כי טיפול נוסף הצליח להפחית את הזיהום על ידי PTCs כ פי 20, אשר הופך בולט במיוחד כאשר בהשוואה מדיום סרום המכיל משמש לטיפוח התאים Sertoli מטוהרים. מכאן ואילך נוהל משופר ואח טונג. הפך פרוטוקול הרווח וכן נעשה שימוש נרחב על ידי קבוצות גדולות אחרות בתחום ⁸ (איור 1 ב).

במהלך טיפול collagenase רוב PTCs משתחררים ניתן לבודד במקביל לתאי Sertoli. והואיל PTCs במרץ להתרבות אינו מגיב הורמון מגרה זקיק (FSH), תאי Sertoli אינם עוברים מיטוזה יותר ולהגיב FSH ידי שינויים מורפולוגיים מאפייןוגידול monophosphate המחזורית אדנוזין (cAMP) ריכוז ^9. מאוד דומה פרוטוקולים עיכול אנזימטי יכול לשמש עבור בידוד של תאים Sertoli העיקרי מבעלי חיים אחרים כמו גבר ^10, עכבר ^11,12, אוגר סיבירי ¹³ או יאק ^14. למען הסר כמויות גדולות של זיהום בתאי הנבט הלם hypotonic יכול להיות מועסק בסוף ההליך בבידוד ^15. זה מאפשר גם בידוד יעיל של תאים Sertoli מן החולדה למבוגרים האשכים ^16. השעית תא סרטולי מועשרת יכולה גם להפריד בתאי ניבט ידי ציפוי ההשעיה על מנות לקטינים מצופים ב"דאטורה Stramonium agglutinin ^17. רק תאי Sertoli וכמה PTCs שיורית לדבוק צלחות לקטינים.

בתרביות תאים ראשוניים Sertoli, בעיקר מן החולדה, שימשו בתחילה על חקירת היענות להורמונים או הקמת שורות תאים כמו li תא העכבר Sertoline TM4 ^18. שורת תאים זו נחקרה יותר ממאה מחקרים עד היום. בגישה translational תאי Sertoli כבר נוצלו למטרות הגנה חיסונית של תאי שיתוף תרבותיים ורקמות כמו שיתוף השתלת איי לבלב xeno- או אלוגנאית להישרדות שתל לטווח ארוך ללא דיכוי חיסוני מערכתי ^19. תאי Sertoli מבודד גם שימשו בניסויים לתרבות משותפת ללימוד-mesenchymal אפיתל (תאים Sertoli - PTCc) ואת תא סומטי-נבט (תאים Sertoli - תאי נבט) אינטראקציות ^{20, 21.} לאחרונה תאי Sertoli ראשיים הועסק על חקירת הביטוי של קולטנים דמוי אגרה ואת הפרשת ציטוקינים מעודדי דלקת וכן מפלי הולכת אותות המוביל ציטוקינים הביטוי בעקבות זיהום עם א פתוגניים ו uropathogenic coli ^22. חקירות אחרות האחרונות השתמשו בתאי Sertoli ללימוד p אשכים חיסונייםrivilege ²³ והוכיח כי טיפול מקדים טסטוסטרון מדכא את התגובה הדלקתית נגרם LPS ^24.

Protocol

1. הצהרת אתיקה בעלי חיים

הניסויים שתוארו כאן בוצעו על פי הנחיות של Regierungspräsidium גיסן, גרמניה, כמו הרשות המקומית לאשר את קוד הגרמני עיסוק לטיפול ושימוש בחיות לצורך ניסויים (הרשאה מס '. GI 20/23 Nr בן 31 / 2012).

2. הכנת מדיה, פתרונות אנזימים בעלי חיים

1. הכן אלכוהול יוד 1% על ידי המסת 1 גרם של יוד 100 מ"ל אתנול.
2. הכן 500 מ"ל 2x בופר פוספט Dulbecco's (PBS) ללא Ca ^{2 + ו} Mg ²⁺ השלימו כל אחד עם 7.5 מ"ל D- גלוקוז (100 גר '/ ל) ו -5 מ"ל 100x פתרון המניות פניצילין / סטרפטומיצין (15 מ"ג / מ"ל D -glucose, 50 U / ml פניצילין 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין הסופי).
3. מוסף 1x 500 מ"ל מכון ממוריאל פארק Roswell (RPMI) 1640 בינוני עם 5 מ"ל 100x פתרון המניות פניצילין / סטרפטומיצין (50 U / ml פניצילין 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין סנפיראל).
4. הכן פתרון שאני טריפסין-DNase (2.5 מ"ג / מ"ל ​​טריפסין ו -10 מיקרוגרם / מ"ל ​​DNase אני) על ידי הוספת 25 מ"ג טריפסין ו -0.1 מ"ל DNase אני (1 מ"ג / מ"ל ​​DNase I) ל -9.9 מ"ל PBS.
5. ממיסים מעכב טריפסין 50 מ"ג ב 5 מ"ל PBS עבור מעכבי טריפסין פתרון (10 מ"ג / מ"ל). ממיסים מעכב טריפסין 25 מ"ג ב 10 מ"ל PBS עבור פתרון מעכב B טריפסין (2.5 מ"ג / מ"ל).
6. אם אתם מחפשים פתרון Collagenase-Hyaluronidase-Deoxyribonuclease אני (DNase אני) לפזר 10 מ"ג Collagenase (1 מ"ג / מ"ל ​​הסופי), 10 מ"ג Hyaluronidase (1 מ"ג / מ"ל ​​הסופי) ו -0.1 מ"ל DNase אני (1 מ"ג / מ"ל ​​DNase I) ( 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​הסופי) ב 10 מ"ל PBS.
7. הכן פתרון שאני Hyaluronidase-DNase על ידי הוספת 10 מ"ג Hyaluronidase (1 מ"ג / מ"ל ​​הסופי) ו -0.1 הפתרון שאני מ"ל DNase (1 מ"ג / מ"ל) (10 מיקרוגרם / מ"ל ​​הסופי) ל -9.9 מ"ל PBS.
8. להזמין חולדות Wistar על זמן, כך הם 19 ימים ישנים ביום בידוד תא סרטולי.
   הערה: הפרוטוקול המתואר מיועד 10 חולדות אבל יכול להיות שונה עבור מינימום של 5 ועד למקסימום של 20 חולדות.הכרכים של כל הפתרונות צריכים להיות בהתאם.
9. כן פתרון מניות האדום O שמן על ידי המסת 0.35 גרם שמן האדום O ב 100 מיליליטר isopropanol. מערבבים O / N, לסנן דרך 0.2 מיקרומטר ולאחסן ב RT במשך עד שנה.
10. כן פתרון מכתים שמן האדום O על ידי ערבוב 6 מיליליטר פתרון מניות השמן האדום O עם 4 מיליליטר מים (3: 2). לאחר 10-20 דקות מסנן דרך 0.2 מיקרומטר. לשימוש בתוך השעה 2 הבאה.
11. הכן 4% (w / v) פתרון פורמלדהיד במנדף מאוורר על ידי הוספת אבקת 4 גרם paraformaldehyde (PFA) עד 80 מ"ל של 1x PBS תוך ערבוב בעדינות. מחממים עד ~ 60 מעלות צלזיוס, להוסיף 1 מ"ל של 1 M NaOH וממשיכים לבחוש עד paraformaldehyde נמס. תנו פתרון להתקרר RT, להתאים את ה- pH ל 7.4 עם 1 M HCl ואת נפח 100 מ"ל עם 1x PBS. סנן את הפתרון (0.45 מיקרומטר) ולהשתמש טריים או חנות aliquots ב -20 מעלות צלזיוס במשך כמה חודשים.
    הערה: פורמלדהיד polymerized (PFA) depolymerizes לפורמלדהיד monomeric במים. תהליך זה הואמזורז על ידי חימום מתון pH בסיסי מעט. הכן את כל פתרונות האנזים טריים ולסנן לעקר (0.2 מיקרומטר) אותם ביום שימוש. אם יצרן אחר עבור אנזים (ראה חומרים / ציוד טבלה) משמש, להתאים ריכוז / פעילותה בזהירות.
    בפרוטוקול בעקבות "פיפטה" מייצג פיפטה סרולוגיות.

3. הכנת seminiferous קשיות

1. להרדים 10 חולדות Wistar זכר אחד אחד ייבוש באמצעות _CO 2 קצב הזרימה כי מחליף לפחות 20% מנפח התא לדקה. חכו עד מפסיק לנשום, מבחן הרדמה על ידי כיווץ כרית כף הרגל, ואם אין תגובה להרדים בכל עכברוש ידי נקע בצוואר הרחם. מסננים את הדם על ידי חתך וריד הצוואר ואת עורק התרדמה (carotica הנרתיק) תחת מים זורמים. לחטא את הבטן על ידי מנגב עם 70% אתנול.
2. שימוש במלקחיים להרים את העור מפני mus הבטןCles לגזור אונה העור סגלגל כי הוא המשתרעת מאחה הערווה אל עצם החזה (איור 2 א) ומנפנפים אותו כלפי מעלה על החזה. בשלב הבא, לתפוס את שרירי הבטן ולעשות חתך המדיאלי מן מאחת הערווה אל עצם חזה.
   1. סוחטים את הבטן עם האגודלים מן האגן כלפי מעלה על מנת לדחוף את האשכים מתוך האגן התחתון. בחר את כרית השומן epididymal (תרשים 2B) עם מלקחיים עבור משיכת האשכים נוספים. חותכים את חבל הזרע (תרשים 2B), לעזוב את tunica albuginea ללא פגע, לאסוף את כל האשכים ב 20 מ"ל PBS בצינור חרוטי 50 מ"ל (איור 2 ג).
3. לאחר איסוף כל האשכים, לחטא אותם על ידי הוספת נפח שווה (20 מ"ל) של 1% (w / v) יוד באתנול. להפוך את הצינור פעמיים למזוג supernatant מיד. במהירות לשטוף את האשכים פעמיים עם 25 מ"ל PBS כל (איור 2 ד).
4. מעבירים את האשכים כדי בצלחת פטרי המכילותing 15 מ"ל PBS (איור 2E). אחוז אחד testis בחוזקה מלקחיים בקצה אחד, לעשות חתך קטן לתוך albuginea Tunica בקצה שני, ואת לסחוט את tubules באמצעות להבי מספריים סגורים ככלי גירוד.
   הערה: tubules עדיין צריך ליצור צרור קומפקטי בצורת אשך עם רק כמה tubules הארכת לתוך התמיסה על מנת לאפשר עיכול אנזימטי הומוגנית (איור 2F).
5. מעבירים את האשכים לתמצת אותה-דה בקבוק 100 מ"ל בורג מכסה המכיל 10 מ"ל טריפסין- DNase לי פתרון. בצעו את העיכול באמבט מים רועד ב 32 ° C (120 תנודות / min). לאחר 4 דקות להעריך את tubules בעין בלתי מזוינת לגבי פיזור tubules. לאחר tubules להתחיל לפזר לתוך התמיסה, לעצור את העיכול מיד. במידת הצורך, להמשיך דגירה של עד 2 דקות.
6. עצור העיכול טריפסין על ידי הוספת 5 מ"ל של א פתרון מעכב טריפסין לערבב ביסודיות את הפתרון על ידי pipetting למעלה ולמטה 3-4 זמןזה בעזרת פיפטה 10 מ"ל ולהעביר אותו צינור חרוטי 50 מ"ל.
7. אחרי 5 דקות של הדגירה להתבונן tubules להתיישב על ידי כוח המשיכה היחידה, ובזהירות להסיר את supernatant באמצעות פיפטה 10 מ"ל משלב 3.6 ולהוסיף 10 מ"ל של תמיסת B מעכב טריפסין על מנת מלא להפסיק העיכול טריפסין. Resuspend את tubules ידי pipetting למעלה ולמטה 2-3 פעמים.
8. כדי להסיר זיהום תאים ביניים לשטוף את tubules 9 פעמים עם 25 מ"ל PBS לכל. Resuspend tubules בכל לשטוף באמצעות פיפטה 25 מ"ל ולאפשר להם להתיישב על ידי כוח המשיכה היחידה במשך 10 דקות. השתמש תמיד באותה 25 מ"ל פיפטה עבור pipetting PBS, resuspension והסרת supernatant.

4. הסרה / בידוד של תאי Peritubular (PTCs)

1. להעביר את כל tubules כדי בקבוק 100 מ"ל בורג מכסה ומוסיפים את הפתרון שאני Collagenase-Hyaluronidase-DNase (איור 3 א). בצע עיכול במשך 10 דקות באמבט מים רועד ב 32 ° C (120 תנודות / min).
2. Pipet ירידה של השעיה בשקופית זכוכית ובמהירות לבדוק את tubules תחת מיקרוסקופ אור הפוך עבור תרבית תאים שגרו בהגדלה 100x. אם העיכול אינו מתקדם מספיק להמשיך דגירה של 2 דקות נוספות (לא סופר את הזמן דרוש לבדיקת Microscopical).
   הערה: במהלך שלב זה כל tubules לקבל מקוצר בקצוות באורך אבובית צריך להיות גס (איור 3B ו- C). קצוות גסים הם אינדיקציות על שחרורו של תאי peritubular.
3. מעבירים את ההשעיה עם tubules מתעכל צינור חרוטי 50 מ"ל בעזרת פיפטה 25 מ"ל משלב 3.8. לשטוף את הבקבוק 100 מ"ל עם 10 מ"ל PBS ולהוסיף אותו tubules בצינור חרוטי. אפשר tubules מתעכל להתיישב על ידי כוח המשיכה היחידה במשך 10 דקות, ובזהירות לשאוב supernatant, המכיל את PTCs, בעזרת פיפטה 25 מ"ל שוב, ולהעביר אותו צינור חרוטי חדש. שאיפה של המ"ל האחרון להשתמש פיפטה 5 מיליליטר ב יורדr כדי למנוע מעבר של tubules.
4. הוסף 20 מ"ל RPMI 1640 בינוני בתוספת 10% עוברי חום מומת בסרום שור (FBS) אל supernatants אבובית שנאספו, לערבב צנטריפוגות ב XG 300 במשך 10 דקות ב RT ללא שימוש ההפסקה.
5. בזהירות למזוג supernatant ו resuspend PTCs pelleted ב 20 מ"ל RPMI בינוני 1640 בתוספת 10% חום מומת FBS וזרעי 4 מ"ל כל על חמש צלוחיות T75 המכיל 16 מ"ל בינוני אחד. לדגור על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO ₂ האווירה (איור 4 א).
6. ביום 3 ^rd של תרבות trypsinize את PTCs ולפצל אותם 1: 2 על צלוחיות T75 המכיל בינוני 16 מ"ל RPMI 1640 בתוספת 10% חום מומת FBS כל (התשואות 10 צלוחיות לגמרי) (איור 4 ב). המשך דגירה על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO ₂ האווירה.
7. ביום ^ה -5 של תרבות trypsinize את PTCs שוב צלחת אותם על צלחות 6-היטב או 24 גם תלוי בניסוי(בבקבוק T75 אחד לכל צלחת). ניסויים יכולים להתבצע ביום 6.

בידוד 5. תא סרטולי (SCS)

1. Resuspend את tubules התיישבו משלב 4.3 ביסודיות 25 מ"ל של PBS באמצעות פיפטה 25 מ"ל ולאפשר להם להתיישב על ידי כוח המשיכה היחידה במשך 12 דקות. השתמש פיפטה אותו 25 מ"ל עבור pipetting PBS, resuspension של tubules והסרת supernatants. חזור על לשטוף 3 פעמים (4 שוטף בסך הכל).
2. לאחר לשטוף האחרון להעביר את tubules מתעכל ל -100 מ"ל אחר בורג מכסה הבקבוק המכיל את הפתרון שאני Hyaluronidase-DNase. בצעו את העיכול באמבט מים רועד ב 32 ° C (120 תנודות / min).
3. לאחר 5 דקות לבדוק את tubules שוב על ידי בדיקה מיקרוסקופית אור בהגדלה 100X כמתואר בשלב 4.2.
   הערה: tubules קצר, אגרגטים צינורי ותאי שוחרר צריך להיות גלוי (איור 3D).
   1. אפשר המצרפים צינורי להסתפק 10 דקות, לשאוב supernatant לנוing פיפטה 25 מ"ל. לשטוף אגרגטים 4 פעמים באמצעות 25 מ"ל PBS ו זמן שקיעה של 10 דקות לכל שלב הכביסה (איור 3E).
4. הוסף 20 מ"ל של מדיום 1640 RPMI ולהעביר את ההשעיה 10 פעמים באמצעות מחט 18 G רכוב על מזרק 20 מ"ל. הימנע בועות אוויר.
   הערה: משיכת ההשעיה פנימה והחוצה דרך המחט נחשב במעבר אחד. השיבוש ויצירת הומוגניות של תאים על ידי המריחה הידרודינמית הוא טכניקת תקן בהכנת התאים נוטים לצבור. פטירתו של תאים באמצעות מחט מזרק של קוטר פנימי קטן לא סביר להשפיע על מאפייני הפעילות שלהן ^25. איור 5 ג ו-ד 'מציגים את ultrastructure הנורמלי של תאי Sertoli מטוהרים ביום 4 של התרבות.
   1. Pipet ירידה של השעיה בשקופית זכוכית ובמהירות לבדוק את tubules תחת מיקרוסקופ אור הפוך עבור תרבית תאים שיגרתיות 10X הגדלה אם AGGregates כולם התפזרו (איור 3F). סנן את ההשעיה התא דרך מסננת תא 70 מיקרומטר כדי לקבל השעיה תא בודד טהור תסנין.
5. צנטריפוגה תסנין של צעד 5.4 ב XG 200 במשך 10 דקות ב RT ללא שימוש ההפסקה. בזהירות לשאוב supernatant בעזרת פיפטה 25 מ"ל, ו resuspend התאים Sertoli ב 40 מ"ל RPMI 1640 בינוני (סרום ללא).
6. מערבבים 100 ההשעיה תא μl עם 100 μl של Trypan כתם כחול לספור תאים עם תא נויבאואר משופר. התאם את הריכוז התא 3 x 10 ^{6 תאים} / מ"ל פי התוצאה והיד עוד נטויה. זרע 1 מ"ל לכל טוב על צלחת 6-היטב (= יום 1). אם מכתים O האדום השמן (שלב 6) מתוכנן לשים לכסות להחליק לתוך אחד או כמה בארות לפני זריעת תאי Sertoli.
   הערה: תאי Sertoli השעיה ליישב במהירות, כך הצינור צריך להיות מזועזע בקצרה בכל פעם לפני aliquot תא נלקח עם פיפטה. עד היום 4 היא בתקיפות attACH לתשתית.
7. על מנת להסיר תאים ניבטים צף או חסיד ביום 4 (איור 4C) לשטוף היטב כל 6 הצלחות היטב המשמשות תאי ציפוי Sertoli מבודדים (שלב 5.6) עם PBS (4D האיור). לשאוב את המדיום, להוסיף 1-2 מ"ל של PBS היטב כל ולנער את 6 צלחות היטב אופקית על שולחן במרץ אך מבלי לשפוך PBS. חזור על לשטוף 3 פעמים ולבצע אותו נוהל כביסה ביום 5 ו -6 (4E איור).
   הערה: על תאי Sertoli יום 4 יש מחוברים היטב ולהראות המרוצף כמו דפוס תחת מיקרוסקופ האור ההפוך (איור 4C). ניסויים יכולים להתבצע מהיום 7 ואילך.
   1. (חלופה עבור צעד 5.7) למען הסר צף בתאי הנבט חסיד לבצע זעזוע hypotonic 3 ימים אחרי זריעת על 6 צלחות היטב. הסר את בינונית ומוסיפים 1 מ"ל של 20 מ"מ טריס pH 7.5 נלקח ישירות מהמקרר. לשאוב למאגר טריס לאחר 90 עד 120 שניות אבל לאיותר מאוחר. פעמיים שטפו תאים עם PBS, ולהוסיף 2 מ"ל של RPMI 1640 בינוני (סרום ללא). לחלופין, לבצע ניסויים למחרת.
      הערה: ככל שמשך הזמן ארוך של הלם hypotonic הוא בתאי הנבט יותר ניתן להסיר אבל התאים Sertoli יותר ללכת לאיבוד גם כן. לשטוף PBS הראשון צריך להתבצע במהירות אך בזהירות כדי לא לתפוס את כל התאים Sertoli. מייד לאחר vacuoles רב טיפול hypotonic בגדלים שונים ניתן להבחין בציטופלסמה ידי מיקרוסקופ לעומת שלב. Vacuoles להיעלם תוך מספר שעות לאחר הטיפול hypotonic.

מכתים 6. O האדום השמן

1. ביצוע כל הצעדים ב RT. ביום 7 תאים לשטוף Sertoli גדל על תלוש כיסוי (שלב 5.6) עם PBS פעמיים ולתקן אותן עם פורמלין 10% ב PBS. לאחר 10 דקות להחליף פורמלין עם פתרון טרי, ולהמשיך קיבוע במשך 60 דקות אחרות.
   הערה: כל הפתרונות מתווספים גם (ים) עם תלוש כיסוי ו aspirated לפני השלב הבא.
2. לשאוב פורמלין, לשטוף תאים עם מים פעמיים ולהוסיף 60% isopropanol. לאחר 5 דקות ולאפשר לתאי אוויר יבש במשך כמה דקות.
3. הוסף 1 מ"ל פתרון מכתים שמן האדום O לכל היטב דגירה במשך 10 דקות. לשאוב את הפתרון, ולשטוף תאים מייד 4 פעמים במי ההר תלוש לכסות גליצרול-PBS (9: 1). קח תמונות שדה בהיר עם מיקרוסקופ אור שגרתית (איור 4F).

7. Immunofluorescence מכתים

1. לשטוף PTCs (משלב 4.5) או תאי Sertoli (משלב 5.5) גדלו על תלוש כיסוי עם PBS פעמים ולתקן אותן עם 4% PFA במשך 10 דקות ב RT.
2. דגירה עם BSA 5% ב PBS עבור שעה 1 ב RT. מחק את הפתרון BSA-PBS ולהוסיף פתרון BSA-PBS טרי המכיל אקטין (שריר חלק) (עבור PTCs) או vimentin (עבור תאי Sertoli) נוגדן ראשוני (דילול 1: 100 עבור שני נוגדנים) דגירה על 4 ° CO / N.
   הערה: דגירה עם בלוקי BSA מחייבים הלא ספציפיים של נוגדן ראשוני.
3. כיסוי לשטוף מחליק 3 פעמים במשך 5 דקות בתוך Tween% PBS-0.1 20 דגירה עם נוגדנים משני אנטי עכבר עז מצומדות צבע ירוק ניאון (דילול 1: 1,000) ב RT עבור שעה 1 בחושך.
4. כיסוי לשטוף מחליק 3 פעמים במשך 5 דקות בתוך Tween% PBS-0.1 20 ולעגן אותם במדיום הרכבה DAPI.

8. ניתוח ultrastructural

1. לשטוף את התאים Sertoli (משלב 5.6) גדל על צלחת תרבית תאים 6 ס"מ עם PBS ולתקן אותם עבור שעה 2 ב 4 ° C בתערובת של glutaraldehyde 2.5%, paraformaldehyde 2.5% וחומצה picric 0.05% במאגר cacodylate 67 מ"מ ( pH 7.4) על פי איטו Karnovsky ^26.
2. בצע-קיבעון הדואר tetroxide אוסמיום 1% ואחריו הדגירה O / N ב אצטט uranyl 0.3% מומס 50 מ"מ חיץ maleate (pH 5). דגימות שבץ הטבעת תקשורת על פי נהלים קבועים. חותכים חלקים דקים, בניגוד להם עם ציטראט להוביל ולבחון עם מיקרוסקופ אלקטרונים.

תוצאות

ההליך המתואר מאפשר בידוד של כ 12 x 10 ^{7 תאים} Sertoli מ -10 האשכים חולדה. 3 x 10 ⁶ תאים מצופים בכל טוב על צלחת 6-היטב, כך שש עד שבעה 6 צלחות גם זמינות עבור ניסויים ביום 7. עיכול טריפסין-DNase I הוא השלב הקריטי ביותר במהלך בידוד תא סרטולי. אם עיכול בנקודה זו ...

Discussion

The seminiferous tubules are bounded by a circular layer of peritubular cells and a basal lamina on the luminal side. Sertoli cells are resting on the basal lamina, establish the blood testis barrier through formation of occluding junctions between adjacent cells and provide the structural framework for the organisation of the seminiferous epithelium. Sertoli cells and adjacent spermatogenic cells maintain intimate contacts throughout germ cell development providing physical contact and communication alike. Therefore, wh...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Actin (smooth muscle) antibody clone 1A4	Dako	M0851	Monoclonal mouse anti human antibody. Use 1:100 dilution for immunofluorescence.
Albumin bovine fraction V Standard grade, lyophilized	Serva	11930.04	Filter (0.45 µm) BSA solutions used for immunofluorescence.
Corning Cell Strainers 70 µm	Corning	431751	White color
Collagenase A from Clostridium histolyticum	Roche	10103586001
DAPI mountant ProLong Gold Antifade	Life technologies	P-36931
D-glucose	Sigma	G8644	100 g/L
Dulbecco´s PBS without Ca2+/Mg2+	Gibco	14190-094
DNase I	Roche	10104159001
Electron microscope	Zeiss	EM 109S
Fluorescence microscope	Zeiss	Axioplan 2
Hyaluronidase from bovine testis	Sigma	H3506
Inverted light microscope	Olympus	CKX41	Routine cell culture microscope
Mouse IgG / IgM (H+L) polyclonal secondary Antibody	Life technologies	A-10684	Alexa Fluor 488 conjugate
Oil Red O	Sigma	O0625	Has replaced Sudan III and Sudan IV because of brighter color.
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
Penicillin (5,000 U/ml)/ Streptomycin (5,000 µg/ml)	Gibco	15070-063	100x solution
RPMI-1640	Gibco	21875-034	Contains 300 mg/L L-glutamine
Trypsin from porcine pancreas	Sigma	T5266
Trypan Blue Stain (0.4%)	Gibco	15250-061
Trypsin inhibitor from soybean	Sigma	T6522	The Sigma product is considerably cheaper than the previously used BPTI (Aprotinin) from Roche.
Vimentin antibody (V9)	Sigma	V6630	Monoclonal mouse anti pig vimentin antibody.  Use 1:100 dilution for immunofluorescence.
Wistar WU rats	Charles River		Should be 19 days old on day of experiment.