Sıçan Testislerindeki Sertoli Hücreleri İzolasyon ve peritübüler Hücreler

Özet

Birincil Sertoli hücreleri immüno özelliklerinin iltihap ya da enfeksiyon ve yararlanma sırasında testis immün ayrıcalığı, sinyal transdüksiyonunu çalışmak için gereklidir. Burada yüksek derecede saflaştırılmış birincil Sertoli hücreleri ve sıçan testis peritübüler hücrelerin izolasyonu için bir enzim bazlı protokol açıklar.

Özet

farklılaştırılmış sperm ilk ergenlik dönemindeki görünür, çünkü testis ve özellikle erkek gamet olarak, benzersiz bir şekilde bağışıklık sistemini zorlukları - on yıldan fazla sistemik immün tolerans kuruluşundan sonra. Spermatogenik hücreler bağışıklık sistemi tarafından kendi-olmayan olarak kabul edilebilir bir protein dizi ifade eder. Testis daha sonra, bir yandan, bu neo-antijenlere karşı tolerans oluşturmak ancak diğer yandan enfeksiyon ve tümör gelişimi korunmak mümkün olmalıdır. Bu nedenle testis zararlı inflamatuar immün yanıtı çağrıştıran olmadan yabancı antijenleri tolere vücutta birkaç bağışıklık ayrıcalıklı yerlerden biridir. Sertoli hücreleri testis bu bağışıklık ayrıcalıklı bir ortamda sürdürülmesi için kilit rol oynayacak ve aynı zamanda yabancı bir ortamda cotransplanted hücre yaşam süresini. Bu nedenle birincil Sertoli hücreleri, e olamaz testisin bağışıklık ayrıcalığını eğitim için önemli bir araçtırasily yerleşik hücre hatları veya başka bir hücresel modellerinde ile ikame. ve istenirse peritübüler hücreler - - sıçan testis tek bir gün içinde burada Sertoli hücrelerinin izolasyonu için detaylı ve kapsamlı bir protokol mevcut.

Giriş

Testisler, androjenler yani erkek gamet ve cinsel hormonları üretir. Organ iki bölmeden oluşmaktadır. Interstisyel bölmesindeki, o steroidogenez Leydig hücreleri içinde yer alır, toplam testis hacmi ¹ yaklaşık% 10-12 temsil etmektedir. Boru şeklindeki bölme testis hacmi ¹ yaklaşık 60-80% temsil ve germ hücreleri ve somatik hücre iki tür içerir - peritübüler hücreler ve Sertoli hücrelerinin. testis, her 1-3 derece kıvrık seminifer tübüller içeren, 250-300 lobülleri içine bağ dokusu septa bölünür. Bu tübüller bazal membran kollajen tabakası ve peritübüler hücrelerin bir çevresel katman (Şekil 1A) içine alınır.

Germinal epitel bazal membran luminal tarafında yer almaktadır. Sertoli hücreleri lümene bazal membran bütün germinal epitel kapsayan geniş uzun hücrelerdir. Onlar güçlü olan attbazal membran ağrıyordu ve interstisyumda gelen germinal epitel tıkar ve kan-testis bariyerini temsil bazolateral organize sıkı kavşaklar sayesinde sürekli hücresel tabaka oluştururlar. Sertoli hücreleri belirgin sitoplazmik çıkıntıları ve germ hücrelerinin bir türe özgü ama sürekli numarası ile sıkı morfolojik ve fonksiyonel temas almak sağlayacak etkileri vardır. Diploid germinal kök hücreleri çoğalır ve spermatogonia farklılaşırlar.

mayoz sırasında mayoz II sırasında daha fazla dört haploit spermatidler haline oluşturulan tetraploid spermatositlerde kısa ömürlü. bir hücresel ağ oluştururlar ve böylece tüm germ hücreleri sitoplazmik köprüler ile birbirine bağlanır. spermatidlerin olgunlaşması sırasında ana olay Spermiyogenez denilen bir süreçle, kalıntı organları oluşturan, sitoplazmanın büyük parçaların ekstrüzyon olduğunu. Kalıntı organları Sertoli hücreleri tarafından fagosite edilir. Geç spermatid sonra içine salınırtübüler lümen ve daha olgunlaşması için epididime taşınır. Sertoli hücreleri ve tohum hücreleri karşılıklı topografik ve fonksiyonel spermatogenezi koordine etmek görünür.

Küçük testis parçaları ekili ve hücre türleri mikroskopla ² tarafından tespit edildiğinde bireysel testiküler hücre tiplerinin hazırlanması neredeyse bir asır önce başladı. Ince uçlu forseps kullanarak tunika albuginea'yı açtıktan sonra tübül dikkatli diseksiyon ile tubuler ve interstisyel bölmeleri ³ ayırmak, daha sonra mümkün olmuştur. 1975 yılında Galler ve Wiebe interstisyel doku ve dış peritübüler hücre tabakasının ⁴ çıkarılması için bir pankreatini tedavi yapışmasını tübülleri boşaltmak için bir kollajenaz tedavi tanıttı. erken genç olgunlaşmamış fareler üzerinde (eski 20 civarında gün) içinde kullanılmaya başlanmış itibaren spermatogenez henüz başlamamış çünkü Sertoli hücreleri tübüler hücre nüfusun büyük bir kısmını oluşturmaktadır. Bu yaş sıçan Sert atoli hücreleri bölünmeye son ve kan-testis bariyeri ⁵ kurulmuştur, böylece komşu hücreler arasındaki sıkı bağlantılar oluşturur.

Welsh ve Wiebe Dorrington ve ark., Bağımsız olarak tripsin bir kombinasyonunu ortaya aynı yıl ⁶ yayınlanan soybeen tripsin inhibitörü ve kolajenaz bunu takiben deoksiribonükleaz. Her iki grup, aynı zamanda, yaklaşık% 70 sertoli hücreleri içeren kaplama için homojen bir hücre süspansiyonu üretmek için (bir şırınga iğnesi veya, sırasıyla, bir Pasteur pipeti ile tekrar tekrar sindirilmiş boru şekilli parçaların çizilmesi) mekanik kuvvet kullanılır. serumsuz bir ortam kullanılarak kültür içinde 3 gün sonra, sertoli hücreleri yüzdesi, yaklaşık% 90 artar. Bu büyük ölçüde germ hücrelerine kirlenmesine neden ölümü isnat edilebilir. Kalıntı peritübüler hücreleri (PTCs), bununla birlikte, sıkıca hücre dışı matrisin üzerinden bağlı kalır. PTCs ancak Sertoli hücreleri üretmek için bilinmektedirPTCs kontaminasyonun tahmin edilmesi için bir markör proteini olarak hizmet edebilir fibronektin. Bu nedenle, Tung ve ark. Ek hyaluronidaz tedavi Sertoli hücre fraksiyonu ⁷ saflığını artırmak olabilir gerekçeli. Gerçekten de ek bir tedavi kıyasla serum ihtiva eden bir ortam saflaştırılmıştır sertoli hücreleri yetiştirilmesi için kullanıldığında özellikle belirgindir hale geldiği, yaklaşık 20-kat PTCs kirlenmeyi azaltmak mümkün olduğunu gösterebilir. Bundan sonra Tung ve ark geliştirilmiş prosedürü. hakim protokolü oldu ve yoğun ^alanda 8 (Şekil 1B) diğer büyük gruplar tarafından kullanılmıştır.

kollajenaz muamelesi sırasında PTCs çoğunluğu serbest bırakılır ve sertoli hücreleri paralel olarak izole edilebilir. PTCs şiddetle çoğalır ve folikül stimüle edici hormon (FSH) yanıt vermeyen Oysa, Sertoli hücreleri artık mitoz geçiren ve karakteristik morfolojik değişikliklerin FSH yanıt vermeyenve siklik adenosin monofosfat (cAMP) konsantrasyonda ⁹ bir artış. Çok benzer bir enzimatik sindirim protokolleri erkek ^10, fare ^11,12, Sibirya hamsteri ^{13 veya} yak ¹⁴ gibi diğer hayvanlardan elde edilen primer Sertoli hücrelerin izolasyonu için de kullanılabilir. Germ hücreleri bir hipotonik şok kirletici büyük miktarlarda çıkarılması için izolasyon prosedürü ¹⁵ sonunda kullanılabilir. Yetişkin sıçan ¹⁶ testis Bu, sertoli hücreleri etkili izolasyonunu sağlayan. Bir zenginleştirilmiş Sertoli hücre süspansiyonu da dozdaki ile aglutinin ¹⁷ kaplı lektin yemekleri süspansiyon kaplama ile germ hücrelerinden ayrılabilir. Sadece Sertoli hücreleri ve birkaç kalıntı PTCs lektin plakalara uygun.

Birincil Sertoli hücre kültürleri, özellikle sıçan, fare Sertoli hücre li gibi hücre hatları hormonlara yanıt soruşturma veya kurmak için başlangıçta kullanılmaktadırne TM4 ^18. Bu hücre hattı bugüne kadar yüzden fazla çalışmalarda araştırılmıştır. Bir translasyon yaklaşımda Sertoli hücreleri sistemik bağışıklığı ¹⁹ olmayan ko-kültürlenmiş hücreler ve uzun vadede aşı yaşamda kalması hakkında kseno veya allojenik pankreas adacıklarının eş nakli gibi doku immüno korunması için kullanılmaktadır. Ve somatik-germ hücresi (Sertoli hücreleri - germ hücreleri) ^{20 etkileşimleri, 21} - İzole Sertoli hücreleri de epitel-mezenkimal (PTCC Sertoli hücreleri) çalışmak için ko-kültür deneylerinde kullanılmıştır. Son zamanlarda birincil Sertoli hücreleri patojenik ve üropatojenik E. ile enfeksiyonu takiben ifadeyi sitokin yol açan Toll benzeri reseptörler ifadesini ve proinflamatuar sitokinlerin salgılanmasını yanı sıra sinyal iletimi kaskadlarını araştırmak için istihdam edilmiştir E. coli ^22. Diğer son araştırmalar testis bağışıklık p incelemek için sertoli hücreleri kullanılarak yapıldırivilege ²³ ve testosteron ön arıtma LPS ile güdülenmiş ateşli tepkiyi ²⁴ bastırdığını göstermiştir.

Protokol

1. Hayvan Etik Beyanı

Burada anlatılan deneyler, yerel otorite olarak, Regierungspräsidium Giessen, Almanya kurallarına göre yapılır ve Deneysel Amaçlı Hayvanların Bakım ve Kullanım Uygulama Alman Kanunu (İzin yok onaylamak edildi. GI 20/23 sayılı A 31 / 2012).

Medya, Enzim Çözümleri ve Hayvanların 2. Hazırlık

1. 100 mi etanol içinde iyot, 1 g çözülmesiyle% 1 iyot alkol hazırlayın.
2. 2x 500 mi Dulbecco's fosfat tamponlu tuzlu su 7.5 mi, D-glükoz (100 g / L) ve 5 ml 100X Penisilin / Streptomisin stok çözeltisi (15 mg / ml D, her takviye Ca olmayan (PBS) ^{+ 2 ve Mg} + 2 hazırlamak -glükoz, 50 U / ml penisilin ve 50 | ig / ml streptomisin nihai).
3. 500 mi Roswell Park Memorial Institute (RPMI), 5 mL 100X Penisilin / Streptomisin stok çözeltisi (50 U / ml penisilin ve 50 | ig / ml streptomisin yüzgeç 1640 ortamında 1 x Ekal).
4. tripsin DNaz I solüsyonu hazırlayın (2.5 mg / tripsin ve 10 ug / ml DNase I mi), 25 mg tripsin ve 0.1 ml DNAz ekleyerek ortaya 9.9 mL PBS (1 mg / ml DNase I).
5. Bir çözeltisi (10 mg / ml) tripsin önleyicisi 5 ml PBS içinde 50 mg tripsin inhibitörü içinde çözülür. Tripsin inhibitörü B çözeltisi 10 ml PBS (2.5 mg / ml) içinde 25 mg tripsin inhibitörü içinde çözülür.
6. Bir Kollajenaz-Hiyaluronidaz Deoksiribonükleaz I (DNase I) çözeltisi (1 mg / ml nihai), 10 mg Kollajenaz A, 10 mg Hiyaluronidaz (1 mg / ml nihai) ve 0.1 mi DNaz çözülür I (1 mg / ml DNase I () 10 ug 10 mi, PBS içinde) son / ml olmuştur.
7. 9.9 ml PBS, 10 mg Hiyaluronidaz (1 mg / ml nihai) ve 0.1 mi DNaz I çözeltisi (1 mg / ml) (10 ug son / ml) ilave edilerek, bir Hiyaluronidaz DNaz I çözelti hazırlayın.
8. Onlar Sertoli hücre izolasyonu gününde 19 gün eski böylece zamanında Wistar sıçan sipariş edin.
   Not: Açıklanan protokol 10 sıçanlar için tasarlanmıştır, ancak en az 5, 20 sıçan en fazla modifiye edilebilir.Tüm çözeltilerin miktarları buna göre ayarlanması gerekir.
9. 100 mi izopropanol içinde 0.35 g Yağ Kırmızı O çözülmesiyle, Yağ Kırmızı O stok çözelti hazırlayın. Stir O / N, en fazla bir yıl süreyle oda sıcaklığında 0,2 um ve mağaza üzerinden filtre.
10. 4 ml su ile 6 mi, Yağ Kırmızı O stok solüsyonu karıştırılarak yağ kırmızısı çözelti hazırlayın (3: 2). 0.2 mikron ile 10-20 dk süzdükten sonra. Bir sonraki 2 saat içinde kullanın.
11. % 4 Hazırlama yavaşça karıştırılırken 1x PBS 80 ml ila 4 g paraformaldehit tozu (PFA) ekleyerek havalandırılmış başlığı içinde formaldehit çözeltisi (w / v). Isı ~ 60 ° C, 1 M NaOH ile 1 ml ilave edilir ve paraformaldehit çözünene kadar karıştırma devam etmektedir. Çözelti, oda sıcaklığına kadar soğumaya 1 M HCI ile 7.4 pH'a ve 1 x PBS, 100 ml hacim ayarlama olsun. çözeltisi (0.45 um) filtreden geçirilir ve birkaç ay boyunca -20 ° C 'de parçalar halinde taze veya deposu kullanımı.
    Not: polimerize formaldehit (PFA) su içinde monomerik formaldehite depolimerize eder. Bu süreçorta derecede ısıtma ve hafif baz pH ile katalize. taze tüm enzim çözümleri hazırlayın ve filtre kullanımı gününde (0.2 uM) sterilize. Bir enzim için farklı bir üretici (Malzeme / Ekipman Tablosu) Eğer dikkatlice konsantrasyonu / aktivitesini ayarlamak kullanılır.
    Aşağıdaki protokolde bir "pipet" bir serolojik pipet anlamına gelir.

Seminifer tübül 3. hazırlanması

1. _CO2 kullanarak bir desikatör ve dakikada odacık hacminin en az% 20 oranında değiştiren bir akış oranında, 10 erkek Wistar sıçanları tek tek anestezisi. Bir ayak pedi sıkarak nefes duruncaya kadar test anestezi bekleyin ve varsa hiçbir tepki servikal dislokasyon her sıçan euthanize. akan su altında juguler ven ve karotis arter (vajina carotica) kesit ile kan akıtmak. % 70 etanol ile silerek karın dezenfekte edin.
2. Forseps karın mus cildi kaldırınkartılması sternum (Şekil 2A) için pubis eklemi uzanan bir oval şekilli cilt lob kesip ve göğüs üzerine yukarı doğru flap. Sonraki, karın kasları kapmak ve sternum pubis eklemi bir medial kesi yapmak.
   1. yukarı aşağı pelvis dışına testis itmek için pelvis gelen başparmak ile karın sıkın. Ayrıca testis yukarı çekmek için forseps ile epididimal yağ yastığı (Şekil 2B) seçin. Tunika albugineada zedelemeden, sperm kablosu (Şekil 2B) kesin ve 50 ml konik bir tüp (Şekil 2C) 20 ml PBS içinde testis toplar.
3. testis topladıktan sonra, etanol içinde iyot (ağ / hac)% 1 eşit hacimde (20 mi) ilave edilerek dezenfekte. İki kez tüp ters çevirin ve hemen süpernatant süzün. Hızlı bir şekilde 25 ml PBS, her (Şekil 2D) ile iki kez testisler yıkayın.
4. ihtiva Bir Petri kabı testisler aktarın15 mi ing PBS (Şekil 2e). , Bir ucunda forseps ile sıkıca her testis kavramak ters sonunda tunika albugineada içine küçük bir kesi yapmak ve bir kazıma aracı olarak kapalı makas bıçakları kullanarak tübüller sıkmak.
   Not: tübül hala sadece bir kaç tübüller homojen enzimatik sindirim (Şekil 2F) sağlamak amacıyla çözelti içine uzanan ile kompakt bir testis şeklindeki paket oluşturmalıdır.
5. 10 ml tripsin-DNase I çözeltisi ihtiva eden 100 ml'lik bir vida kapaklı şişeye de-kapsüllü testisler aktarın. 32 ° C (120 salınım / dakika) bir çalkalama su banyosu içinde sindirim gerçekleştirin. 4 saat sonra en az tübül dispersiyon için çıplak gözle tübülleri değerlendirir. tübüller solüsyon içine dağıtmak başladığınızda, hemen sindirim durdurun. Gerekirse, en fazla 2 dakika boyunca inkübasyona devam edin.
6. aşağı 3-4 defa iyice yukarı pipetleme çözüm karıştırmak tripsin inhibitörü çözüm A. 5 ml ekleyerek tripsin sindirim durdurun ve10 ml'lik pipet kullanarak ve bir 50 ml konik tüp transfer s.
7. inkübasyon 5 dakika sonra tübül dikkatlice adım 3.6 10 ml pipet kullanarak süpernatant kaldırmak ve tam tripsin sindirim durdurmak için tripsin inhibitörü B çözeltisi 10 ml ekleyin, birim yerçekimi tarafından yerleşmek gözlemlemek. aşağı 2-3 kez yukarı ve aşağı pipetleme tübülleri tekrar süspansiyon.
8. kirlenmesine neden kaldırmak için geçiş hücreleri 25 ml PBS her biri tübülleri 9 kez yıkayın. 25 ml'lik bir pipet kullanarak her yıkama tübülleri tekrar süspansiyon ve onları 10 dakika boyunca birim yerçekimi tarafından yerleşmek için izin verir. Her zaman PBS, tabanda ve süpernatant kaldırılmasını pipetle için aynı 25 ml pipet kullanın.

Peritubular Hücreleri 4. Sökme / İzolasyon (PTCs)

1. 100 ml'lik bir vida kapaklı şişeye Tüm tübüller aktarın ve kollajenaz-Hiyaluronidaz DNaz I çözeltisi (Şekil 3A) ekleyin. (120 titreşimler / dakika) 32 ° C'de çalkalanan bir su banyosu içinde 10 dakika için sindirim gerçekleştirme.
2. Pipetleyin cam slayt süspansiyon bir damla ve hızlı bir şekilde 100x büyütmede rutin hücre kültürü için bir ters ışık mikroskobu altında tübülleri kontrol edin. sindirim gelişmiş değilse yeterli (mikroskobik kontrolü için gereken zamanı saymazsak) Ek 2 dakika süreyle inkübasyon devam ediyor.
   Not: Bu adım sırasında tüm tübüller (Şekil 3B ve C) kaba haline gelmelidir uzunluk ve tübül kenarlarında kısaltılmış olsun. Kaba kenarları peritübüler hücrelerin serbest bırakılması için göstergesidir.
3. Adım 3.8 25 ml pipet kullanarak 50 ml konik tüp sindirilir tübüllerden ile süspansiyon aktarın. 10 ml PBS ile 100 ml'lik şişe yıkayın ve konik tüp tübüllerden ekleyin. Yine 25 ml pipet kullanarak, PTCs içeren, sindirilmiş tübüller süpernatant 10 dakika boyunca birim çekimi ile yerleşmek ve dikkatlice aspire izin verin ve yeni bir konik tüp transfer. Son birkaç mililitre aspirasyon orde 5 ml'lik bir pipet kullanınr tübüller herhangi carry-over önlemek için.
4. Toplanmış, tübül süpernatanları 20 ml RPMI,% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu (FBS) ile desteklenmiş 1640 ortamı ekleme ara kullanmadan oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g'de karıştırılır ve santrifüjlenir.
5. Süpernatantı dikkatlice süzün ve 16 mi ortamı, her biri beş T75 balonlarına on RPMI, 20 ml içinde% 10 ısı ile inaktive edilmiş FBS ile takviye 1640 ortamında yıkandı ve tohum 4 mL pelet PTCs tekrar süspansiyon. _CO2 atmosferinde (Şekil 4A),% 5 37 ° C'de inkübe edin.
6. Kültür ^3. gününde PTCs trypsinize ve onları 1 bölünmüş:% 10 ısı ile inaktive edilmiş FBS ile takviye 16 ml RPMI 1640 ortamı içeren T75 balonlarına 2 her biri (verim 10 şişeler tamamen) (Şekil 4B). _CO2 atmosferinde% 5, 37 ° C 'de inkübasyon devam edin.
7. Kültür ^5. gün tekrar PTCs trypsinize ve deneye bağlı olarak 6 oyuklu veya 24 oyuklu plakalar üzerine bunları plaka(Plaka başına bir T75 şişesi). Deneyler 6. günde gerçekleştirilebilir.

Sertoli hücrelerinin 5. İzolasyon (SC'ler)

1. 25 ml'lik bir pipet ile iyice PBS, 25 ml adım 4.3 yerleşmiş tübüller yeniden süspanse edin ve bunları 12 dakika için birim yerçekimi ile oturmasına izin verin. Pipetleme PBS tübüller ve yüzer uzaklaştırılması yeniden süspanse edilmesi için, aynı 25 mi pipet kullanın. 3 kez yıka (toplam 4 yıkama) tekrarlayın.
2. Son yıkama başka bir 100 ml sindirilmiş tübüller aktardıktan sonra Hyaluronidase-DNaz I çözüm içeren şişe-cap vida. 32 ° C (120 salınım / dakika) bir çalkalama su banyosu içinde sindirim gerçekleştirin.
3. Adım 4.2 anlatıldığı gibi 5 dakika sonra 100X büyütmede ışık mikroskobu inceleme ile tekrar tübüller kontrol edin.
   Not: Kısa tübüller, borulu agrega ve serbest hücreleri (Şekil 3D) görünür olmalıdır.
   1. boru şeklindeki agrega 10 dakika yerleşmek izin ve bizi süpernatant aspire25 ml'lik bir pipet ing. Yıkama 25 ml PBS ve her yıkama aşaması (Şekil 3E) 10 dakikalık bir sedimantasyon süresi kullanılarak 4 defa toplanır.
4. RPMI 1640 ortamı 20 ml ilave edilir ve 20 ml'lik bir şırınga üzerine monte edilmiş bir 18 G iğne ile süspansiyon 10 kez geçer. hava kabarcıkları kaçının.
   Not: ve iğne tek geçişte olarak kabul edilir aracılığıyla süspansiyon çekerek. hidrodinamik kesme hücrelerin bozulması ve homojenleştirme topaklaşma eğilimi hücrelerin hazırlanması için standart bir yöntemdir. Küçük bir iç çapa sahip olan bir hipodermik iğne ile hücrelerin geçici ^25. Şekil 5C ve D'nin kültürün gün 4 saflaştınldı Sertoli hücreleri normal ultrastrüktürel gösteren fonksiyonel özellikleri üzerinde bir etkisi olması beklenmemektedir.
   1. Pipetleyin AGG eğer 10X büyütmede rutin hücre kültürü için bir ters ışık mikroskobu altında tübülleri kontrol hızla bir bardak slayt ve süspansiyon bir damlaRegates Tüm (Şekil 3F) dağıtılır. Filtrattaki saf tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için bir 70 mikron hücre süzgecinden hücre süspansiyonu filtre.
5. ara kullanmadan oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 200 x g'de adım 5.4 süzüntü santrifüjleyin. Dikkatle 40 Sertoli hücreleri 25 ml'lik bir pipet kullanılarak süpernatan aspire ve tekrar süspansiyon mi RPMI 1640 ortamı (serumsuz).
6. Tripan mavi rengin 100 ul ile 100 ul hücre süspansiyonu karıştırın ve bir Neubauer Geliştirilmiş bölmesi ile hücre sayımı. Sayma sonucuna göre 3 ^x 10 6 hücre / ml hücre yoğunluğu ayarlayın. Tohum 6-çukurlu bir tablaya (= Gün 1) üzerinde oyuk başına 1 mi. Bir Oil Red O boyama (adım 6) planlanıyorsa birine bir kapak kayma koymak ya da Sertoli hücreleri ekim önce birkaç kuyu.
   Not: tüp kısaca bir hücre kısım pipet ile çekilmeden önce her zaman sarsılmış gerektiğini, böylece süspansiyon içinde Sertoli hücreleri hızlı bir şekilde çözmek. 4. günde onlar sıkıca att kadaralt tabakası, ACH.
7. 4. günde, yüzen veya yapışmış germ hücreleri çıkarmak için (Şekil 4C) izole sertoli hücreleri PBS (Şekil 4D) (aşama 5.6) kaplama için kullanılan 6 oyuklu plakaların her bir yıkama. , Orta aspire her iyi PBS 1-2 ml ekleyin ve şiddetle bir tablo ama PBS dökmeden yatay 6-kuyucuğu sallayın. Yıkandıkları 3 kez tekrarlayın ve günde 5 ve 6 (Şekil 4E) aynı yıkama işlemi gerçekleştirin.
   Gün 4 Sertoli hücreleri sıkıca bağlı olan Açık ve ters ışık mikroskobu (Şekil 4C) altında desen gibi bir arnavut gösterir Not:. Deneyler 7. günden itibaren gerçekleştirilebilir.
   1. Yapışkan germ hücreleri 6-yuvalı plakalar üzerinde tohumlama 3 gün sonra, bir hipotonik şoku yerine yüzen ve çıkarılması için (adım 5.7 için alternatif). orta kaldırmak ve buzdolabı üzerinden doğrudan alınan 20 mM Tris pH 7.5 1 ml ekleyin. 90 sn 120 değil sonra Tris tamponu aspireDaha sonra. PBS ile iki kez hücreleri yıkanır ve RPMI 1640 ortamı (serumsuz) 2 ilave edin. İsteğe bağlı olarak, bir sonraki gün deneyleri.
      Not: Hipotonik şok daha uzun süre daha germ hücreleri kaldırılabilir ancak daha Sertoli hücreleri de kaybolur. İlk PBS yıkama herhangi Sertoli hücreleri yerinden etmemek için hızlı ama dikkatli yapılmalıdır. Doğrudan farklı boyutlarda hipotonik muameleye sayıda vakuollerin faz kontrast mikroskopisi ile sitoplazma içerisinde gözlenebilir sonra. Vakuoller hipotonik tedavi sonrası birkaç saat içinde kaybolur.

6. Yağ Kırmızı O boyamasıyla

1. Oda sıcaklığında tüm adımları uygulayın. gününde 7 yıkama Sertoli hücreleri PBS ile iki kez bir kapak kayma (adım 5.6) yetiştirilen ve PBS içinde% 10 formalin ile bunları düzeltmek. 10 dakika sonra taze solüsyon ile formalin yerine, başka bir 60 dakika tespiti devam ediyor.
   Not: Bütün çözeltiler, bir kayar kapak ile birlikte (S) içerisine ilave edildi ve bir sonraki aşamada daha önce aspire edilir.
2. Aspire formalin, su ile hücreler iki kez yıkama ve% 60 izopropanol ilave edin. 5 dakika sonra, bir kaç dakika için havayla kurumaya hücreleri sağlar.
3. oyuk başına 1 mi, Yağ Kırmızı O boya solüsyonu eklenir ve 10 dakika süre ile inkübe edilir. çözelti aspire ve su ile hücreler hemen 4 kez yıkayın ve montaj kapağı gliserol PBS fişleri (9: 1). Rutin ışık mikroskobu (Şekil 4F) ile parlak bir alan görüntüleri çekmek.

7. İmmünofloresan Boyama

1. ya da iki kez PBS ile bir kapak slip üzerinde büyümüş (aşama 5.5) sertoli hücreleri (adım 4.5 arasında) PTCs yıkayın ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca% 4 PFA sabitleyin.
2. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca PBS içerisinde% 5 BSA ile inkübe edin. BSA-PBS çözüm atın ve taze BSA-PBS (PTCs için) aktin (düz kas) içeren çözelti veya vimentin (Sertoli hücreleri) primer antikor (seyreltme 1: 100, her iki antikor için) ekleyin ve 4 ° CO / N inkübe.
   Not: Primer antikorun spesifik olmayan bağlanma BSA blokları ile inkube edildi.
3. Yıkama kapağı PBS% 0.1 Tween 20 içinde 5 dakika için 3 kez kayar ve yeşil flüoresan boya konjuge keçi anti-fare ikincil antikoru (seyreltme 1: 1.000) ile birlikte inkübe karanlıkta, 1 saat boyunca oda sıcaklığında karıştırıldı.
4. Yıkama kapağı PBS% 0.1 Tween 20 içinde 5 dakika için 3 kez kayar ve DAPI montaj ortamı içine monte edilir.

8. ultrastrüktürel Analizi

1. PBS ile 6 cm hücre kültürü plakasının üzerinde büyümüş (aşama 5.6) yıkama sertoli hücreleri ve (67 mM kakodilat tampon maddesi içinde% 2.5 glutaraldehit,% 2.5 paraformaldehid ve% 0.05 pikrik asit karışımı içinde, 4 ° C'de 2 saat boyunca, onları gidermek Ito ve Karnovsky ²⁶ uygun pH 7.4).
2. 50 mM maleat tamponu (pH 5) içinde çözülmüş% 0.3 uranil asetat içinde bir O / N inkübasyon takip% 1 ozmiyum tetroksit sonrası tespit gerçekleştirin. Standart prosedürlere göre ortamı gömme yerleştirme örnekleri. Ince bölümleri kesmek kurşun sitrat ile kontrast ve elektron mikroskobu ile incelenmesi.

Sonuçlar

Açıklanan prosedür 10 sıçan testis yaklaşık 12 x 10 ⁷ Sertoli hücrelerinin izolasyonu sağlar. Altı-yedi 6 oyuklu plakalar 7. günde deneyler için uygun olduğu tripsin-DNase I sindirim Sertoli hücre izolasyonu sırasında çok önemli bir adım olan, böylece, 3 x ¹⁰ 6 hücre 6 oyuklu bir plaka üzerinde oyuk başına yerleştirilir. Bu noktada sindirim çok ilerleyen ise germ hücrelerinin oranı / Sertoli hücreleri orantısız sonuna kadar artacaktır...

Tartışmalar

The seminiferous tubules are bounded by a circular layer of peritubular cells and a basal lamina on the luminal side. Sertoli cells are resting on the basal lamina, establish the blood testis barrier through formation of occluding junctions between adjacent cells and provide the structural framework for the organisation of the seminiferous epithelium. Sertoli cells and adjacent spermatogenic cells maintain intimate contacts throughout germ cell development providing physical contact and communication alike. Therefore, wh...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Actin (smooth muscle) antibody clone 1A4	Dako	M0851	Monoclonal mouse anti human antibody. Use 1:100 dilution for immunofluorescence.
Albumin bovine fraction V Standard grade, lyophilized	Serva	11930.04	Filter (0.45 µm) BSA solutions used for immunofluorescence.
Corning Cell Strainers 70 µm	Corning	431751	White color
Collagenase A from Clostridium histolyticum	Roche	10103586001
DAPI mountant ProLong Gold Antifade	Life technologies	P-36931
D-glucose	Sigma	G8644	100 g/L
Dulbecco´s PBS without Ca2+/Mg2+	Gibco	14190-094
DNase I	Roche	10104159001
Electron microscope	Zeiss	EM 109S
Fluorescence microscope	Zeiss	Axioplan 2
Hyaluronidase from bovine testis	Sigma	H3506
Inverted light microscope	Olympus	CKX41	Routine cell culture microscope
Mouse IgG / IgM (H+L) polyclonal secondary Antibody	Life technologies	A-10684	Alexa Fluor 488 conjugate
Oil Red O	Sigma	O0625	Has replaced Sudan III and Sudan IV because of brighter color.
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
Penicillin (5,000 U/ml)/ Streptomycin (5,000 µg/ml)	Gibco	15070-063	100x solution
RPMI-1640	Gibco	21875-034	Contains 300 mg/L L-glutamine
Trypsin from porcine pancreas	Sigma	T5266
Trypan Blue Stain (0.4%)	Gibco	15250-061
Trypsin inhibitor from soybean	Sigma	T6522	The Sigma product is considerably cheaper than the previously used BPTI (Aprotinin) from Roche.
Vimentin antibody (V9)	Sigma	V6630	Monoclonal mouse anti pig vimentin antibody.  Use 1:100 dilution for immunofluorescence.
Wistar WU rats	Charles River		Should be 19 days old on day of experiment.