Isolierung von Sertoli-Zellen und peritubulären Zellen aus Ratte Hoden

Zusammenfassung

Primäre Sertoli-Zellen sind für das Studium Hoden-Immun-Privileg, Signaltransduktion während der Entzündung oder Infektion und Nutzung ihrer immun Eigenschaften erforderlich. Hier beschreiben wir ein Enzym-basiertes Protokoll für die Isolierung von hoch gereinigten primären Sertoli-Zellen und peritubulären Zellen aus Rattenhoden.

Zusammenfassung

Der Hoden, insbesondere der männlichen Gameten, fordert das Immunsystem in einer einzigartigen Art und Weise, weil differenziert Spermien zuerst zum Zeitpunkt der Pubertät erscheinen - mehr als zehn Jahre nach der Gründung der systemischen Immuntoleranz. Spermatogenen Zellen exprimieren eine Reihe von Proteinen, die vom Immunsystem als nicht-selbst gesehen werden. Der Hoden muss dann in der Lage sein, Toleranz auf der einen Seite auf diese Neo-Antigene herzustellen, aber immer noch selbst zu schützen können vor Infektionen und Tumorentwicklung auf der anderen Seite. Daher ist die Hoden eines der wenigen Immun privilegierten Stellen im Körper, die ohne evozieren eine schädliche entzündliche Immunantwort fremde Antigene tolerieren. Sertoli-Zellen spielen eine Schlüsselrolle für die Pflege dieser Immun privilegierten Umgebung der Hoden und auch das Überleben von cotransplanted Zellen in einer fremden Umgebung zu verlängern. Daher Primär sind Sertoli-Zellen ein wichtiges Instrument für die Immunprivileg des Hodens studieren, die nicht E sein kannasily von etablierten Zelllinien oder andere zelluläre Modelle ersetzt. Hier präsentieren wir eine detaillierte und umfassende Protokoll zur Isolierung von Sertoli-Zellen - und peritubulären Zellen, falls gewünscht - von der Ratte Hoden innerhalb eines einzigen Tages.

Einleitung

Hoden produzieren männlichen Gameten und Sexualhormone, also Androgene. Die Orgel ist aus zwei Kammern besteht. In den Zwischenraum repräsentiert, dass etwa 10-12% der gesamten Hoden ^{Band 1,} Steroidbildung findet innerhalb der Leydigzellen. Die röhrenförmige Kammer entspricht etwa 60-80% des Hodenvolumen ^{1 und} enthält Keimzellen und zwei Typen von somatischen Zellen - peritubulären Zellen und Sertoli-Zellen. Der Hoden wird durch Bindegewebssepten in 250-300 Läppchen unterteilt, die jeweils mit 1-3 stark gewundene Hodenkanälchen. Diese Röhren werden durch eine Basalmembran, ein Blatt von Kollagen eingeschlossen und einer umlaufenden Schicht aus peritubulären Zellen (1A).

Keimepithels auf der luminalen Seite der Basalmembran liegt. Sertoli-Zellen sind groß länglichen Zellen, die die gesamte Keimepithels von der Basalmembran zum Lumen erstrecken. Sie sind stark attschmerzte zu der Basalmembran und eine kontinuierliche Zell Blatt durch basolaterale organisiert tight junctions bilden, die das Keimepithel aus dem Interstitium verschließt und stellt die Blut-Hoden-Schranke. Sertoli-Zellen haben prominente zytoplasmatische Projektionen und Konsequenzen, die es ihnen ermöglichen, mit einer artspezifischen aber konstante Anzahl von Keimzellen in enge morphologische und funktionelle Verbindung zu setzen. Diploiden Keim Stammzellen vermehren und differenzieren sich in Spermatogonien.

Während der Meiose I kurzlebig tetraploiden Spermatozyten erzeugt werden, die wiederum in vier haploiden Spermatiden während der Meiose II entwickeln. Alle Keimzellen werden durch zytoplasmatische Brücken miteinander verbunden, so dass sie ein zellulares Netz bilden. Das Hauptereignis während der Reifung der Spermatiden ist die Extrusion von großen Teilen des Cytoplasmas, Bildung Restkörper in einem Verfahren Spermiogenese bezeichnet. Restkörper durch Sertoli Zellen phagozytiert. Später Spermatiden werden dann veröffentlicht inTubuluslumen und in den Nebenhoden zur weiteren Reifung gebracht. Spermatogenese topographisch und funktionell erscheinen Sertoli-Zellen und Keimzellen gegenseitig koordinieren.

Erstellung von individuellen Hodenzelltypen begann vor fast einem Jahrhundert als kleine Hodenstücke kultiviert wurden und Zelltypen durch Mikroskopie ² identifiziert. Durch sorgfältige Präparation der Röhrchen nach der Tunica albuginea Öffnung mit feinen bestückten Zange war es später möglich Rohr und interstitielle ^{Fächer 3} zu trennen. 1975 eingeführt Welsh und Wiebe eine Kollagenasebehandlung, um die Tubuli von anhaftenden Zwischengewebe und Pankreatin Behandlung zur Entfernung des äußeren peritubulären Zellschicht ⁴ zu befreien. Schon früh junge, unreife Ratten (ca. 20 Tage alt) hatte, in denen verwendet umfassen die Sertoli-Zellen einen großen Teil des rohrförmigen Zellpopulation weil Spermatogenese noch nicht begonnen hat. In diesem Alter Ratte SertOli Zellen aufhören zu unterteilen, und tight junctions zwischen benachbarten Zellen bilden, so daß die Blut-Hoden-Schranke ⁵ hergestellt ist.

Unabhängig von Welsh und Wiebe Dorrington et al. Führte eine Kombination von Trypsin und Desoxyribonuklase durch soybeen Trypsin-Inhibitor und Collagenase-Behandlung anschließen, die im selben Jahr ⁶ veröffentlicht wurde. Beide Gruppen auch mechanische Kraft (Zeichnung der verdauten Rohrbruchstücke immer wieder durch eine Spritzennadel oder einer Pasteur-Pipette jeweils), um eine homogene Zellsuspension für die Beschichtung zu erzeugen, enthält etwa 70% Sertoli-Zellen verwendet. Nach 3 Tagen in Kultur unter Verwendung eines Mediums, das serumfrei ist, erhöht sich der Anteil der Sertoli-Zellen auf etwa 90%. Dies könnte zum größten Teil auf den Tod zugeschrieben Keimzellen kontaminieren. Rest peritubulären Zellen (PTC), jedoch bleiben fest über ihre extrazelluläre Matrix gebunden. PTCs, aber nicht Sertoli-Zellen, sind dafür bekannt, zu produzierenFibronektin, die als Markerprotein für die Schätzung Kontamination mit PTCs dienen kann. Daher Tung et al. begründete, dass eine zusätzliche Hyaluronidase Behandlung kann die Reinheit des ^7-Fraktion Sertoli Zelle verbessern. Tatsächlich könnten sie zeigen, dass eine zusätzliche Behandlung zur Verringerung der Kontaminierung konnte durch PTCs etwa 20-fach, was besonders deutlich wird, wenn ein Vergleich in serumhaltigem Medium zur Kultivierung gereinigt Sertoli-Zellen verwendet wird. Von da an dem verbesserten Verfahren von Tung et al. wurde die vorherrschende Protokoll und wurde von anderen Hauptgruppen im Bereich ⁸ (1B) intensiv genutzt.

Während Kollagenasebehandlung die Mehrheit der PTCs freigegeben und kann parallel zu Sertoli-Zellen isoliert werden. Während energisch die PTCs vermehren und reagieren nicht auf Follikel-stimulierendes Hormon (FSH), Sertoli-Zellen durchlaufen nicht Mitose mehr und von charakteristischen morphologischen Veränderungen zu reagieren FSHund eine Zunahme in zyklischem Adenosinmonophosphat (cAMP) -Konzentration ^9. Sehr ähnlich enzymatische Verdauung Protokolle können zur Isolierung von primären Sertoli-Zellen von anderen Tieren wie Menschen ^10, Maus ^11,12, Sibirische Hamster ^{13 oder} Yak ¹⁴ verwendet werden. Für die Entfernung von großen Mengen an Keimzellen einen hypotonischen Schock verunreinigen können am Ende des Isolierungsprozedur ¹⁵ verwendet werden. Dies ermöglicht auch die effiziente Isolierung von Sertoli-Zellen aus erwachsenen Ratte ¹⁶ Hoden. Ein angereichert Sertoli Zellsuspension kann auch mit Stechapfel Agglutinin ¹⁷ beschichtet durch Plattierung der Suspension auf Lektin Gerichte aus Keimzellen getrennt werden. Nur Sertoli-Zellen und ein paar Rest PTCs sich an die Lektin-Platten.

Primäre Sertoli-Zellkulturen, vor allem aus der Ratte, wurden ursprünglich für die Untersuchung von Reaktionsfähigkeit auf Hormone oder Festlegung Zelllinien wie die Maus Sertoli Zellen Li verwendetne TM4 ^18. Diese Zelllinie wurde in mehr als hundert Studien bis heute untersucht. In einem translationalen Ansatz haben Sertoli-Zellen wurden für Immunschutz von Co-kultivierten Zellen und Geweben, wie in der co-Transplantation von allogenen oder xeno- Pankreasinseln für langfristige Überleben des Transplantats ohne systemische Immunsuppression ¹⁹ verwendet. Und somatische Keimzelle (Sertoli cells - Keimzellen) -Wechselwirkungen ^{20, 21} - isoliert Sertoli-Zellen wurden auch in Co-Kultur-Experimente zur Untersuchung der epithelial-mesenchymalen (PTCC Sertoli-Zellen) verwendet. Kürzlich primären Sertoli-Zellen wurden zur Untersuchung der Expression von Toll-like-Rezeptoren und die Sekretion von proinflammatorischen Zytokinen wie auch die Signalketten, die zu Cytokin-Expression nach Infektion mit nicht-pathogenen und uropathogene E. beschäftigt coli ^22. Andere neuere Untersuchungen wurden mit Sertoli-Zellen für Hodenimmun p Studiumrivilege ²³ und gezeigt, dass Testosteron-Vorbehandlung unterdrückt die LPS-induzierte Entzündungsreaktion ^24.

Protokoll

1. Tierethikerklärung

Hier beschriebenen Experimente wurden für die Pflege und Verwendung von Tieren zu Versuchszwecken nach den Richtlinien des Regierungspräsidiums Gießen, Deutschland, als die Kommune und bestätigen, um den deutschen Code of Practice durchgeführt (Berechtigungs Nr.: GI 20/23 Nr A 31 / 2012).

2. Herstellung von Medien, Enzymlösungen und Tiere

1. Bereiten 1% Jod Alkohol durch Auflösen von 1 g Jod in 100 ml Ethanol.
2. Bereiten 2x 500 ml Dulbecco's phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) ohne Ca ^{2+ und Mg 2+} ergänzt jeweils mit 7,5 ml D-Glucose (100 g / l) und 5 ml 100x Penicillin / Streptomycin-Stammlösung (15 mg / ml D -Glucose, 50 U / ml Penicillin und 50 ug / ml Streptomycin final).
3. Supplement 1x 500 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-Medium mit 5 ml 100x Penicillin / Streptomycin-Stammlösung (50 U / ml Penicillin und 50 ug / ml Streptomycin final).
4. Vorbereiten eines Trypsin-DNase I-Lösung (2,5 mg / ml Trypsin und 10 ug / ml DNase I) durch Zugabe von 25 mg Trypsin und 0,1 ml DNase I (1 mg / ml DNase I) auf 9,9 ml PBS.
5. Man löst 50 mg Trypsin-Inhibitor in 5 ml PBS für Trypsin Inhibitor eine Lösung (10 mg / ml). Man löst 25 mg Trypsin-Inhibitor in 10 ml PBS für Trypsin Inhibitor B-Lösung (2,5 mg / ml).
6. Für eine Collagenase-Hyaluronidase-Deoxyribonuclease I (DNase I) Lösung 10 mg Collagenase A (1 mg / ml final) aufzulösen, 10 mg Hyaluronidase (1 mg / ml final) und 0,1 ml DNase I (1 mg / ml DNase I) ( 10 ug / ml final) in 10 ml PBS.
7. Vorbereiten eines Hyaluronidase-DNase I-Lösung durch Zugabe von 10 mg Hyaluronidase (1 mg / ml final) und 0,1 ml DNase I-Lösung (1 mg / ml) (10 & mgr; g / ml final) auf 9,9 ml PBS.
8. Bestellen Wistar-Ratten auf Zeit, so dass sie 19 Tage alt am Tag der Sertoli Zellisolierung sind.
   Hinweis: Das beschriebene Protokoll für 10 Ratten entwickelt, kann aber für mindestens 5 und maximal 20 Ratten modifiziert werden.Die Volumina aller Lösungen müssen entsprechend angepasst werden.
9. Bereiten Oil Red O-Stammlösung 0,35 g Oil Red O in 100 ml Isopropanol durch Auflösen. Stir O / N, filtriert durch 0,2 um und lagern bei RT für bis zu einem Jahr.
10. Bereiten Oil Red O Färbung Lösung durch Mischen von 6 ml Oil Red O-Stammlösung mit 4 ml Wasser (3: 2). Nach 10-20 min Filter durch 0,2 & mgr; m. Verwenden Sie innerhalb der nächsten 2 Stunden.
11. Vorbereiten eines 4% (w / v) Formaldehyd-Lösung in einem belüfteten Haube durch Zugabe von 4 g Paraformaldehyd-Pulver (PFA) zu 80 ml 1x PBS unter leichtem Rühren. Wärme auf ~ 60 ° C, 1 ml 1 M NaOH und weiter gerührt, bis der Paraformaldehyd gelöst ist. den pH-Wert auf 7,4 mit 1 M HCl und das Volumen auf 100 ml mit 1 x PBS lassen die Lösung abgekühlt auf RT, einzustellen. Die Lösung wird filtriert (0,45 & mgr; m) und verwenden frisch oder lagern bei -20 ° C für mehrere Monate.
    Hinweis: polymerisiertem Formaldehyd (PFA) depolymerisiert zu monomeren Formaldehyd in Wasser. Dieser Prozess istkatalysiert durch moderate Erwärmung und einem leicht alkalischen pH-Wert. Bereiten Sie alle Enzymlösungen frisch und Filter sterilisieren (0,2 uM) sie am Tag der Nutzung. Wenn eines anderen Herstellers für ein Enzym (Materials sehen / Ausrüstung Tabelle) verwendet wird, sorgfältig seine Konzentration / Aktivität einzustellen.
    In dem folgenden Protokoll ein "Pipette" steht für eine serologische Pipette.

3. Herstellung von Hodenkanälchen

1. Anesthetize 10 männliche Wistar Ratten einzeln in einem Exsikkator mit CO _{2 und} einer Fließgeschwindigkeit, die mindestens 20% des Kammervolumens pro Minute versetzt. Warten Sie, bis Atemstillstand Test Anästhesie durch einen Fuß-Pad quetschen, und wenn es keine Reaktion, jede Ratte durch Genickbruch einschläfern. Lassen Sie das Blut durch Halsschlagader Schneiden und Halsschlagader (Vagina carotica) unter fließendem Wasser. Desinfizieren Sie den Bauch nach mit 70% Ethanol abwischen.
2. Mit einer Pinzette heben Sie die Haut von der Bauch muszeuge und geschnitten, um eine ovale Hautlappen aus, die von der Symphyse bis zum Brustbein (2A) und die Klappe nach oben auf die Brust erweitert. Als nächstes die Bauchmuskeln zu packen und eine mediale Inzision von der Symphyse bis zum Brustbein machen.
   1. Drücken Sie den Bauch mit den Daumen von Becken nach oben, um die Hoden aus dem unteren Becken zu schieben. Suchen Sie sich die Nebenhodenfettpolster (2B) mit einer Pinzette zum Herausziehen der Hoden weiter nach oben. Schneiden Sie den Samenstrang (2B), die Tunica albuginea intakt bleibt, und sammeln Sie alle Hoden in 20 ml PBS in einem 50 ml konischen Röhrchen (2C).
3. Nachdem alle Hoden sammeln, desinfizieren sie durch ein gleiches Volumen (20 ml) von 1% Zugabe (w / v) Jod in Ethanol. Kehren Sie die Röhrchen zweimal und dekantieren sofort den Überstand. Schnell die Hoden waschen zweimal mit 25 ml PBS jeder (2D).
4. Übertragen Sie die Hoden in eine Petrischale enthaltening 15 ml PBS (2E). Fassen Sie jeden Hoden fest mit einer Zange an einem Ende einen kleinen Schnitt in der Tunica albuginea am entgegengesetzten Ende zu machen, und drücken Sie die Röhrchen mit geschlossenen Scherenblätter als Schaber.
   Anmerkung: Die Röhrchen noch eine kompakte Hoden förmigen Bündel mit nur wenigen Tubuli sich in die Lösung, um sein sollten homogene enzymatische Verdauung (2F) zu ermöglichen.
5. Übertragen Sie die de-verkapselte Hoden auf eine 100 ml Flasche mit Schraubverschluss mit 10 ml Trypsin-DNase I-Lösung. Führen Sie die Verdauung in einem geschüttelten Wasserbad bei 32 ° C (120 Schwingungen / min). Nach 4 bewerten min die Tubuli mit dem bloßen Auge für Dispersion von Tubuli. Sobald Tubuli in die Lösung zu dispergieren beginnen, sofort die Verdauung zu stoppen. Falls erforderlich, weiterhin Inkubation für 2 min.
6. Stopp Trypsinverdaus durch Zugabe von 5 ml Trypsininhibitorlösung A. Sie die Lösung gut mischen durch Auf-und Abpipettieren 3-4 Mals eine 10 ml Pipette und es zu einem 50 ml konischen Röhrchen übertragen.
7. Nach 5 Minuten Inkubation beobachten die Röhrchen durch die Einheit der Schwerkraft absetzen, den Überstand vorsichtig entfernen, indem das 10 ml-Pipette aus Schritt 3.6 verwendet und 10 ml B-Lösung Trypsin-Hemmstoff, um Trypsinverdaus vollständig stoppen hinzuzufügen. Resuspendieren der Tubuli durch Auf- und Abpipettieren 2-3 mal.
8. Um waschen jeweils die Tubuli 9 mal mit 25 ml PBS interstitiellen Zellen zu entfernen, zu kontaminieren. Resuspendieren Kanälchen in jedem Waschen durch eine 25 ml Pipette und lassen sie für 10 Minuten mit dem Gerät Schwerkraft absetzen. Verwenden Sie immer die gleichen 25 ml Pipette zum Pipettieren PBS, Aufwirbelung und Entfernung des Überstandes.

4. Ausbau / Isolierung von peritubulären Cells (PTC)

1. Übertragen Sie alle Röhrchen in einen 100 ml Flasche mit Schraubverschluss und fügen Sie den Collagenase-Hyaluronidase-DNase I-Lösung (3A). Führen Verdauung für 10 Minuten in einem Schüttelwasserbad bei 32 ° C (120 Schwingungen / min).
2. Pipette ein Tropfen der Suspension auf einen Glasobjektträger und schnell die Tubuli unter einem inversen Lichtmikroskop für Routine-Zellkultur bei 100-facher Vergrößerung prüfen. Wenn die Verdauung für weitere 2 min nicht fortgeschritten genug, um weiterhin Inkubation (nicht die Zeit für die mikroskopische Kontrolle benötigt zählen).
   Hinweis: Bei diesem Schritt werden alle Tubuli verkürzen sich in Länge und Röhrchens Kanten sollten rau werden (3B und C). Ecken und Kanten sind für die Freisetzung von peritubulären Zellen indikativ.
3. Übertragen Sie die Suspension mit verdaut Tubuli zu einem 50 ml konischen Röhrchen, die 25 ml Pipette aus Schritt 3.8 verwenden. Waschen Sie die 100-ml-Flasche mit 10 ml PBS und fügen Sie ihn in der konischen Röhre zu den Tubuli. Lassen Sie die verdaut Tubuli durch Einheit Schwerkraft für 10 Minuten absetzen, und saugen Sie den Überstand vorsichtig, die PTCs enthält, mit dem 25-ml-Pipette wieder, und überträgt es auf eine neue konische Röhrchen. Zum Absaugen der letzten Milliliter mit einem 5-ml-Pipette in order jede Übertragung von Tubuli zu verhindern.
4. 20 ml RPMI 1640-Medium, ergänzt mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS) zu den gesammelten Überständen Röhrchen, mischen und Zentrifugieren bei 300 xg für 10 min bei RT ohne die Unterbrechung mit.
5. Überstand vorsichtig dekantieren und die pelletierten PTCs in 20 ml RPMI 1640-Medium mit 10% hitzeinaktiviertem FBS und Samen 4 ml jeweils auf fünf T75-Kolben, die 16 ml Medium jedes ergänzt resuspendieren. Inkubieren bei 37 ° C in 5% CO _{2 -Atmosphäre} (4A).
6. ^{Am 3.} Tag der Kultur trypsinize die PTCs und teilen Sie sie 1: 2 am T75-Kolben mit 16 ml RPMI 1640-Medium mit 10% hitzeinaktiviertem FBS jeweils (Ausbeute 10 Flaschen insgesamt) (4B). Weiter Inkubation bei 37 ° C in 5% CO _{2 -Atmosphäre.}
7. ^{Am 5.} Tag der Kultur trypsinize die PTCs wieder und platten sie auf 6-Loch-oder 24-Well-Platten je nach Experiment(Eine T75-Flasche pro Platte). Experimente können am Tag 6 durchgeführt werden.

5. Isolierung von Sertoli-Zellen (SCs)

1. Resuspendieren der siedelt Tubuli aus Schritt 4.3 gründlich in 25 ml PBS durch eine 25 ml Pipette und lassen sie für 12 min mit dem Gerät Schwerkraft absetzen. Verwenden Sie die gleiche 25 ml Pipette zum Pipettieren PBS, Aufwirbelung von Tubuli und das Entfernen von Überständen. Wiederholen Sie die Wäsche 3-mal (4 wäscht insgesamt).
2. Nach dem letzten Wasch die verdaut Tubuli zu weiteren 100 ml Flasche mit Schraubverschluss, die das Hyaluronidase-DNase I-Lösung übertragen. Führen Sie die Verdauung in einem geschüttelten Wasserbad bei 32 ° C (120 Schwingungen / min).
3. Nach 5 Minuten noch einmal überprüfen die Tubuli durch lichtmikroskopische Prüfung bei 100-facher Vergrößerung in Schritt 4.2 beschrieben.
   Hinweis: Kurze Röhren, röhrenförmige Aggregate und freigesetzten Zellen sichtbar sein soll (3D).
   1. Lassen Sie die Rohr Aggregate für 10 Minuten absetzen, und den Überstand aspirieren unsing eine 25 ml Pipette. Waschaggregate 4 mal 25 ml PBS und einer Sedimentationszeit von 10 min für jeden Waschschritt (3E).
4. In 20 ml RPMI 1640-Medium, und übergeben Sie die Suspension 10-mal durch eine 18 G-Nadel an einer Spritze 20 ml montiert. Vermeiden Sie Luftblasen.
   Hinweis: Ziehen der Suspension in und durch die Nadel als einem Durchgang betrachtet wird. Die Unterbrechung und Homogenisierung von Zellen durch hydrodynamische Scher ist eine Standardtechnik bei der Herstellung von Zellen, die zur Aggregation neigen. Die Weitergabe von Zellen durch eine Injektionsnadel von kleinen Innendurchmesser ist unwahrscheinlich, einen Einfluss auf ihre funktionellen Eigenschaften zu ^{haben 25.} 5C und D die normale Ultrastruktur von gereinigtem Sertoli-Zellen an Tag 4 der Kultur zeigt.
   1. Pipette ein Tropfen der Suspension auf einen Glasobjektträger und lassen schnell die Tubuli unter einem umgekehrten Lichtmikroskop für Routine-Zellkultur bei 10-facher Vergrößerung, wenn die aggRegates sind alle (3F) dispergiert. Filtern der Zellsuspension durch ein 70 & mgr; m Zellsieb, um eine reine Einzelzellsuspension in dem Filtrat zu erhalten.
5. Zentrifuge das Filtrat aus Schritt 5.4 bei 200 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur ohne die Pause verwenden. Überstand vorsichtig absaugen, eine 25 ml-Pipette und die Sertoli-Zellen in 40 ml RPMI 1640-Medium (Serum-freien) resuspendieren.
6. Mischen Sie 100 ul Zellsuspension mit 100 ul Trypanblau Stain und zählen Zellen mit einer Neubauer Improved Kammer. Stellen Sie die Zellkonzentration auf 3 x ^{10 6 Zellen} / ml nach dem Zählergebnis. Seed 1 ml pro Vertiefung auf einer Platte mit 6 Vertiefungen (= 1 Tag). Wenn ein Oil Red-O-Färbung (Schritt 6) ist geplant, legte ein Deckglas in einem oder wenigen Brunnen vor Sertoli-Zellen Aussaat.
   Anmerkung: Sertoli Zellen in Suspension absetzen schnell, so daß das Rohr kurz jedes Mal, bevor ein Aliquot Zell geschüttelt werden mit der Pipette entnommen. Bis Tag 4 sie fest attACH dem Substrat.
7. Um schwimmenden oder haftenden Keimzellen an Tag 4 (4C) waschen jede Vertiefung der 6-Well-Platten für die Beschichtung isoliert Sertoli-Zellen (Schritt 5.6) mit PBS (4D) verwendet zu entfernen. Saugen Sie das Medium, fügen Sie 1-2 ml PBS in jede Vertiefung und schütteln Sie die 6-Well-Platten horizontal auf einem Tisch kräftig, aber ohne PBS verschütten. Wiederholen Sie die 3 x waschen und führen die gleiche Waschverfahren am Tag 5 und 6 (4E).
   Hinweis: Am Tag 4 Sertoli-Zellen fest angebracht sind und zeigen eine Kopfsteinpflaster wie Muster unter dem umgekehrten Lichtmikroskop (4C). Experimente können von Tag 7 weiter durchgeführt werden.
   1. (Alternative für Schritt 5.7) Für die Entfernung von schwimmenden und haftende Keimzellen führen eine hypotonischen Schock 3 Tage nach der auf 6-Well-Platten Aussaat. Entfernen Sie das Medium und 1 ml 20 mM Tris pH 7,5 direkt aus dem Kühlschrank genommen. Absaugen Tris-Puffer nach 90 bis 120 sec, jedoch nichtspäter. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS und 2 ml RPMI 1640-Medium (Serum-frei). Optional führen am nächsten Tag Experimente.
      Hinweis: Je länger die Dauer des hypotonischen Schock ist die weitere Keimzellen aber je mehr Sertoli-Zellen entfernt werden kann und verloren gehen. Der erste PBS waschen sollte schnell, aber mit Sorgfalt erfolgen, um keine Sertoli-Zellen zu verdrängen. Direkt nach dem hypotonischer Behandlung zahlreicher Vakuolen unterschiedlicher Größe im Cytoplasma durch Phasenkontrastmikroskopie beobachtet werden. Vakuolen verschwinden innerhalb von ein paar Stunden nach der hypotonischer Behandlung.

6. Oil Red O Färbung

1. Führen Sie alle Schritte bei Raumtemperatur. Am Tag 7 Wasch Sertoli-Zellen auf einem Deckglas (Schritt 5.6) mit PBS zweimal und fixieren Sie diese mit 10% Formalin in PBS gewachsen. Nach 10 Minuten Formalin mit frischer Lösung ersetzen und weiterhin Fixierung für weitere 60 min.
   Anmerkung: Alle Lösungen werden hinzugefügt, um die (S) mit einem Deckglas und vor dem nächsten Schritt abgesaugt.
2. Saugen Formalin, waschen Sie die Zellen zweimal mit Wasser und 60% Isopropanol hinzu. Nach 5 min erlauben Zellen an der Luft trocknen für ein paar Minuten.
3. 1 ml Oil Red O Färbung Lösung pro Vertiefung und Inkubation für 10 min. Saugen Sie die Lösung, und waschen Sie die Zellen sofort 4-mal mit Wasser und montieren Deckgläser in Glycerin-PBS (9: 1). Nehmen Sie Hellfeld-Bilder mit einer Routine Lichtmikroskop (4F).

7. Immunfluoreszenzfärbung

1. Waschen Sie PTCs (aus Schritt 4.5) oder Sertoli-Zellen (aus Schritt 5.5) auf einem Deckgläschen gewachsen zweimal mit PBS und fixieren Sie diese mit 4% PFA für 10 min bei RT.
2. Inkubieren mit 5% BSA in PBS für 1 h bei RT. Entsorgen Sie die BSA-PBS-Lösung und fügen frische BSA-PBS-Lösung Aktin (glatte Muskulatur) enthält (PTC) oder Vimentin (für Sertoli-Zellen) primärer Antikörper (Verdünnung 1: 100 für beide Antikörper) und Inkubation bei 4 ° CO / N.
   Anmerkung: Die Inkubation mit BSA blockiert unspezifischen Bindung des primären Antikörpers.
3. Wash Deckgläser 3-mal für 5 min in PBS-0,1% Tween 20 und Inkubation mit grün-fluoreszierenden Farbstoff konjugiertem Ziege anti-Maus Sekundär-Antikörper (Verdünnung 1: 1000) bei RT für 1 h in der Dunkelheit.
4. Wash Deckgläschen 3 mal 5 min in PBS-0,1% Tween 20 und montieren sie in DAPI Eindeckmediums.

8. Ultrastrukturelle Analyse

1. Wash Sertoli-Zellen (aus Stufe 5.6) mit PBS auf eine 6 cm Zellkulturplatte gezüchtet und in einer Mischung aus 2,5% Glutaraldehyd, 2,5% Paraformaldehyd und 0,05% Pikrinsäure in 67 mM Cacodylat-Puffer bei 4 ° C für 2 h FIX ( pH 7,4) nach Ito und Karnovsky ^26.
2. Führen Postfixierung in 1% Osmiumtetroxid, gefolgt von einer O / N Inkubation in 0,3% Uranylacetat in 50 mM gelöst Maleat-Puffer (pH 5). Einbetten Proben Medien nach Standardverfahren in einzubetten. Schneiden Sie dünne Schnitte, kontrastieren sie mit Bleizitrat und untersuchen mit einem Elektronenmikroskop.

Ergebnisse

Das beschriebene Verfahren ermöglicht die Isolierung von ca. 12 x 10 ⁷ Sertoli-Zellen aus 10 Ratte Hoden. SO 3 x ^{10 6 Zellen} pro Vertiefung auf einer Platte mit 6 Vertiefungen plattiert, dass sechs bis sieben Platten mit 6 Vertiefungen für Experimente zur Verfügung stehen 7. Die Trypsin-DNase I-Verdau der wichtigste Schritt bei der Sertoli Zellisolierung ist. Wenn Verdauung an dieser Stelle zu weit voran, erhöht sich das Verhältnis von Keimzellen / Sertoli Zell...

Diskussion

The seminiferous tubules are bounded by a circular layer of peritubular cells and a basal lamina on the luminal side. Sertoli cells are resting on the basal lamina, establish the blood testis barrier through formation of occluding junctions between adjacent cells and provide the structural framework for the organisation of the seminiferous epithelium. Sertoli cells and adjacent spermatogenic cells maintain intimate contacts throughout germ cell development providing physical contact and communication alike. Therefore, wh...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Actin (smooth muscle) antibody clone 1A4	Dako	M0851	Monoclonal mouse anti human antibody. Use 1:100 dilution for immunofluorescence.
Albumin bovine fraction V Standard grade, lyophilized	Serva	11930.04	Filter (0.45 µm) BSA solutions used for immunofluorescence.
Corning Cell Strainers 70 µm	Corning	431751	White color
Collagenase A from Clostridium histolyticum	Roche	10103586001
DAPI mountant ProLong Gold Antifade	Life technologies	P-36931
D-glucose	Sigma	G8644	100 g/L
Dulbecco´s PBS without Ca2+/Mg2+	Gibco	14190-094
DNase I	Roche	10104159001
Electron microscope	Zeiss	EM 109S
Fluorescence microscope	Zeiss	Axioplan 2
Hyaluronidase from bovine testis	Sigma	H3506
Inverted light microscope	Olympus	CKX41	Routine cell culture microscope
Mouse IgG / IgM (H+L) polyclonal secondary Antibody	Life technologies	A-10684	Alexa Fluor 488 conjugate
Oil Red O	Sigma	O0625	Has replaced Sudan III and Sudan IV because of brighter color.
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
Penicillin (5,000 U/ml)/ Streptomycin (5,000 µg/ml)	Gibco	15070-063	100x solution
RPMI-1640	Gibco	21875-034	Contains 300 mg/L L-glutamine
Trypsin from porcine pancreas	Sigma	T5266
Trypan Blue Stain (0.4%)	Gibco	15250-061
Trypsin inhibitor from soybean	Sigma	T6522	The Sigma product is considerably cheaper than the previously used BPTI (Aprotinin) from Roche.
Vimentin antibody (V9)	Sigma	V6630	Monoclonal mouse anti pig vimentin antibody.  Use 1:100 dilution for immunofluorescence.
Wistar WU rats	Charles River		Should be 19 days old on day of experiment.